Name: assays for validating histone acetyltransferase inhibitors
Uploaded: 2020-08-06T15:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assays for Validating Histone Acetyltransferase Inhibitors at JoVE.com

Эта работа была поддержана гранты от Джеймса и Эстер Кинг биомедицинских исследований программы (6JK03 и 20K07), и Бэнкхед-Коли онкологических исследований программы (4BF02 и 6BC03), Флорида Департамент здравоохранения, Флорида рака молочной железы Фонда, и UF health Cancer Center. Кроме того, мы хотели бы поблагодарить д-ра Закари Осинкинга и д-ра Андреа Лин за их поддержку в процессе публикации.

1. Анализ IN vitro HAT
<ol><li>Буферная подготовка ПРИМЕЧАНИЕ: Смотрите таблицу 1 для буферных рецептов.<ol>
<li>Подготовь 5x анализ буфера и 6x додекил сульфат натрия (SDS) и хранить при -20 градусов по Цельсию. Aliquot SDS в 1 mL aliquots.</li>
		<li>Подготовка 10x SDS гель работает буфер и 10x TBST и хранит?...

Лизин ацетилтрансферазы (KATs) ацетилат несколько остатков лизина на хвостах гистона и транскрипции факторовдля регулирования транскрипции генов 2,3. Работа в последние два десятилетия показала, что KATs, такие как CBP/p300, PCAF и GCN5, взаимодействуют с онкогенными...

Лизин ацетилтрансферазы (KATs) катализует ацетилирование остатков лизина как на гистоне, так и на неистоновыхбелках 1,,2,,3,,4. Недавние исследования показывают, что KATs и их функции ацетилтрансферазы может способствоватьтвердому росту опухоли 4,,5,,6,,7,,8,,9. Например, CREB-связывающий белок (CBP)/p300 являются двумя паралогичными КАТ, которые регулируют многочисленные сигнальныепути при раке 2,,3. CBP/p300 имеют хорошо охарактеризованные гистон ацетилтрансферазы (HAT) функции и катализ Гистон 3 Лизин 27 ацетилляции (H3K27ac)2,4,5,10,11, важным маркером для активных усилителей, промоутер регионов и активной транскрипции генов12,13,14. CBP/p300 служить в качестве критических соактиваторов для про-рост сигнализации путей в твердых опухолей путем активации транскрипции онкогенов через ацетилирование гистонов и других факторов транскрипции4,9,15,16,17,18. В связи с их ролью в прогрессировании опухоли, CBP/p300 и другие KATs находятся под следствием для разработки новых ингибиторов, которые блокируют их онкогенную функцию4,,5,,6,,7,,8,,9,,18,,19,,20. A-485 и GNE-049 представляют собой две успешные попытки разработать мощные и специфические ингибиторы для CBP/p3004,9. В настоящее время проводятся дополнительные исследования в отношении CBP/p300 и других KATs.
Качество ранее описанных ингибиторов KAT (KATi) в настоящее время под вопросом, со многими ингибиторами демонстрируя целевые эффекты и плохой характеристикой21. Поэтому строгая характеристика и проверка новых кандидатов на наркотики имеет важное значение для разработки высококачественных химических зондов. Здесь изложены три протокола, которые образуют конвейер для скрининга и тщательной проверки потенции и специфичности новых KATi, с конкретным акцентом на ингибирование функции HAT (HATi) KATs. CBP/p300 и их ингибиторы используются в качестве примеров, но эти протоколы могут быть адаптированы для других KATs, которые имеют функцию HAT7.
Первый протокол является in vitro гистон ацетилтрансферазы (HAT) анализ, который использует очищенные рекомбинантные p300 и гистоны в контролируемой реакции пробирки. Этот анализ прост в работе, является экономически эффективным, может быть использован для проверки соединений в условиях низкой пропускной способности, и не требует радиоактивных материалов. В этом протоколе рекомбинантный p300 катализин ацетилирования лизина на хвостах гистона в течение короткого инкубационный период и уровни ацетилирования гистона измеряются с помощью стандартных иммуноблоттинговых процедур. Ферментативная реакция может быть выполнена при наличии или отсутствии ингибиторов CBP/p300 для проверки на наличие соединений, которые уменьшают ацетилирование гистона. Кроме того, анализ HAT может быть использован для проверки того, являются ли новые соединения селективными для CBP/p300, оценивая их активность по отношению к другим очищенным KATs, таким как PCAF. Анализ HAT является отличной отправной точкой для изучения новых ингибиторов из-за его простоты, низкой стоимости и способности определять потенцию/селективность ингибитора. Действительно, этот протокол часто используется в литературе в качестве экрана in vitro5,10. Тем не менее, ингибиторы, выявленные в анализе HAT, не всегда эффективны в клеточной культуре, потому что реакция пробирки намного проще, чем живая клеточная система. Поэтому необходимо дополнительно охарактеризовать ингибиторы в экспериментах клеточной культуры22,,23.
Вторым протоколом в трубопроводе является анализ ингибирования гиперацетилирования хроматина (CHHAI). Эта клетка на основе анализа использует ингибиторы диацетилазы гистона (HDACi) в качестве инструмента для гиперацетилата гистонов в хроматине до совместного инкубации с HATi24. Базальный гистон ацетилляции может быть низким в клеточной культуре, что делает его трудно зондировать с помощью иммуноблотинга без добавления HDACi для увеличения ацетилирования. Цель анализа ChHAI заключается в выявлении новых HATi, которые могут затухать увеличение ацетилирования гистон, вызванного ингибированием HDAC. Преимущества этого анализа включают его низкую стоимость, относительную легкость для выполнения, и использование клеток в культуре, которая обеспечивает более физиологическую актуальность, чем пробирка HAT анализа. Как и в hat-анализе, в этом протоколе используется стандартный иммуноблоттинг для сбора данных.
Анализы HAT и ChHAI предоставляют данные о потенции новых соединений для ингибирования глобального ацетилирования гистонов, но не дают представления о том, как эти соединения влияют на модификации в конкретных геномных регионах. Таким образом, окончательный протокол, Хроматин иммунопреципиентации количественных полимеразной цепной реакции (ChIP-qPCR) является экспериментом клеточной культуры, который исследует ДНК-белковых взаимодействий в конкретных регионах генома. В протоколе ChIP хроматин пересекается для сохранения ДНК-белковых взаимодействий. Хроматин затем извлекается из клеток, а ДНК-белковый комплекс подвергается селективной иммунопреципитации для белка интереса (например, с использованием антитела, специфичного для H3K27ac). Затем ДНК очищается и анализируется с помощью qPCR. Например, ChIP-qPCR может быть использован для определения того, если роман HATi downregulates гистон ацетилирования на отдельных онкогенов, таких как килин D125. Хотя ChIP-qPCR является общей техникой, используемой в полевых условиях, это можетбыть трудно оптимизировать 4,,10,,26. Этот протокол содержит советы по предотвращению потенциальных ловушек, которые могут возникнуть при выполнении процедуры ChIP-qPCR, и включает проверку качества, которая должна быть выполнена на данных.
При использовании вместе эти три протокола позволяют тщательной характеристики и проверки романа HATi. Кроме того, эти методы предлагают много преимуществ, поскольку они просты в работе, относительно дешевы и предоставляют данные о глобальной, а также региональной ацетилирования гистон.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 ml tube</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td>For all methods</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm dish</td>
			<td>Sarstedt AG &#38; Co.</td>
			<td>83.3902</td>
			<td>For cell culture of MCF-7 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 ul tips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-707-454</td>
			<td>For all Methods</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 ul tips</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4846</td>
			<td>For all Methods</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X Glycine buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Method 3. See Table 1 for recipe.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X Running Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Methods 1 and 2. See Table 1 for recipe.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X TBST</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Methods 1 and 2. See Table 1 for recipe.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3513</td>
			<td>For Method 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 cm dish</td>
			<td>Sarstedt AG &#38; Co.</td>
			<td>83.3903</td>
			<td>For Method 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml conical tube</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-200249</td>
			<td>For Methods 2 and 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X TBST with 5% milk and 0.02% Sodium Azide</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Methods 1 and 2. Can be used to dilute primary antibodies that will be used more than once. Allows for short-term storage of primary antibody dilutions. Do not use for secondary antibody diluton. CAUTION: Sodium Azide is toxic.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X TBST with 5% milk</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Methods 1 and 2. Used to block PVDF membrane and for antibody diltions. See Table 1 for recipe.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 ul tips</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4844</td>
			<td>For all Methods</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3148</td>
			<td>for SDS sample buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-20% polyacrylamide gel</td>
			<td>Thermo Fisher: Invitrogen</td>
			<td>XP04205BOX</td>
			<td>For Methods 1 and 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5X Assay buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Method 1. See Table 1 for recipe.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5X Passive lysis buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Method 2. See Table 1 for recipe.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6X Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Methods 1 and 2. See Table 1 for recipe.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A-485</td>
			<td>MedChemExpress</td>
			<td>HY-107455</td>
			<td>CBP/p300 Inhbitor for use in Methods 2 and 3. Dissolved in DMSO.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetyl-CBP(K1535)/p300(K1499) antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>4771</td>
			<td>For Method 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetyl-CoA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2056</td>
			<td>for use in Method 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetyl-Histone H3 (Lys 27) antibody (H3K27ac)</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>CST 8173</td>
			<td>antoibodies for H3K27ac for immunoblots and ChIP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetyl-Histone H3 (Lys18) antibody (H3K18ac)</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>CST 9675</td>
			<td>antoibodies for H3K18ac for immunoblots and ChIP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>alpha tubulin antibody</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>T5168</td>
			<td>For Method 2. Dilute 1:20,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anacardic acid</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td>13144</td>
			<td>For Method 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse IgG HRP linked secondary antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>7076</td>
			<td>For Methods 1 and 2. Dilute 1:10,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-rabbit IgG secondary antibody</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>711-035-152</td>
			<td>For Methods 1 and 2. Dilute 1:10,000 to 1:20,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoradiography film</td>
			<td>MIDSCI</td>
			<td>BX810</td>
			<td>For Methods 1 and 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Belly Dancer Rotating Platform</td>
			<td>Stovall Life Science Incorporated</td>
			<td>not available</td>
			<td>For Methods 1 and 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Calf Serum (BCS)</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30072.03</td>
			<td>cell culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2153</td>
			<td>for buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol Blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B0126</td>
			<td>for SDS sample buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CDTA</td>
			<td>Spectrum Chemical</td>
			<td>125572-95-4</td>
			<td>For buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cell scraper</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>CLS3010</td>
			<td>For Method 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChIP dilution buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Method 3. See Table 1 for recipe.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChIP Elution Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Method 3. See Table 1 for recipe.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete DMEM for MCF-7 Cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Methods 2 and 3. See Table 1 for recipe.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Covaris 130 &#181;l microTUBE</td>
			<td>Covaris</td>
			<td>520045</td>
			<td>Sonication tube for use with Covaris S220 in Method 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Covaris S220 Focused-ultrasonicator</td>
			<td>Covaris</td>
			<td>S220</td>
			<td>DNA sonicator for use in Method 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>41639</td>
			<td>for drug dilution and vehicle control treatment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>43815</td>
			<td>for SDS sample buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-013-CV</td>
			<td>cell culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP120-1</td>
			<td>for buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Example transfer tank and transfer apparatus</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>1704070</td>
			<td>For Methods 1 and 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EZ-Magna ChIP A/G Chromatin Immunoprecipitation Kit</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>17-10086</td>
			<td>For Method 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FK228 (Romidepsin)</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td>128517-07-7</td>
			<td>HDAC Inhibitor for use in Method 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F8775</td>
			<td>for cell fixation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glycerol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP229-1</td>
			<td>For buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glycine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7126</td>
			<td>for buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>54457</td>
			<td>for buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High salt wash buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Method 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IGEPAL (NP-40)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I3021</td>
			<td>for buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilon Chemiluminescent HRP Substrate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>WBKLS0500</td>
			<td>For Methods 1 and 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP366-500</td>
			<td>for buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LiCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L9650</td>
			<td>For buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LiCl wash buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Method 3. See Table 1 for recipe.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low salt wash buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Method 3. See Table 1 for recipe.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic Separator</td>
			<td>Promega</td>
			<td>Z5341</td>
			<td>For use in Method 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>494437</td>
			<td>For buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini gel tank</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A25977</td>
			<td>For Methods 1 and 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS-275 (Entinostat)</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td>209783-80-2</td>
			<td>HDAC Inhibitor for use in Method 2. Dissolved in DMSO.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>7647-14-5</td>
			<td>for buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S318-100</td>
			<td>for buffer preparation in Methods 1 and 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Rabbit IgG</td>
			<td>Bethyl Laboratories</td>
			<td>P120-101</td>
			<td>Control rabbit antibody for use in Method 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclei swelling buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Method 3. See Table 1 for recipe.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR Cleanup Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28104</td>
			<td>For use in Method 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin 100X</td>
			<td>Corning</td>
			<td>30-002-CI</td>
			<td>cell culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td>For Methods 2 and 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>80635</td>
			<td>for buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>powdered milk</td>
			<td>Nestle Carnation</td>
			<td></td>
			<td>For Methods 1 and 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power Pac 200 for western blot transfer</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td></td>
			<td>For Methods 1 and 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power Pac 3000 for SDS gel running</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td></td>
			<td>For Methods 1 and 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prestained Protein Ladder</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>26616</td>
			<td>For Methods 1 and 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>PI8340</td>
			<td>for use in Method 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein A Magentic Beads</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>S1425S</td>
			<td>For use in Method 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>P8107S</td>
			<td>For use in Method 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTC-100 Programmable Thermal Controller</td>
			<td>MJ Research Inc.</td>
			<td>PTC-100</td>
			<td>For Method 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF Transfer Membrane</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>IEVH00005</td>
			<td>For Methods 1 and 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant H3.1</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>M2503S</td>
			<td>for use in Method 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant p300</td>
			<td>ENZO Life Sciences</td>
			<td>BML-SE451-0100</td>
			<td>for use in Method 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SAHA (Vorinostat)</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td>149647-78-9</td>
			<td>HDAC Inhibitor for use in Method 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS lysis buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Method 3. See Table 1 for recipe.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>26628-22-8</td>
			<td>For Methods 1 and 2. CAUTION: Sodium Azide is toxic. See SDS for proper handling.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S233-500</td>
			<td>for buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D6750</td>
			<td>for buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71725</td>
			<td>for SDS sample buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard Heatblock</td>
			<td>VWR Scientific Products</td>
			<td>MPN: 949030</td>
			<td>For Methods 1 and 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Table top centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5417R</td>
			<td>For all methods</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TE buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Method 3. See Table 1 for recipe.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Methods 1 and 2. See Table 1 for recipe.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichostatin A</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td>58880-19-6</td>
			<td>HDAC Inhibitor for use in Method 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP152-5</td>
			<td>for buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td>for buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9005-64-5</td>
			<td>for buffer preparation in Methods 1 and 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-ray film processor</td>
			<td>Konica Minolta Medical &#38; Graphic, Inc.</td>
			<td>SRX-101A</td>
			<td>For Methods 1 and 2</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assays for validating histone acetyltransferase inhibitors

Лизин ацетилтрансферазы (KATs) катализует ацетилирование остатков лизина на гистонах и других белках для регулирования динамики хроматина и экспрессии генов. KATs, такие как CBP/p300, находятся под интенсивным исследованием в качестве терапевтических целей из-за их критической роли в tumorigenesis различных видов рака. Разработка новых малых молекул ингибиторы ориентации гистона ацетилтрансферазы (HAT) функция KATs является сложной задачей и требует надежных анализов, которые могут проверить специфику и потенцию потенциальных ингибиторов.
В этой статье излагается конвейер из трех методов, которые обеспечивают строгую проверку in vitro для новых ингибиторов HAT (HATi). Эти методы включают в себя пробирку HAT анализ, хроматин гиперацетилирования Ингибирование (ChHAI) анализ, и хроматин иммунопреципиентно-количественный ПЦР (ChIP-qPCR). В HAT анализ, рекомбинантные HATs инкубируются с гистонами в реакции пробирки, что позволяет ацетилирования конкретных остатков лизина на хвостах гистона. Эта реакция может быть заблокирована HATi и относительные уровни сайта конкретных ацетилирования гистон может быть измерена с помощью иммуноблоттинга. Ингибиторы, выявленные в анализе HAT, должны быть подтверждены в клеточной среде.
ChHAI анализ использует иммуноблоттинг для экрана для романа HATi, которые занижают надежные гиперацетилирования гистонов индуцированных ингибитором диацетилазы гистона (HDACi). Добавление HDACi полезно, потому что базальные уровни ацетилирования гистон может быть трудно обнаружить с помощью иммуноблоттинга.
Анализы HAT и ChHAI измеряют глобальные изменения в ацетилляции гистона, но не предоставляют информацию об ацетиляции в конкретных геномных регионах. Таким образом, ChIP-qPCR используется для исследования влияния HATi на уровни ацетилирования гистона в генных регуляторных элементах. Это достигается путем селективной иммунопреципиентации гистон-ДНК комплексов и анализа очищенной ДНК с помощью qPCR. Вместе эти три анализа позволяют тщательно продумать специфику, потенцию и механизм действия романа HATi.

Анализ ацетилтрансферазы in vitro histone (HAT) может быть использован для зондирования соединений, которые подавляют активность p300 HAT в направлении гистонового субстрата. Рисунок 1A предоставляет экспериментальную схему для анализа HAT. Анакардиевая кислота, известный HATi<sup class="x...

Watch this Scientific Journal Video about Assays for Validating Histone Acetyltransferase Inhibitors at JoVE.com

Assays for Validating Histone Acetyltransferase Inhibitors

Ингибиторы ацетилтрансферазы гистона (АТ, также известный как лизин ацетилтрансферазы), такие как CBP/p300, являются потенциальными терапевтическими средствами для лечения рака. Однако необходимы строгие методы проверки этих ингибиторов. Три метода in vitro для проверки включают анализы HAT с рекомбинантными ацетилтрансферазами, иммуноблоттинг для ацетилирования гистона в клеточной культуре и ChIP-qPCR.

Анализы для проверки ингибиторов ацетилтрансферазы гистона

Lysine acetyltransferases (KATs) catalyze acetylation of lysine residues on histones and other proteins to regulate chromatin dynamics and gene ...

Эти протоколы имеют важное значение, поскольку они обеспечивают подробные шаги для проверки потенции и избирательности новых ингибиторов HAT, которые являются важными инструментами исследования и потенциальной терапии. Методы, продемонстрированые в этом видео, просты в работе и предоставляют информацию о влиянии ингибиторов HAT на глобальное и региональное ацетилирование гистон. Они делают возможным понимание эпигенетической регуляции экспрессии генов.Внимание к деталям имеет решающее значение. Важно следовать протоколам шаг за шагом. Начните с подготовки энзиматической реакции в объеме 10 микролитров внутри 0,2 миллилитров ПЦР-трубки в соответствии с рукописными указаниями.Затем инкубировать полную смесь реакции при 30 градусах по Цельсию в течение одного часа в тепловом циклере ПЦР. Между тем, добавьте два меркаптоэтанола в соотношении 1 к 10 к буферу образца 6X SDS. Удалите образцы из теплового цикла ПЦР и добавьте два микролитров подготовленного буфера образца SDS в каждую смесь реакции.Нагрейте образцы до 95 градусов по Цельсию в течение пяти минут на тепловой блок, а затем охладить их на льду. Храните образцы при температуре минус 20 или минус 80 градусов по Цельсию или приступайте к гелевому электрофорезу и иммуноблоттингу. Семя 100 000 клеток MCF-7 в одном миллилитре клеточной культуры среды в каждый колодец 12-хорошо пластины и позволяют клеткам расти до 80 до 90% слияния.Когда клетки достигают желаемого слияния, аспирировать клеточной культуры среды из скважин четыре, пять и шесть, и пипетка один миллилитр из трех микромоляных MS275 в среде в каждой скважине. Затем аспирировать клеточной культуры среды из колодцев один, два и три, и пипетки один миллилитр разбавленной DMSO в каждой скважине. Вернуть клетки в инкубатор в течение четырех часов, чтобы обеспечить накопление ацетилированных гистонов в клетках, подверженных MS275.Пока клетки инкубируются, подготовляй разбавления А-485 в ДМСО в соответствии с рукописными указаниями. Когда инкубация закончена, аспирировать среды из скважин и добавить разбавления. Вернуть клетки в инкубатор и культурировать их в течение 20 часов, а затем аспирировать клеточной культуры среды из колодцев и мыть клетки с одним миллилитром PBS.Аспирировать PBS и добавить 100 микролитров пассивного буфера лиза. Храните тарелку при температуре минус 80 градусов по Цельсию на ночь. Pipette 100 микролитров sonicated хроматина из клеток, обработанных DMSO в две 1,5 миллилитровые трубки, затем пипетки 400 микролитров буфера разбавления ChIP к каждой трубке, чтобы довести общий объем до 500 микролитров.Удалите пять микролитров раствора из одной из трубок и храните его при температуре минус 20 градусов по Цельсию при вводе DMSO. Приготовьте две трубки с звуковым хроматином из клеток, обработанных A-485 таким же образом. Используйте пипетку для добавления ацетил-антител IgG и H3K27 в образцы DMSO и A-485.Затем добавьте 20 микролитров белка магнитных бусин в каждую трубку, убедившись, что бисер хорошо перерасход. Поверните образцы на ночь при четырех градусах по Цельсию. Пеллет белка магнитных бусин с помощью магнитного сепаратора и удалить супернатант, не нарушая бисера.Вымойте шарики с 500 микролитров до одного миллилитра низкой соли мыть буфера и повернуть их в течение пяти минут при четырех градусах по Цельсию. Выполните быстро спина вниз, гранулы бисера с магнитным сепаратором и удалить супернатант. Повторите процедуру мытья с высоким буфером для мытья соли, буфером для мытья хлорида лития и буфером TE.После мытья буфером TE удалите входные образцы из морозильной камеры и положите их на лед. Оттепель aliquot протеиназы K, а затем гранулы бисера с помощью магнитного сепаратора и удалить te буфер из бисера. Добавьте 100 микролитров буфера ChIP elution и один микролитр протеиназы K к каждому образцу, включая входные образцы, и инкубировать их тряской при 62 градусах по Цельсию в течение двух часов с помощью термоциклера.После инкубации нагрейте образцы до 95 градусов по Цельсию в течение 10 минут, затем охладите их до комнатной температуры. Пеллет магнитных бусин с магнитным сепаратором и передачи ДНК-содержащих супернатантов в новую 1,5 миллилитровую трубку. Очистите ДНК с помощью стандартного комплекта очистки ПЦР и запустите qPCR.Анализ ацетилтрансферазы in vitro был использован для исследования влияния анакардиновой кислоты на активность p300 HAT в направлении гистонового субстрата. Был протестирован диапазон концентрации и ацетил-КоА не был добавлен к негативной реакции контроля. Результаты иммуноблот были количественно с ImageJ, показывая явное снижение ацетил H3K18 и ацетил H3K9 на 100 микромоляновой анакардиновой кислоты по сравнению с dmSO контроля.В анализе ингибирования хроматина гиперацетилирования, лечение клеток MCF-7 с HDACi MS275 сильно регулируется ацетилированием гистона 3 на нескольких остатках лизина. Базальные уровни ацетил H3K18 и ацетил H3K27 были низкими, показывая преимущества добавления HDACi в анализе ChHAI. Добавление A-485 в ячейках, предварительно обработав MS275, затухает повышенное ацетилирование гистона на H3K18 и H3K27, но не H3K9.Иммунобло результаты были также количественно с ImageJ. ChIP qPCR был использован для исследования воздействия ингибиторов HAT на элементы регулирования генов, которые контролируют экспрессию онкогена. В образце DMSO, ДНК осаждается антитела контроля IgG производится более высокое значение Ct, чем ацетил H3K27 антитела в qPCR реакции на циклин D1 промоутер, что свидетельствует о том, что неспецифические IgG управления осаждали меньше ДНК гистон комплексов, чем ацетил H3K27 конкретных антител на промоутера.По сравнению с управлением DMSO, A-485 сократил обогащение ацетил H3K27 на промоутере циклина D1. Важно отметить, что A-485, как известно, значительно уменьшить ацетил H3K27 в клеточной культуре. При попытке этого протокола, имейте в виду, что до инкубации шаги in vitro HAT и ChHAI анализы имеют важное значение и не должны быть забыты.Важно также помнить, чтобы сохранить входные образцы и избежать потери бисера во время ChIP. После выполнения этих процедур, ChIP-seq является дополнительным методом, который может быть выполнен, чтобы получить глобальную информацию о ацетилировании гистон на нормативных элементов для всего генома. Эти протоколы полезны для ученых, чтобы тщательно проверить новые ингибиторы HAT и избежать публикации некачественных химических зондов в литературе.Проверенные ингибиторы HAT могут проходить дальнейшее развитие в качестве потенциальной терапии.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Coculture Assays to Study Macrophage and Microglia Stimulation of Glioblastoma Invasion

Сокультивирования Анализы по изучению макрофагами и микроглии стимуляции глиобластомы вторжения

Glioblastoma multiforme (grade IV glioma) is a very aggressive human cancer with a median survival of 1 year post diagnosis. Despite the increased ...

Preclinical Assessment of the Bioactivity of the Anticancer Coumarin OT48 by Spheroids, Colony Formation Assays, and Zebrafish Xenografts

Доклинические оценки отпорности противораковые кумарина OT48 сфероидов, колонии формирования анализов и ксенотрасплантатов данио рерио

In vitro and in vivo pre-clinical screening of novel therapeutic agents are an essential tool in cancer drug discovery. Although human cancer cell lines ...

Assessment of Resistance to Tyrosine Kinase Inhibitors by an Interrogation of Signal Transduction Pathways by Antibody Arrays

Оценка сопротивления ингибитора киназы тирозина путем допроса сигнальных путей, антитела массивы

Cancer patients with an aberrant regulation of the protein phosphorylation networks are often treated with the tyrosine kinase inhibitors. Response rates ...

Live-Cell Imaging Assays to Study Glioblastoma Brain Tumor Stem Cell Migration and Invasion

Assays клеток опухоли стволовых клеток глиобластомы мозга исследования миграции и вторжения

Glioblastoma (GBM) is an aggressive brain tumor that is poorly controlled with the currently available treatment options. Key features of GBMs include ...

Investigation of Genetic Dependencies Using CRISPR-Cas9-based Competition Assays

Исследование генетических зависимостей с помощью анализов на основе ТРИФОСФАТЫ Cas9 конкурс

Gene perturbation studies have been extensively used to investigate the role of individual genes in AML pathogenesis. For achieving complete gene ...

Yeast As a Chassis for Developing Functional Assays to Study Human P53

Дрожжи как шасси для разработки функциональных анализов для изучения человека P53

The finding that the well-known mammalian P53 protein can act as a transcription factor (TF) in the yeast S. cerevisiae has allowed for the development of ...

Characterization of the Effects of Migrastatic Inhibitors on 3D Tumor Spheroid Invasion by High-resolution Confocal Microscopy

Характеристика влияния миграстатических ингибиторов на 3D-вторжение опухолевых сфероидов с помощью конфокальной микроскопии высокого разрешения

Drug discovery and development in cancer research is increasingly being based on drug screens in a 3D format. Novel inhibitors targeting the migratory and ...

Combined Use of Tail Vein Metastasis Assays and Real-Time In Vivo Imaging to Quantify Breast Cancer Metastatic Colonization and Burden in the Lungs

Комбинированное использование хвоста вен ы метастазы анализы и в режиме реального времени в Vivo Imaging для количественной диагностики рака молочной железы метастатическая колонизация и бремя в легких

Metastasis is the main cause of cancer-related deaths and there are limited therapeutic options for patients with metastatic disease. The identification ...

Assessing Cellular Target Engagement by SHP2 (PTPN11) Phosphatase Inhibitors

Assessing Cellular Target Engagement by SHP2 PTPN11 Phosphatase Inhibitors

Оценка клеточного целевого взаимодействия с помощью ингибиторов PHP2 (PTPN11) Фосфатазы

The Src-homology 2 (SH2) domain-containing phosphatase 2 (SHP2), encoded by the PTPN11 proto-oncogene, is a key mediator of receptor tyrosine kinase ...

Identification of EGFR and RAS Inhibitors using Caenorhabditis elegans

Identification of EGFR and RAS Inhibitors using Caenorhabditis elegans

Идентификация ингибиторов EGFR и RAS с использованием Caenorhabditis elegans

The changes in the plasma membrane localization of the epidermal growth factor receptor (EGFR) and its downstream effector RAS have been implicated in ...