Name: assays for validating histone acetyltransferase inhibitors
Uploaded: 2020-08-06T15:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assays for Validating Histone Acetyltransferase Inhibitors at JoVE.com

Este trabajo fue apoyado por subvenciones del Programa de Investigación Biomédica James y Esther King (6JK03 y 20K07), y Bankhead-Coley Cancer Research Program (4BF02 y 6BC03), Florida Department of Health, Florida Breast Cancer Foundation y UF Health Cancer Center. Además, nos gustaría dar las gracias al Dr. Zachary Osking y a la Dra. Andrea Lin por su apoyo durante el proceso de publicación.

1. Ensayo HAT in vitro
<ol><li>Preparación de búferes NOTA: Consulte la Tabla 1 para las recetas de búfer.<ol>
<li>Preparar el tampón de ensayo 5x y el sulfato de Dodecyl de sodio 6x (SDS) y almacenar a -20 oC. Alícuota SDS en 1 ml de alícuotas.</li>
		<li>Prepare el tampón de funcionamiento de gel SDS 10x y 10 veces TBST y guárdelo a temperatura ambiente.</li>
		<li>Preparar 1x tampón de transferencia y almacenar a 4 oC. ADVERTENCIA: Compruebe la ficha de datos de segu...

Acetiltransferasas de lisina (KAT) acetillasoar varios residuos de lisina en las colas de histona y factores de transcripción para regular la transcripción genética2,3. El trabajo en las últimas dos décadas ha revelado que los KAT, como CBP/p300, PCAF y GCN5, interactúan con factores de transcripción oncogénicos y ayudan a impulsar el crecimiento tumoral en varios tipos de tumores sólidos4,,5,<su...

Las acetiltransferasas de lisina (KAT) catalizan la acetilación de los residuos de lisina en proteínas histonas y no histonas1,2,3,4. Investigaciones recientes revelan que los KAT y su función acetiltransferasa pueden promover el crecimiento sólido del tumor4,5,6,7,8,9. Por ejemplo, la proteína de unión a CREB (CBP)/p300 son dos KAT paralogos que regulan numerosas vías de señalización en el cáncer2,,3. CBP/p300 tienen una función de histona acetiltransferasa (HAT) bien caracterizada y catalizan Histone 3 lisina 27 acetillación (H3K27ac)2,4,5,10,11, un marcador importante para potenciadores activos, regiones promotoras y transcripción genética activa12,13,14. CBP/p300 sirven como co-activadores críticos para las vías de señalización pro-crecimiento en tumores sólidos mediante la activación de la transcripción de oncogenes a través de la acetilación de histonas y otros factores de transcripción4,9,15,16,17,18. Debido a su papel en la progresión tumoral, CBP/p300 y otros KAT están siendo investigados para el desarrollo de nuevos inhibidores que bloquean su función oncogénica4,,5,,6,7,8,9,18,19,20. A-485 y GNE-049 representan dos intentos exitosos de desarrollar inhibidores potentes y específicos para CBP/p3004,,9. Actualmente se están investigando inhibidores adicionales para CBP/p300 y otros TCC.
Se está cuestionando la calidad de los inhibidores de la KAT descritos anteriormente (KATi), con muchos inhibidores que muestran los efectos diana y la mala caracterización21. Por lo tanto, la caracterización y validación rigurosas de nuevos candidatos a medicamentos es esencial para el desarrollo de sondas químicas de alta calidad. Aquí se describen tres protocolos que forman una canalización para el cribado y la validación rigurosa de la potencia y especificidad de la nueva KATi, con un enfoque específico en la inhibición de la función HAT (HATi) de los KAT. CBP/p300 y sus inhibidores se utilizan como ejemplos, pero estos protocolos se pueden adaptar para otros KAT que tienen una función HAT7.
El primer protocolo es un ensayo in vitro de histona acetiltransferasa (HAT) que utiliza p300 recombinante purificado e histonas en una reacción controlada del tubo de ensayo. Este ensayo es fácil de realizar, es rentable, se puede utilizar para examinar compuestos en un entorno de bajo rendimiento y no requiere materiales radiactivos. En este protocolo, la acetilación de lisina recombinante p300 cataliza la lisina en las colas histonas durante un breve período de incubación y los niveles de acetilación de histona se miden mediante procedimientos de inmunoblotting estándar. La reacción enzimática se puede realizar en presencia o ausencia de inhibidores de CBP/p300 para detectar compuestos que reducen la acetilación de histona. Además, el ensayo HAT se puede utilizar para verificar si los compuestos nuevos son selectivos para CBP/p300 evaluando su actividad contra otros KAT purificados, como pcAF. El ensayo HAT es un excelente punto de partida para investigar nuevos inhibidores debido a su simplicidad, bajo costo y la capacidad de determinar la potencia/selectividad de un inhibidor. De hecho, este protocolo se utiliza a menudo en la literatura como una pantalla in vitro5,10. Sin embargo, los inhibidores identificados en el ensayo HAT no siempre son eficaces en el cultivo celular porque una reacción del tubo de ensayo es mucho más simple que un sistema celular vivo. Por lo tanto, es esencial caracterizar aún más los inhibidores en los experimentos de cultivo celular22,,23.
El segundo protocolo en la canalización es el ensayo de inhibición de la hiperacetilación de cromatina (ChHAI). Este ensayo basado en células utiliza inhibidores de la histona deacetilasa (HDACi) como una herramienta para hiperacetilar histonas en cromatina antes de la incubación con un HATi24. La acetilación basal de histona puede ser baja en el cultivo celular, lo que dificulta la sondeo a través de inmunoblotting sin la adición de un HDACi para aumentar la acetilación. El propósito del ensayo ChHAI es identificar nuevos HATi que pueden atenuar el aumento de la acetilción histona causada por la inhibición del HDAC. Las ventajas de este ensayo incluyen su bajo costo, relativa facilidad de realizar, y el uso de células en el cultivo, que proporciona más relevancia fisiológica que el ensayo HAT del tubo de ensayo. Al igual que el ensayo HAT, este protocolo utiliza inmunoblotting estándar para la recopilación de datos.
Los ensayos HAT y ChHAI proporcionan datos sobre la potencia de los nuevos compuestos para inhibir la acetilación de la histona global, pero no proporcionan información sobre cómo estos compuestos afectan las modificaciones en regiones genómicas específicas. Por lo tanto, el protocolo final, Chromatin Immunoprecipitation-quantitative Polymerase Chain Reaction (ChIP-qPCR) es un experimento de cultivo celular que investiga las interacciones ADN-proteína en regiones específicas del genoma. En el protocolo ChIP, la cromatina se reticula para preservar las interacciones ADN-proteína. A continuación, la cromatina se extrae de las células y el complejo de proteínas del ADN se somete a inmunoprecipitación selectiva para la proteína de interés (por ejemplo, utilizando un anticuerpo específico para H3K27ac). El ADN se purifica y analiza utilizando qPCR. Por ejemplo, ChIP-qPCR se puede utilizar para determinar si una nueva HATi regula la acetilción histona en oncogenes individuales, como Cyclin D125. Mientras que ChIP-qPCR es una técnica común utilizada en el campo, puede ser difícil optimizar4,10,26. Este protocolo proporciona consejos para evitar posibles escollos que pueden producirse al realizar el procedimiento ChIP-qPCR e incluye comprobaciones de control de calidad que se deben realizar en los datos.
Cuando se utilizan juntos, estos tres protocolos permiten la caracterización y validación rigurosas de la nueva HATi. Además, estos métodos ofrecen muchas ventajas porque son fáciles de realizar, relativamente baratos y proporcionan datos sobre la acetilación de histona global y regional.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 ml tube</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td>For all methods</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm dish</td>
			<td>Sarstedt AG &#38; Co.</td>
			<td>83.3902</td>
			<td>For cell culture of MCF-7 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 ul tips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-707-454</td>
			<td>For all Methods</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 ul tips</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4846</td>
			<td>For all Methods</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X Glycine buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Method 3. See Table 1 for recipe.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X Running Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Methods 1 and 2. See Table 1 for recipe.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X TBST</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Methods 1 and 2. See Table 1 for recipe.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3513</td>
			<td>For Method 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 cm dish</td>
			<td>Sarstedt AG &#38; Co.</td>
			<td>83.3903</td>
			<td>For Method 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml conical tube</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-200249</td>
			<td>For Methods 2 and 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X TBST with 5% milk and 0.02% Sodium Azide</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Methods 1 and 2. Can be used to dilute primary antibodies that will be used more than once. Allows for short-term storage of primary antibody dilutions. Do not use for secondary antibody diluton. CAUTION: Sodium Azide is toxic.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X TBST with 5% milk</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Methods 1 and 2. Used to block PVDF membrane and for antibody diltions. See Table 1 for recipe.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 ul tips</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4844</td>
			<td>For all Methods</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3148</td>
			<td>for SDS sample buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-20% polyacrylamide gel</td>
			<td>Thermo Fisher: Invitrogen</td>
			<td>XP04205BOX</td>
			<td>For Methods 1 and 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5X Assay buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Method 1. See Table 1 for recipe.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5X Passive lysis buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Method 2. See Table 1 for recipe.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6X Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Methods 1 and 2. See Table 1 for recipe.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A-485</td>
			<td>MedChemExpress</td>
			<td>HY-107455</td>
			<td>CBP/p300 Inhbitor for use in Methods 2 and 3. Dissolved in DMSO.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetyl-CBP(K1535)/p300(K1499) antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>4771</td>
			<td>For Method 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetyl-CoA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2056</td>
			<td>for use in Method 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetyl-Histone H3 (Lys 27) antibody (H3K27ac)</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>CST 8173</td>
			<td>antoibodies for H3K27ac for immunoblots and ChIP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetyl-Histone H3 (Lys18) antibody (H3K18ac)</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>CST 9675</td>
			<td>antoibodies for H3K18ac for immunoblots and ChIP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>alpha tubulin antibody</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>T5168</td>
			<td>For Method 2. Dilute 1:20,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anacardic acid</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td>13144</td>
			<td>For Method 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse IgG HRP linked secondary antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>7076</td>
			<td>For Methods 1 and 2. Dilute 1:10,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-rabbit IgG secondary antibody</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>711-035-152</td>
			<td>For Methods 1 and 2. Dilute 1:10,000 to 1:20,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoradiography film</td>
			<td>MIDSCI</td>
			<td>BX810</td>
			<td>For Methods 1 and 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Belly Dancer Rotating Platform</td>
			<td>Stovall Life Science Incorporated</td>
			<td>not available</td>
			<td>For Methods 1 and 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Calf Serum (BCS)</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30072.03</td>
			<td>cell culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2153</td>
			<td>for buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol Blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B0126</td>
			<td>for SDS sample buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CDTA</td>
			<td>Spectrum Chemical</td>
			<td>125572-95-4</td>
			<td>For buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cell scraper</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>CLS3010</td>
			<td>For Method 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChIP dilution buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Method 3. See Table 1 for recipe.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChIP Elution Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Method 3. See Table 1 for recipe.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete DMEM for MCF-7 Cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Methods 2 and 3. See Table 1 for recipe.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Covaris 130 &#181;l microTUBE</td>
			<td>Covaris</td>
			<td>520045</td>
			<td>Sonication tube for use with Covaris S220 in Method 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Covaris S220 Focused-ultrasonicator</td>
			<td>Covaris</td>
			<td>S220</td>
			<td>DNA sonicator for use in Method 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>41639</td>
			<td>for drug dilution and vehicle control treatment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>43815</td>
			<td>for SDS sample buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-013-CV</td>
			<td>cell culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP120-1</td>
			<td>for buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Example transfer tank and transfer apparatus</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>1704070</td>
			<td>For Methods 1 and 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EZ-Magna ChIP A/G Chromatin Immunoprecipitation Kit</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>17-10086</td>
			<td>For Method 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FK228 (Romidepsin)</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td>128517-07-7</td>
			<td>HDAC Inhibitor for use in Method 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F8775</td>
			<td>for cell fixation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glycerol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP229-1</td>
			<td>For buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glycine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7126</td>
			<td>for buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>54457</td>
			<td>for buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High salt wash buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Method 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IGEPAL (NP-40)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I3021</td>
			<td>for buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilon Chemiluminescent HRP Substrate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>WBKLS0500</td>
			<td>For Methods 1 and 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP366-500</td>
			<td>for buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LiCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L9650</td>
			<td>For buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LiCl wash buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Method 3. See Table 1 for recipe.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low salt wash buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Method 3. See Table 1 for recipe.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic Separator</td>
			<td>Promega</td>
			<td>Z5341</td>
			<td>For use in Method 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>494437</td>
			<td>For buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini gel tank</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A25977</td>
			<td>For Methods 1 and 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS-275 (Entinostat)</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td>209783-80-2</td>
			<td>HDAC Inhibitor for use in Method 2. Dissolved in DMSO.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>7647-14-5</td>
			<td>for buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S318-100</td>
			<td>for buffer preparation in Methods 1 and 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Rabbit IgG</td>
			<td>Bethyl Laboratories</td>
			<td>P120-101</td>
			<td>Control rabbit antibody for use in Method 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclei swelling buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Method 3. See Table 1 for recipe.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR Cleanup Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28104</td>
			<td>For use in Method 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin 100X</td>
			<td>Corning</td>
			<td>30-002-CI</td>
			<td>cell culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td>For Methods 2 and 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>80635</td>
			<td>for buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>powdered milk</td>
			<td>Nestle Carnation</td>
			<td></td>
			<td>For Methods 1 and 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power Pac 200 for western blot transfer</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td></td>
			<td>For Methods 1 and 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power Pac 3000 for SDS gel running</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td></td>
			<td>For Methods 1 and 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prestained Protein Ladder</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>26616</td>
			<td>For Methods 1 and 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>PI8340</td>
			<td>for use in Method 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein A Magentic Beads</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>S1425S</td>
			<td>For use in Method 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>P8107S</td>
			<td>For use in Method 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTC-100 Programmable Thermal Controller</td>
			<td>MJ Research Inc.</td>
			<td>PTC-100</td>
			<td>For Method 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF Transfer Membrane</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>IEVH00005</td>
			<td>For Methods 1 and 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant H3.1</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>M2503S</td>
			<td>for use in Method 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant p300</td>
			<td>ENZO Life Sciences</td>
			<td>BML-SE451-0100</td>
			<td>for use in Method 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SAHA (Vorinostat)</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td>149647-78-9</td>
			<td>HDAC Inhibitor for use in Method 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS lysis buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Method 3. See Table 1 for recipe.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>26628-22-8</td>
			<td>For Methods 1 and 2. CAUTION: Sodium Azide is toxic. See SDS for proper handling.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S233-500</td>
			<td>for buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D6750</td>
			<td>for buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71725</td>
			<td>for SDS sample buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard Heatblock</td>
			<td>VWR Scientific Products</td>
			<td>MPN: 949030</td>
			<td>For Methods 1 and 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Table top centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5417R</td>
			<td>For all methods</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TE buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Method 3. See Table 1 for recipe.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Methods 1 and 2. See Table 1 for recipe.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichostatin A</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td>58880-19-6</td>
			<td>HDAC Inhibitor for use in Method 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP152-5</td>
			<td>for buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td>for buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9005-64-5</td>
			<td>for buffer preparation in Methods 1 and 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-ray film processor</td>
			<td>Konica Minolta Medical &#38; Graphic, Inc.</td>
			<td>SRX-101A</td>
			<td>For Methods 1 and 2</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assays for validating histone acetyltransferase inhibitors

Las acetiltransferasas de lisina (KAT) catalizan la acetilación de los residuos de lisina en histonas y otras proteínas para regular la dinámica de la cromatina y la expresión génica. Los TCC, como cbP/p300, están bajo intensa investigación como dianas terapéuticas debido a su papel crítico en la tumorigenesis de diversos tipos de cáncer. El desarrollo de nuevos inhibidores de moléculas pequeñas dirigidos a la función de la histona acetiltransferasa (HAT) de los TCA es un reto y requiere ensayos robustos que puedan validar la especificidad y potencia de los posibles inhibidores.
En este artículo se describe una canalización de tres métodos que proporcionan una validación in vitro rigurosa para nuevos inhibidores de HAT (HATi). Estos métodos incluyen un ensayo HAT de tubo de ensayo, un ensayo de inhibición de la hiperacetilación de cromatina (ChHAI) y PCR cuantitativo con inmunoprecipitación de cromatina (ChIP-qPCR). En el ensayo HAT, los HAT recombinantes se incuban con histonas en una reacción del tubo de ensayo, lo que permite la acetilación de residuos específicos de lisina en las colas de histona. Esta reacción puede ser bloqueada por un HATi y los niveles relativos de acetilación de histona específica del sitio se pueden medir a través de inmunoblotting. Los inhibidores identificados en el ensayo HAT deben ser confirmados en el entorno celular.
El ensayo ChHAI utiliza inmunoblotting para detectar nuevos HATi que atenúan la hiperacetilación robusta de las histonas inducidas por un inhibidor de la histona deacetilasa (HDACi). La adición de un HDACi es útil porque los niveles basales de la acetilación de histona pueden ser difíciles de detectar a través de inmunoblotting.
Los ensayos HAT y ChHAI miden los cambios globales en la acetilación de histona, pero no proporcionan información sobre la acetilción en regiones genómicas específicas. Por lo tanto, ChIP-qPCR se utiliza para investigar los efectos de HATi en los niveles de acetilación de histona en los elementos reguladores de genes. Esto se logra a través de la inmunoprecipitación selectiva de complejos histone-ADN y el análisis del ADN purificado a través de qPCR. Juntos, estos tres ensayos permiten la validación cuidadosa de la especificidad, potencia y mecanismo de acción de la nueva HATi.

El ensayo in vitro de histona acetiltransferasa (HAT) se puede utilizar para sondear compuestos que inhiben la actividad de p300 HAT hacia un sustrato de histona. La Figura 1A proporciona un esquema experimental para el ensayo HAT. El ácido anacardico, conocido HATi3,38, se utilizó en este ensayo en un rango de concentración de 12,5-100 M. A 100 m, el ácido anacardico reduce las regulaciones p300 y cataliza la acetilción histona...

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Assays for Validating Histone Acetyltransferase Inhibitors

Los inhibidores de las acetiltransferasas de histona (HATs, también conocidos como acetiltransferasas de lisina), como CBP/p300, son terapias potenciales para el tratamiento del cáncer. Sin embargo, se necesitan métodos rigurosos para validar estos inhibidores. Tres métodos in vitro para la validación incluyen ensayos HAT con acetiltransferasas recombinantes, inmunoblotting para la acetilación de histona en el cultivo celular, y ChIP-qPCR.

Ensayos para validar los inhibidores de la acetiltransferasa histona

Lysine acetyltransferases (KATs) catalyze acetylation of lysine residues on histones and other proteins to regulate chromatin dynamics and gene ...

Estos protocolos son significativos porque proporcionan pasos detallados para la validación de la potencia y la selectividad de los nuevos inhibidores del HAT, que son importantes herramientas de investigación y posibles terapias. Las técnicas demostradas en este video son fáciles de realizar y proporcionan información sobre los efectos de los inhibidores de HAT en la acetilación de histona global y regional. Permiten comprender la regulación epigenética de la expresión génica.La atención a los detalles es fundamental. Es importante seguir los protocolos paso a paso. Comience preparando la reacción enzimática en un volumen de 10 microlitros dentro de un tubo PCR de 0,2 mililitros según las instrucciones del manuscrito.A continuación, incubar la mezcla de reacción completa a 30 grados centígrados durante una hora en un ciclor térmico de PCR. Mientras tanto, agregue dos mercaptoetanol en una proporción de uno a 10 al búfer de muestra 6X SDS. Retire las muestras del ciclor térmico PCR y añada dos microlitros del búfer de muestra SDS preparado a cada mezcla de reacción.Calienta las muestras a 95 grados centígrados durante cinco minutos en un bloque de calor y luego enfríalas sobre hielo. Almacene las muestras en menos 20 o menos 80 grados Celsius o proceda con electroforesis de gel e inmunoblotting. Semilla 100.000 células MCF-7 en un mililitro de medio de cultivo celular en cada pozo de una placa de 12 pozos y permite que las células crezcan a 80 a 90% de confluencia.Cuando las células alcancen la confluencia deseada, aspirar el medio de cultivo celular de los pozos cuatro, cinco y seis, y pipetear un mililitro de tres micromolares MS275 en medio en cada pozo. A continuación, aspirar el medio de cultivo celular de los pozos uno, dos y tres, y pipetear un mililitro de DMSO diluido en cada pozo. Devolver las células a la incubadora durante cuatro horas para permitir la acumulación de histonas acetiladas en las células expuestas a MS275.Mientras las células están incubando, prepare diluciones de A-485 en DMSO de acuerdo con las instrucciones del manuscrito. Una vez finalizada la incubación, aspirar el medio de los pozos y añadir las diluciones. Devolver las células a la incubadora y cultivarlas durante 20 horas, luego aspirar el medio de cultivo celular de los pozos y lavar las células con un mililitro de PBS.Aspirar el PBS y añadir 100 microlitros de tampón de lelisis pasiva. Guarde la placa a menos 80 grados centígrados durante la noche. Pipetear 100 microlitros de cromatina sonicada de células tratadas con DMSO en dos tubos de 1,5 mililitros, luego pipetear 400 microlitros de tampón de dilución ChIP a cada tubo para llevar el volumen total hasta 500 microlitros.Retire cinco microlitros de la solución de uno de los tubos y guárdelo a menos 20 grados Celsius como entrada DMSO. Preparar dos tubos con cromatina sonicada a partir de células tratadas con A-485 de la misma manera. Utilice una pipeta para añadir los anticuerpos acetil IgG y H3K27 a las muestras DMSO y A-485.A continuación, agregue 20 microlitros de proteína A cuentas magnéticas a cada tubo, asegurándose de que las perlas estén bien resuspendidas. Gire las muestras durante la noche a cuatro grados centígrados. Pele la proteína Un perla magnética usando un separador magnético y retire el sobrenadante sin alterar las perlas.Lave las cuentas con 500 microlitros a un mililitro de tampón de lavado con bajo contenido de sal y gírelas durante cinco minutos a cuatro grados centígrados. Realizar un giro rápido hacia abajo, peletizar las perlas con un separador magnético y quitar el sobrenadante. Repita el procedimiento de lavado con tampón de lavado de sal alta, tampón de lavado de cloruro de litio y tampón TE.Después del lavado con tampón TE, retire las muestras de entrada del congelador y colóquelas en hielo. Descongelar una alícuota de proteinasa K, luego pele el cordón usando un separador magnético y retire el tampón TE de las perlas. Añadir 100 microlitros de tampón de elución ChIP y un microlitro de proteinasa K a cada muestra, incluidas las muestras de entrada, e incubarlas con agitación a 62 grados centígrados durante dos horas utilizando un termociclo.Después de la incubación, calienta las muestras a 95 grados Celsius durante 10 minutos, luego enfríelas a temperatura ambiente. Pele el punto magnético con un separador magnético y transfiera el sobrenadante que contiene ADN a un nuevo tubo de 1,5 mililitros. Purifique el ADN utilizando un kit de limpieza de PCR estándar y ejecute qPCR.El ensayo in vitro de histona acetiltransferasa se utilizó para investigar el efecto del ácido anacardico en la actividad de p300 HAT hacia un sustrato de histona. Se probó un rango de concentración y no se añadió acetil-CoA a la reacción de control negativo. Los resultados de inmunoblotos se cuantificaron con ImageJ, mostrando una clara reducción en el acetil H3K18 y acetil H3K9 a 100 ácido anacardico micromolar en comparación con el control DMSO.En el ensayo de inhibición de la hiperatilidad de la cromatina, el tratamiento de las células MCF-7 con HDACi MS275 fuertemente regulado acetillación de la histona 3 en varios residuos de lisina. Los niveles basales de acetil H3K18 y acetil H3K27 fueron bajos, mostrando los beneficios de agregar un HDACi en el ensayo ChHAI. La adición de A-485 en células pretratadas con MS275 atenúa el aumento de la acetilción de histona en H3K18 y H3K27, pero no H3K9.Los resultados de inmunoblot también se cuantificaron con ImageJ. ChIP qPCR se utilizó para investigar los efectos de los inhibidores de HAT en elementos reguladores de genes que controlan la expresión de oncogén. En la muestra DMSO, el ADN precipitado por el anticuerpo de control IgG produjo un valor Ct más alto que el anticuerpo acetil H3K27 en la reacción qPCR para el promotor de la ciclina D1, lo que indica que el control IgG no específico precipitó menos complejos de histona de ADN que el anticuerpo específico de acetil H3K27 en el promotor.En comparación con el control DMSO, A-485 redujo el enriquecimiento de acetil H3K27 en el promotor de la ciclina D1. Es importante destacar que se sabe que A-485 reduce significativamente el acetil H3K27 en el cultivo celular. Al intentar este protocolo, tenga en cuenta que los pasos previos a la incubación de los ensayos IN vitro HAT y ChHAI son esenciales y no deben olvidarse.También es importante recordar guardar las muestras de entrada y evitar la pérdida de las perlas durante ChIP. Después de realizar estos procedimientos, ChIP-seq es un método adicional que se puede ejecutar para obtener información global sobre la acetilación de histona en elementos reguladores para todo el genoma. Estos protocolos son útiles para que los científicos validen cuidadosamente nuevos inhibidores de HAT y eviten publicar sondas químicas de baja calidad en la literatura.Los inhibidores de HAT validados pueden someterse a un desarrollo adicional como posibles terapias.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Coculture Assays to Study Macrophage and Microglia Stimulation of Glioblastoma Invasion

Cocultivo Los ensayos para Estudiar macrófagos y microglia Estimulación de Glioblastoma Invasion

Glioblastoma multiforme (grade IV glioma) is a very aggressive human cancer with a median survival of 1 year post diagnosis. Despite the increased ...

Investigación

Investigación sobre el cáncer

Preclinical Assessment of the Bioactivity of the Anticancer Coumarin OT48 by Spheroids, Colony Formation Assays, and Zebrafish Xenografts

Evaluación preclínica de la bioactividad de la OT48 contra el cáncer de la cumarina por esferoides, ensayos de formación de Colonia y xenoinjertos de pez cebra

In vitro and in vivo pre-clinical screening of novel therapeutic agents are an essential tool in cancer drug discovery. Although human cancer cell lines ...

Assessment of Resistance to Tyrosine Kinase Inhibitors by an Interrogation of Signal Transduction Pathways by Antibody Arrays

Evaluación de la resistencia a inhibidores de la cinasa de tirosina por un interrogatorio de vías de transducción de señal por Arrays de anticuerpos

Cancer patients with an aberrant regulation of the protein phosphorylation networks are often treated with the tyrosine kinase inhibitors. Response rates ...

Live-Cell Imaging Assays to Study Glioblastoma Brain Tumor Stem Cell Migration and Invasion

Análisis de imágenes de células vivas para estudio Glioblastoma cerebral Tumor células madre migración y la invasión

Glioblastoma (GBM) is an aggressive brain tumor that is poorly controlled with the currently available treatment options. Key features of GBMs include ...

Investigation of Genetic Dependencies Using CRISPR-Cas9-based Competition Assays

Investigación de las dependencias genéticas usando análisis CRISPR Cas9 basado en competencia

Gene perturbation studies have been extensively used to investigate the role of individual genes in AML pathogenesis. For achieving complete gene ...

Yeast As a Chassis for Developing Functional Assays to Study Human P53

Levadura como chasis para el desarrollo de ensayos funcionales para estudiar P53 humanos

The finding that the well-known mammalian P53 protein can act as a transcription factor (TF) in the yeast S. cerevisiae has allowed for the development of ...

Characterization of the Effects of Migrastatic Inhibitors on 3D Tumor Spheroid Invasion by High-resolution Confocal Microscopy

Caracterización de los efectos de los inhibidores migratorios en la invasión de esferoides de tumores 3D por microscopía confocal de alta resolución

Drug discovery and development in cancer research is increasingly being based on drug screens in a 3D format. Novel inhibitors targeting the migratory and ...

Combined Use of Tail Vein Metastasis Assays and Real-Time In Vivo Imaging to Quantify Breast Cancer Metastatic Colonization and Burden in the Lungs

Uso combinado de ensayos de metástasis de vena de cola e imágenes en tiempo real en vivo en vivo para cuantificar la colonización metastásica del cáncer de mama y la carga en los pulmones

Metastasis is the main cause of cancer-related deaths and there are limited therapeutic options for patients with metastatic disease. The identification ...

Assessing Cellular Target Engagement by SHP2 (PTPN11) Phosphatase Inhibitors

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Evaluación del compromiso de objetivos celulares por inhibidores de la fosfatasa SHP2 (PTPN11)

The Src-homology 2 (SH2) domain-containing phosphatase 2 (SHP2), encoded by the PTPN11 proto-oncogene, is a key mediator of receptor tyrosine kinase ...

Identification of EGFR and RAS Inhibitors using Caenorhabditis elegans

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Identificación de inhibidores de EGFR y RAS mediante Caenorhabditis elegans

The changes in the plasma membrane localization of the epidermal growth factor receptor (EGFR) and its downstream effector RAS have been implicated in ...