Name: assays for validating histone acetyltransferase inhibitors
Uploaded: 2020-08-06T15:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assays for Validating Histone Acetyltransferase Inhibitors at JoVE.com

Este trabalho foi apoiado por subsídios do Programa de Pesquisa Biomédica James e Esther King (6JK03 e 20K07), e do Bankhead-Coley Cancer Research Program (4BF02 e 6BC03), Florida Department of Health, Florida Breast Cancer Foundation e UF Health Cancer Center. Além disso, gostaríamos de agradecer ao Dr. Zachary Osking e à Dra.

1. Ensaio in vitro HAT
<ol><li>Preparação de buffer NOTA: Consulte a Tabela 1 para obter receitas de tampão.<ol>
<li>Prepare 5x tampão de ensaio e 6x Sulfato de Dodecyl de Sódio (SDS) e armazene a -20 °C. Aliquot SDS em alíquotas de 1 mL.</li>
		<li>Prepare o tampão de corrida de gel SDS 10x e 10x TBST e armazene à temperatura ambiente.</li>
		<li>Prepare 1x tampão de transferência e armazene a 4 °C. ATENÇÃO: Verifique a ficha técnica de segurança de todos os pro...

Acetiltransferases de lysina (KATs) acetilamam vários resíduos de lisesina nas caudas de histona e fatores de transcrição para regular a transcrição genética2,3. O trabalho nas últimas duas décadas revelou que os KATs, como CBP/p300, PCAF e GCN5, interagem com fatores de transcrição oncogênica e ajudam a impulsionar o crescimento do tumor em vários tipos de tumores sólidos4,5,,<su...

As acetiltransferases de lysina (KATs) catalisam a acetilação de resíduos de lisesina nas proteínas histona e não histona1,,2,,3,,4. Pesquisas recentes revelam que os KATs e sua função acetiltransferase podem promover o crescimento sólido do tumor4,5,6,7,8,9. Por exemplo, a proteína de ligação CREB (CBP)/p300 são dois KATs paralogos que regulam inúmeras vias de sinalização no câncer2,,3. CBP/p300 tem uma função de acetiltransferase de histona bem caracterizada (HAT) e catalisa histone 3 Lysine 27 acetilação (H3K27ac)2,,4,,5,10,,11, um marcador importante para melhoradores ativos, regiões promotoras e transcrição genética ativa12,,13,,14. CBP/p300 servem como co-ativadores críticos para vias de sinalização pró-crescimento em tumores sólidos, ativando a transcrição de oncogenes através da acetilação de histones e outros fatores de transcrição4,,9,,15,,16,,17,18. Devido ao seu papel na progressão do tumor, CBP/p300 e outros KATs estão sob investigação para o desenvolvimento de novos inibidores que bloqueiam sua função oncogênica4,,5,6,,7,,8,,9,,18,,19,20. A-485 e GNE-049 representam duas tentativas bem sucedidas de desenvolver inibidores potentes e específicos para CBP/p3004,9. Inibidores adicionais estão atualmente sob investigação para CBP/p300 e outros KATs.
A qualidade dos inibidores kat previamente descritos (KATi) está sendo questionada, com muitos inibidores mostrando efeitos-alvo e má caracterização21. Portanto, a caracterização rigorosa e validação de novos candidatos a medicamentos é essencial para o desenvolvimento de sondas químicas de alta qualidade. Delineados aqui estão três protocolos que formam um pipeline para triagem e validando rigorosamente a potência e especificidade do novo KATi, com foco específico em inibir a função HAT (HATi) de KATs. CBP/p300 e seus inibidores são usados como exemplos, mas esses protocolos podem ser adaptados para outros KATs que possuem uma função HAT7.
O primeiro protocolo é um ensaio in vitro de acetiltransferase de histona (HAT) que utiliza p300 recombinantes purificados e histones em uma reação controlada do tubo de ensaio. Este ensaio é simples de executar, é econômico, pode ser usado para tela compostos em uma configuração de baixo rendimento, e não requer materiais radioativos. Neste protocolo, p300 recombinante catalisa acetilação de lise em caudas de histona durante um breve período de incubação e os níveis de acetilação de histona são medidos usando procedimentos padrão de imunoblotação. A reação enzimática pode ser realizada na presença ou ausência de inibidores CBP/p300 para testar compostos que reduzem a acetilação de histona. Além disso, o ensaio HAT pode ser usado para verificar se novos compostos são seletivos para CBP/p300, avaliando sua atividade contra outros KATs purificados, como o PCAF. O ensaio hat é um excelente ponto de partida para investigar novos inibidores devido à sua simplicidade, baixo custo e capacidade de determinar a potência/seletividade de um inibidor. De fato, este protocolo é frequentemente usado na literatura como uma tela in vitro5,10. No entanto, os inibidores identificados no ensaio hat nem sempre são eficazes na cultura celular porque uma reação do tubo de ensaio é muito mais simples do que um sistema celular vivo. Portanto, é essencial caracterizar ainda mais os inibidores nos experimentos de cultura celular22,23.
O segundo protocolo no pipeline é o ensaio de inibição de hiperacetilação de Chromatina (ChHAI). Este ensaio baseado em célula utiliza inibidores de histona deacetilase (HDACi) como uma ferramenta para hiperacetilar histones em cromatina antes da co-incubação com um HATi24. A acetilação de histona basal pode ser baixa na cultura celular, dificultando a sondagem para via imunoblotação sem a adição de um HDACi para aumentar a acetilação. O objetivo do ensaio chhai é identificar o novo HATi que pode atenuar o aumento da acetilação de histona causada pela inibição do HDAC. As vantagens deste ensaio incluem seu baixo custo, relativa facilidade de execução, e o uso de células na cultura, o que proporciona mais relevância fisiológica do que o ensaio hat do tubo de ensaio. Semelhante ao ensaio hat, este protocolo usa imunoblotting padrão para coleta de dados.
Os ensaios HAT e ChHAI fornecem dados sobre a potência de novos compostos para inibir a acetilação global de histona, mas não fornecem informações sobre como esses compostos afetam modificações em regiões genômicas específicas. Portanto, o protocolo final, Chromatin Immunoprecipitation-quantitative Polymerase Chain Reaction (ChIP-qPCR) é um experimento de cultura celular que investiga interações DNA-proteína em regiões específicas do genoma. No protocolo ChIP, a cromatina é interligada para preservar as interações DNA-proteína. A cromatina é então extraída das células e o complexo DNA-proteína sofre imunoprecipitação seletiva para a proteína de interesse (por exemplo, usando um anticorpo específico para H3K27ac). O DNA é então purificado e analisado usando qPCR. Por exemplo, o ChIP-qPCR pode ser usado para determinar se um novo HATi diminui a acetilação de histona em oncogenes individuais, como Cyclin D125. Embora o ChIP-qPCR seja uma técnica comum usada no campo, pode ser difícil otimizar4,,10,26. Este protocolo fornece dicas para evitar possíveis armadilhas que podem ocorrer durante a realização do procedimento ChIP-qPCR e inclui verificações de controle de qualidade que devem ser realizadas nos dados.
Quando utilizados em conjunto, esses três protocolos permitem a caracterização rigorosa e validação do novo HATi. Além disso, esses métodos oferecem muitas vantagens porque são fáceis de executar, relativamente baratos e fornecem dados sobre acetilação de histona global e regional.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 ml tube</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td>For all methods</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm dish</td>
			<td>Sarstedt AG &#38; Co.</td>
			<td>83.3902</td>
			<td>For cell culture of MCF-7 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 ul tips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-707-454</td>
			<td>For all Methods</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 ul tips</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4846</td>
			<td>For all Methods</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X Glycine buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Method 3. See Table 1 for recipe.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X Running Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Methods 1 and 2. See Table 1 for recipe.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X TBST</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Methods 1 and 2. See Table 1 for recipe.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3513</td>
			<td>For Method 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 cm dish</td>
			<td>Sarstedt AG &#38; Co.</td>
			<td>83.3903</td>
			<td>For Method 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml conical tube</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-200249</td>
			<td>For Methods 2 and 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X TBST with 5% milk and 0.02% Sodium Azide</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Methods 1 and 2. Can be used to dilute primary antibodies that will be used more than once. Allows for short-term storage of primary antibody dilutions. Do not use for secondary antibody diluton. CAUTION: Sodium Azide is toxic.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X TBST with 5% milk</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Methods 1 and 2. Used to block PVDF membrane and for antibody diltions. See Table 1 for recipe.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 ul tips</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4844</td>
			<td>For all Methods</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3148</td>
			<td>for SDS sample buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-20% polyacrylamide gel</td>
			<td>Thermo Fisher: Invitrogen</td>
			<td>XP04205BOX</td>
			<td>For Methods 1 and 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5X Assay buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Method 1. See Table 1 for recipe.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5X Passive lysis buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Method 2. See Table 1 for recipe.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6X Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Methods 1 and 2. See Table 1 for recipe.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A-485</td>
			<td>MedChemExpress</td>
			<td>HY-107455</td>
			<td>CBP/p300 Inhbitor for use in Methods 2 and 3. Dissolved in DMSO.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetyl-CBP(K1535)/p300(K1499) antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>4771</td>
			<td>For Method 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetyl-CoA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2056</td>
			<td>for use in Method 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetyl-Histone H3 (Lys 27) antibody (H3K27ac)</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>CST 8173</td>
			<td>antoibodies for H3K27ac for immunoblots and ChIP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetyl-Histone H3 (Lys18) antibody (H3K18ac)</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>CST 9675</td>
			<td>antoibodies for H3K18ac for immunoblots and ChIP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>alpha tubulin antibody</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>T5168</td>
			<td>For Method 2. Dilute 1:20,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anacardic acid</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td>13144</td>
			<td>For Method 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse IgG HRP linked secondary antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>7076</td>
			<td>For Methods 1 and 2. Dilute 1:10,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-rabbit IgG secondary antibody</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>711-035-152</td>
			<td>For Methods 1 and 2. Dilute 1:10,000 to 1:20,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoradiography film</td>
			<td>MIDSCI</td>
			<td>BX810</td>
			<td>For Methods 1 and 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Belly Dancer Rotating Platform</td>
			<td>Stovall Life Science Incorporated</td>
			<td>not available</td>
			<td>For Methods 1 and 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Calf Serum (BCS)</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30072.03</td>
			<td>cell culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2153</td>
			<td>for buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol Blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B0126</td>
			<td>for SDS sample buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CDTA</td>
			<td>Spectrum Chemical</td>
			<td>125572-95-4</td>
			<td>For buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cell scraper</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>CLS3010</td>
			<td>For Method 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChIP dilution buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Method 3. See Table 1 for recipe.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChIP Elution Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Method 3. See Table 1 for recipe.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete DMEM for MCF-7 Cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Methods 2 and 3. See Table 1 for recipe.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Covaris 130 &#181;l microTUBE</td>
			<td>Covaris</td>
			<td>520045</td>
			<td>Sonication tube for use with Covaris S220 in Method 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Covaris S220 Focused-ultrasonicator</td>
			<td>Covaris</td>
			<td>S220</td>
			<td>DNA sonicator for use in Method 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>41639</td>
			<td>for drug dilution and vehicle control treatment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>43815</td>
			<td>for SDS sample buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-013-CV</td>
			<td>cell culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP120-1</td>
			<td>for buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Example transfer tank and transfer apparatus</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>1704070</td>
			<td>For Methods 1 and 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EZ-Magna ChIP A/G Chromatin Immunoprecipitation Kit</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>17-10086</td>
			<td>For Method 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FK228 (Romidepsin)</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td>128517-07-7</td>
			<td>HDAC Inhibitor for use in Method 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F8775</td>
			<td>for cell fixation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glycerol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP229-1</td>
			<td>For buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glycine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7126</td>
			<td>for buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>54457</td>
			<td>for buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High salt wash buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Method 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IGEPAL (NP-40)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I3021</td>
			<td>for buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilon Chemiluminescent HRP Substrate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>WBKLS0500</td>
			<td>For Methods 1 and 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP366-500</td>
			<td>for buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LiCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L9650</td>
			<td>For buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LiCl wash buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Method 3. See Table 1 for recipe.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low salt wash buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Method 3. See Table 1 for recipe.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic Separator</td>
			<td>Promega</td>
			<td>Z5341</td>
			<td>For use in Method 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>494437</td>
			<td>For buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini gel tank</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A25977</td>
			<td>For Methods 1 and 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS-275 (Entinostat)</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td>209783-80-2</td>
			<td>HDAC Inhibitor for use in Method 2. Dissolved in DMSO.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>7647-14-5</td>
			<td>for buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S318-100</td>
			<td>for buffer preparation in Methods 1 and 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Rabbit IgG</td>
			<td>Bethyl Laboratories</td>
			<td>P120-101</td>
			<td>Control rabbit antibody for use in Method 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclei swelling buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Method 3. See Table 1 for recipe.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR Cleanup Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28104</td>
			<td>For use in Method 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin 100X</td>
			<td>Corning</td>
			<td>30-002-CI</td>
			<td>cell culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td>For Methods 2 and 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>80635</td>
			<td>for buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>powdered milk</td>
			<td>Nestle Carnation</td>
			<td></td>
			<td>For Methods 1 and 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power Pac 200 for western blot transfer</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td></td>
			<td>For Methods 1 and 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power Pac 3000 for SDS gel running</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td></td>
			<td>For Methods 1 and 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prestained Protein Ladder</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>26616</td>
			<td>For Methods 1 and 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>PI8340</td>
			<td>for use in Method 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein A Magentic Beads</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>S1425S</td>
			<td>For use in Method 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>P8107S</td>
			<td>For use in Method 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTC-100 Programmable Thermal Controller</td>
			<td>MJ Research Inc.</td>
			<td>PTC-100</td>
			<td>For Method 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF Transfer Membrane</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>IEVH00005</td>
			<td>For Methods 1 and 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant H3.1</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>M2503S</td>
			<td>for use in Method 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant p300</td>
			<td>ENZO Life Sciences</td>
			<td>BML-SE451-0100</td>
			<td>for use in Method 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SAHA (Vorinostat)</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td>149647-78-9</td>
			<td>HDAC Inhibitor for use in Method 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS lysis buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Method 3. See Table 1 for recipe.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>26628-22-8</td>
			<td>For Methods 1 and 2. CAUTION: Sodium Azide is toxic. See SDS for proper handling.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S233-500</td>
			<td>for buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D6750</td>
			<td>for buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71725</td>
			<td>for SDS sample buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard Heatblock</td>
			<td>VWR Scientific Products</td>
			<td>MPN: 949030</td>
			<td>For Methods 1 and 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Table top centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5417R</td>
			<td>For all methods</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TE buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Method 3. See Table 1 for recipe.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Methods 1 and 2. See Table 1 for recipe.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichostatin A</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td>58880-19-6</td>
			<td>HDAC Inhibitor for use in Method 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP152-5</td>
			<td>for buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td>for buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9005-64-5</td>
			<td>for buffer preparation in Methods 1 and 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-ray film processor</td>
			<td>Konica Minolta Medical &#38; Graphic, Inc.</td>
			<td>SRX-101A</td>
			<td>For Methods 1 and 2</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assays for validating histone acetyltransferase inhibitors

Acetiltransferases de lysina (KATs) catalisam acetilação de resíduos de lisesina em histones e outras proteínas para regular a dinâmica da cromatina e a expressão genética. Os TRTs, como o CBP/p300, estão sob intensa investigação como alvos terapêuticos devido ao seu papel crítico na tumorgênese de diversos cânceres. O desenvolvimento de novos inibidores de moléculas pequenas visando a função histone acetyltransferase (HAT) dos KATs é desafiador e requer ensaios robustos que podem validar a especificidade e potência dos inibidores potenciais.
Este artigo descreve um pipeline de três métodos que fornecem rigorosa validação in vitro para novos inibidores de HAT (HATi). Estes métodos incluem um ensaio hat do tubo de ensaio, ensaio de inibição de hiperacetilação de Chromatina (ChHAI) e PCR quantitativo de imunoprecipitação de Chromatina (ChIP-qPCR). No ensaio hat, hats recombinantes são incubados com histones em uma reação de tubo de ensaio, permitindo acetilação de resíduos específicos de lisesina nas caudas de histona. Esta reação pode ser bloqueada por um HATi e os níveis relativos de acetilação de histona específica do local podem ser medidos através de imunoblotação. Os inibidores identificados no ensaio hat precisam ser confirmados no ambiente celular.
O ensaio chhai usa imunoblotting para tela para o novo HATi que atenua a robusta hiperacetilação de histones induzidos por um inibidor de histon deacetilase (HDACi). A adição de um HDACi é útil porque os níveis basais de acetilação de histona podem ser difíceis de detectar através da imunoblotação.
Os ensaios HAT e ChHAI medem as mudanças globais na acetilação de histona, mas não fornecem informações sobre acetilação em regiões genômicas específicas. Portanto, o ChIP-qPCR é usado para investigar os efeitos do HATi nos níveis de acetilação de histona em elementos regulatórios genéticos. Isso é realizado através da imunoprecipitação seletiva de complexos histono-DNA e análise do DNA purificado através de qPCR. Juntos, esses três ensaios permitem a validação cuidadosa da especificidade, potência e mecanismo de ação da nova HATi.

O ensaio in vitro histone acetyltransferase (HAT) pode ser usado para sondar compostos que inibem a atividade p300 HAT em direção a um substrato de histona. A Figura 1A fornece um esquema experimental para o ensaio hat. O ácido anacácárico, um conhecido HATi3,38, foi utilizado neste ensaio em uma faixa de concentração de 12,5-100 μM. A 100 μM, o ácido anacárico diminui a p300 catalisada acetilação histona em Histone 3, L...

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Assays for Validating Histone Acetyltransferase Inhibitors

Inibidores de acetiltransferases de histona (HATs, também conhecidos como acetiltransferases de lisina), como CBP/p300, são potenciais terapêuticos para o tratamento do câncer. No entanto, são necessários métodos rigorosos para validar esses inibidores. Três métodos in vitro para validação incluem ensaios HAT com acetiltransferases recombinantes, imunoblotting para acetilação de histona na cultura celular, e ChIP-qPCR.

Ensaios para validação de inibidores de acetiltransferase histone

Lysine acetyltransferases (KATs) catalyze acetylation of lysine residues on histones and other proteins to regulate chromatin dynamics and gene ...

Esses protocolos são significativos porque fornecem etapas detalhadas para validação da potência e seletividade de novos inibidores do HAT, que são importantes ferramentas de pesquisa e potenciais terapêuticas. As técnicas demonstradas neste vídeo são fáceis de executar e fornecem informações sobre os efeitos dos inibidores do HAT na acetilação histona global e regional. Eles tornam possível entender a regulação epigenética da expressão genética.Atenção aos detalhes é fundamental. É importante seguir os protocolos passo a passo. Comece preparando a reação enzimática em um volume de 10 microliter dentro de um tubo PCR de 0,2 mililitro de acordo com as instruções do manuscrito.Em seguida, incubar a mistura de reação completa a 30 graus Celsius durante uma hora em um ciclor térmico PCR. Enquanto isso, adicione dois mercaptoetanol em uma proporção de um a 10 para o buffer de amostra SDS 6X. Remova amostras do ciclor térmico PCR e adicione dois microliters do buffer de amostra SDS preparado a cada mix de reação.Aqueça as amostras a 95 graus Celsius por cinco minutos em um bloco de calor, depois esfrie-as no gelo. Armazene as amostras a menos 20 ou menos 80 graus Celsius ou proceda com eletroforese gel e imunoblotting. Sementes 100.000 células MCF-7 em um mililitro de cultura celular média em cada poço de uma placa de 12 poços e permitem que as células cresçam de 80 a 90% de confluência.Quando as células atingem a confluência desejada, aspirar o meio de cultura celular dos poços quatro, cinco e seis, e pipeta um mililitro de três ms275 micromolar em média em cada poço. Em seguida, aspire o meio de cultura celular dos poços um, dois e três, e pipeta um mililitro de DMSO diluído em cada poço. Devolva as células à incubadora por quatro horas para permitir o acúmulo de histonas acetiladas em células expostas ao MS275.Enquanto as células estão incubando, prepare diluições de A-485 em DMSO de acordo com as instruções do manuscrito. Quando a incubação estiver concluída, aspire o meio dos poços e adicione as diluições. Devolva as células à incubadora e as cultue por 20 horas, depois aspire o meio de cultura celular dos poços e lave as células com um mililitro de PBS.Aspire o PBS e adicione 100 microliters de tampão de lise passiva. Armazene a placa a menos 80 graus Celsius durante a noite. Pipeta 100 microliters de cromatina sônica de células tratadas com DMSO em dois tubos de 1,5 mililitros, em seguida, pipeta 400 microliters de tampão de diluição ChIP para cada tubo para trazer o volume total até 500 microliters.Remova cinco microliters da solução de um dos tubos e armazene-a a menos 20 graus Celsius como entrada DMSO. Prepare dois tubos com cromatina sônica de células tratadas com A-485 da mesma forma. Use uma pipeta para adicionar os anticorpos de acetil IgG e H3K27 às amostras de DMSO e A-485.Em seguida, adicione 20 microliters de proteína A contas magnéticas a cada tubo, certificando-se de que as contas estão bem resuspended. Gire as amostras durante a noite a quatro graus Celsius. Pellte a proteína Uma conta magnética usando um separador magnético e remova o supernatante sem perturbar as contas.Lave as contas com 500 microliters a um mililitro de tampão de lavagem de sal baixo e gire-as por cinco minutos a quatro graus Celsius. Faça um giro rápido para baixo, pelota as contas com um separador magnético e remova o supernatante. Repita o procedimento de lavagem com tampão de lavagem de sal alto, tampão de lavagem de cloreto de lítio e tampão de TE.Após a lavagem com tampão de TE, retire as amostras de entrada do congelador e coloque-as no gelo. Descongele uma alíquota de proteinase K, em seguida, pelota as contas usando um separador magnético e remova o tampão TE das contas. Adicione 100 microliters de tampão de elução ChIP e um microliter de proteinase K a cada amostra, incluindo as amostras de entrada e incuba-los com agitação a 62 graus Celsius por duas horas usando um termociclador.Após a incubação, aqueça as amostras a 95 graus Celsius por 10 minutos e esfrie-as à temperatura ambiente. Pellule as contas magnéticas com um separador magnético e transfira o supernante contendo DNA para um novo tubo de 1,5 mililitro. Purifique o DNA usando um kit de limpeza PCR padrão e execute qPCR.O ensaio de acetiltransferase de histona in vitro foi usado para investigar o efeito do ácido anacárico na atividade p300 HAT em direção a um substrato de histona. Um intervalo de concentração foi testado e acetil-CoA não foi adicionado à reação de controle negativo. Os resultados do imunoblot foram quantificados com ImageJ, mostrando uma clara redução no acetil H3K18 e acetil H3K9 em 100 ácido anacáclico micromolar em comparação com o controle DMSO.No ensaio de inibição da hiper acetilação da cromatina, o tratamento de células MCF-7 com HDACi MS275 fortemente regulada acetilação de histone 3 em vários resíduos de liseina. Os níveis basais de acetil H3K18 e acetil H3K27 foram baixos, mostrando os benefícios de adicionar um HDACi no ensaio ChHAI. A adição de A-485 em células pré-tratadas com MS275 atenua o aumento da acetilação histona em H3K18 e H3K27, mas não H3K9.Os resultados do imunoblot também foram quantificados com ImageJ. O chIP qPCR foi usado para investigar os efeitos dos inibidores do HAT em elementos de regulação genética que controlam a expressão oncogene. Na amostra DMSO, o DNA precipitado pelo anticorpo de controle IgG produziu um valor ct maior do que o anticorpo acetil H3K27 na reação qPCR para o promotor cyclin D1, indicando que o controle IgG não específico precipitou menos complexos de histona de DNA do que o anticorpo específico acetil H3K27 no promotor.Comparado com o controle DMSO, o A-485 reduziu o enriquecimento do acetil H3K27 no promotor cyclin D1. É importante ressaltar que o A-485 é conhecido por reduzir significativamente o acetil H3K27 na cultura celular. Ao tentar este protocolo, tenha em mente que os passos de pré-incubação dos ensaios in vitro HAT e ChHAI são essenciais e não devem ser esquecidos.Também é importante lembrar de salvar as amostras de entrada e evitar a perda das contas durante o ChIP. Após a realização desses procedimentos, o ChIP-seq é um método adicional que pode ser executado para obter informações globais sobre acetilação de histona em elementos regulatórios para todo o genoma. Esses protocolos são úteis para os cientistas validarem cuidadosamente novos inibidores do HAT e evitar a publicação de sondas químicas de baixa qualidade na literatura.Os inibidores de HAT validados podem ser submetidos a um desenvolvimento adicional como potenciais terapêuticos.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Coculture Assays to Study Macrophage and Microglia Stimulation of Glioblastoma Invasion

Co-cultura Ensaios para estudar macrófagos e Microglia Estimulação do Glioblastoma Invasion

Glioblastoma multiforme (grade IV glioma) is a very aggressive human cancer with a median survival of 1 year post diagnosis. Despite the increased ...

Pesquisa do câncer

Preclinical Assessment of the Bioactivity of the Anticancer Coumarin OT48 by Spheroids, Colony Formation Assays, and Zebrafish Xenografts

Avaliação pré-clínica da Bioatividade da OT48 de cumarina Anticancer esferoides, ensaios de formação de colônia e Xenografts Zebrafish

In vitro and in vivo pre-clinical screening of novel therapeutic agents are an essential tool in cancer drug discovery. Although human cancer cell lines ...

Assessment of Resistance to Tyrosine Kinase Inhibitors by an Interrogation of Signal Transduction Pathways by Antibody Arrays

Avaliação da resistência aos inibidores de tirosina quinase por um interrogatório das vias de transdução de sinal por matrizes de anticorpo

Cancer patients with an aberrant regulation of the protein phosphorylation networks are often treated with the tyrosine kinase inhibitors. Response rates ...

Live-Cell Imaging Assays to Study Glioblastoma Brain Tumor Stem Cell Migration and Invasion

Imagem latente da viver-pilha ensaios de migração de células-tronco do estudo Glioblastoma cerebral Tumor e invasão

Glioblastoma (GBM) is an aggressive brain tumor that is poorly controlled with the currently available treatment options. Key features of GBMs include ...

Investigation of Genetic Dependencies Using CRISPR-Cas9-based Competition Assays

Investigação de dependências genéticas utilizando ensaios de competição baseados em CRISPR-Cas9

Gene perturbation studies have been extensively used to investigate the role of individual genes in AML pathogenesis. For achieving complete gene ...

Yeast As a Chassis for Developing Functional Assays to Study Human P53

Fermento como um chassi para desenvolver ensaios funcionais para estudar p53 humano

The finding that the well-known mammalian P53 protein can act as a transcription factor (TF) in the yeast S. cerevisiae has allowed for the development of ...

Characterization of the Effects of Migrastatic Inhibitors on 3D Tumor Spheroid Invasion by High-resolution Confocal Microscopy

Caracterização dos efeitos de inibidores de Migrastatic na invasão do spheroid do tumor 3D pela microscopia confocal de alta resolução

Drug discovery and development in cancer research is increasingly being based on drug screens in a 3D format. Novel inhibitors targeting the migratory and ...

Combined Use of Tail Vein Metastasis Assays and Real-Time In Vivo Imaging to Quantify Breast Cancer Metastatic Colonization and Burden in the Lungs

Uso combinado de ensaios de metástase de veia de cauda e imagens in vivo em tempo real para quantificar a colonização metastática do câncer de mama e carga nos pulmões

Metastasis is the main cause of cancer-related deaths and there are limited therapeutic options for patients with metastatic disease. The identification ...

Assessing Cellular Target Engagement by SHP2 (PTPN11) Phosphatase Inhibitors

Assessing Cellular Target Engagement by SHP2 PTPN11 Phosphatase Inhibitors

Avaliando o engajamento de alvos celulares por inibidores de fosfattase de PHOsphatase

The Src-homology 2 (SH2) domain-containing phosphatase 2 (SHP2), encoded by the PTPN11 proto-oncogene, is a key mediator of receptor tyrosine kinase ...

Identification of EGFR and RAS Inhibitors using Caenorhabditis elegans

Identification of EGFR and RAS Inhibitors using Caenorhabditis elegans

Identificação de Inibidores EGFR e RAS utilizando elegans caenorhabditis

The changes in the plasma membrane localization of the epidermal growth factor receptor (EGFR) and its downstream effector RAS have been implicated in ...