Name: assays for validating histone acetyltransferase inhibitors
Uploaded: 2020-08-06T15:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assays for Validating Histone Acetyltransferase Inhibitors at JoVE.com

Detta arbete stöddes av bidrag från James och Esther King Biomedical Research Program (6JK03 och 20K07), och Bankhead-Coley Cancer Research Program (4BF02 och 6BC03), Florida Department of Health, Florida Breast Cancer Foundation, och UF Health Cancer Center. Dessutom vill vi tacka Dr Zachary Osking och Dr Andrea Lin för deras stöd under publiceringsprocessen.

1. IN VITRO HAT-analys
<ol><li>Förberedelse av buffert OBS: Se tabell 1 för buffertrecept.<ol>
<li>Förbered 5x analysbuffert och 6x Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) och förvara vid -20 °C. Aliquot SDS i 1 mL alikvoter.</li>
		<li>Förbered 10x SDS gel kör buffert och 10x TBST och förvara i rumstemperatur.</li>
		<li>Förbered 1x överföringsbuffert och förvara vid 4 °C. FÖRSIKTIGHET: Kontrollera säkerhetsdatablad för alla kemikalier som används i detta protokoll. SDS, ...

Lysinacetyltransferaser (KATs) acetylerar flera lysinrester på histonstjärtar och transkriptionsfaktorer för att reglera gentranskription2,3. Arbete under de senaste två decennierna har visat att KATs, såsom CBP/p300, PCAF och GCN5, interagera med onkogena transkriptionsfaktorer och bidra till att driva tumörtillväxt i flera solida tumörtyper4,5,9,<sup...

Lysinacetyltransferaser (KATs) katalyserar acetyleringen av lysinrester på både histon och icke-histonproteiner1,2,3,4. Ny forskning visar att KATs och deras acetyltransferasfunktion kan främja solid tumörtillväxt4,5,6,7,8,9. Till exempel, CREB-bindande protein (CBP)/p300 är två paraloga KATs som reglerar ett flertal signalering vägar i cancer2,3. CBP/p300 har en väl karakteriserad hitonacetyltransferas (HAT) funktion och katalysera Histon 3 Lysin 27 acetylation (H3K27ac)2,4,55,10,11, en viktig markör för aktiva förstärkare, promotorregioner och aktiv gentranskription12,13,14. CBP/p300 fungera som kritiska co-aktivatorer för pro-tillväxt signalering vägar i fasta tumörer genom att aktivera transkription av onkogener genom acetylering av histoner och andra transkriptionsfaktorer4,9,15,16,17,18. På grund av sin roll i tumörprogression, CBP/p300 och andra KATs är under utredning för utveckling av nya hämmare som blockerar deras onkogen funktion4,5,6,7,8,9,18,19,20. A-485 och GNE-049 representerar två framgångsrika försök att utveckla potenta och specifika hämmare för CBP/p3004,9. Ytterligare hämmare är för närvarande under utredning för CBP/p300 och andra KATs.
Kvaliteten på tidigare beskrivna KAT-hämmare (KATi) ifrågasätts, med många hämmare som visar upp måleffekter och dålig karakterisering21. Därför är rigorös karakterisering och validering av nya läkemedelskandidater avgörande för utvecklingen av högkvalitativa kemiska sonder. Beskrivs här är tre protokoll som bildar en pipeline för screening och noggrant validera styrkan och specificiteten i romanen KATi, med ett särskilt fokus på att hämma HAT-funktionen (HATi) av KATs. CBP/p300 och deras hämmare används som exempel, men dessa protokoll kan anpassas för andra KATs som har en HAT-funktion7.
Det första protokollet är en in vitro-hitonacetyltransferas (HAT) analys som utnyttjar renad rekombinant p300 och histoner i en kontrollerad provrörsreaktion. Denna analys är enkel att utföra, är kostnadseffektiv, kan användas för att skärmen föreningar i en låg genomströmning inställning, och kräver inte radioaktiva material. I detta protokoll, rekombinanta p300 katalyserar lysin acetylation på histon svansar under en kort inkubationstid och nivåerna av histon acetylering mäts med hjälp av standard immunoblotting förfaranden. Den enzymatiska reaktionen kan utföras i närvaro eller frånvaro av CBP/p300-hämmare till skärm för föreningar som minskar histonacetylation. Dessutom kan HAT-analysen användas för att kontrollera om nya föreningar är selektiva för CBP/p300 genom att bedöma deras verksamhet mot andra renade KATs, såsom PCAF. DEN HAT-analysen är en utmärkt utgångspunkt för att undersöka nya inhibitorer på grund av dess enkelhet, låg kostnad, och förmågan att bestämma styrkan / selektivitet av en hämmare. I själva verket är detta protokoll ofta används i litteraturen som en in vitro-skärm5,10. Emellertid, hämmare identifieras i HAT-analysen är inte alltid effektiva i cellodling eftersom ett provrör reaktion är mycket enklare än en levande cell system. Därför är det väsentligt att ytterligare karakterisera hämmare i cellodlingsexperiment22,23.
Det andra protokollet i pipelinen är Chromatin Hyperacetylation Inhibition (ChHAI) analys. Denna cell baserad analys utnyttjar histon deacetylase-hämmare (HDACi) som ett verktyg för att hyperacetylate histoner i kromatin före co-inkubation med en HATi24. Basal histon acetylering kan vara låg i cellodling, vilket gör det svårt att sond för via immunoblotting utan tillsats av en HDACi att öka acetylering. Syftet med ChHAI analysen är att identifiera romanen HATi som kan dämpa ökningen av histon acetylation orsakad av HDAC hämning. Fördelarna med denna analys inkluderar dess låga kostnad, relativt lätt att utföra, och användning av celler i kultur, som ger mer fysiologisk relevans än provröret HAT analys. I likhet med HAT-analysen använder detta protokoll vanlig immunoblotting för datainsamling.
HAT och ChHAI analyser ger data om styrkan av nya föreningar för att hämma globala histon acetylation, men ger inte insikt i hur dessa föreningar påverkar ändringar vid specifika genomiska regioner. Därför är det slutliga protokollet, Chromatin Immunoprecipitation-quantitative Polymerase Chain Reaction (ChIP-qPCR) ett cellodlingsexperiment som undersöker DNA-protein interaktioner vid specifika regioner i arvsmassan. I ChIP-protokollet korskopplas kromatin för att bevara DNA-protein interaktioner. Kromatin extraheras sedan från celler och DNA-proteinkomplexet genomgår selektiv immunoprecipitation för proteinet av intresse (t.ex. med hjälp av en antikropp som är specifik för H3K27ac). DNA:t renas sedan och analyseras med hjälp av qPCR. Till exempel kan ChIP-qPCR användas för att avgöra om en roman HATi downregulates histonacetylation vid enskilda onkogener, såsom Cyclin D125. Medan ChIP-qPCR är en vanlig teknik som används i fältet, kan det vara svårt att optimera4,10,26. Det här protokollet innehåller tips för att undvika potentiella fallgropar som kan uppstå när du utför Proceduren ChIP-qPCR och innehåller kvalitetskontroller som bör utföras på data.
När de används tillsammans, dessa tre protokoll möjliggör en rigorös karakterisering och validering av romanen HATi. Dessutom, dessa metoder erbjuder många fördelar eftersom de är lätta att utföra, relativt billiga och ge data om globala samt regionala histon acetylation.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 ml tube</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td>For all methods</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm dish</td>
			<td>Sarstedt AG &#38; Co.</td>
			<td>83.3902</td>
			<td>For cell culture of MCF-7 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 ul tips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-707-454</td>
			<td>For all Methods</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 ul tips</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4846</td>
			<td>For all Methods</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X Glycine buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Method 3. See Table 1 for recipe.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X Running Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Methods 1 and 2. See Table 1 for recipe.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X TBST</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Methods 1 and 2. See Table 1 for recipe.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3513</td>
			<td>For Method 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 cm dish</td>
			<td>Sarstedt AG &#38; Co.</td>
			<td>83.3903</td>
			<td>For Method 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml conical tube</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-200249</td>
			<td>For Methods 2 and 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X TBST with 5% milk and 0.02% Sodium Azide</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Methods 1 and 2. Can be used to dilute primary antibodies that will be used more than once. Allows for short-term storage of primary antibody dilutions. Do not use for secondary antibody diluton. CAUTION: Sodium Azide is toxic.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X TBST with 5% milk</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Methods 1 and 2. Used to block PVDF membrane and for antibody diltions. See Table 1 for recipe.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 ul tips</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4844</td>
			<td>For all Methods</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3148</td>
			<td>for SDS sample buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-20% polyacrylamide gel</td>
			<td>Thermo Fisher: Invitrogen</td>
			<td>XP04205BOX</td>
			<td>For Methods 1 and 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5X Assay buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Method 1. See Table 1 for recipe.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5X Passive lysis buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Method 2. See Table 1 for recipe.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6X Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Methods 1 and 2. See Table 1 for recipe.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A-485</td>
			<td>MedChemExpress</td>
			<td>HY-107455</td>
			<td>CBP/p300 Inhbitor for use in Methods 2 and 3. Dissolved in DMSO.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetyl-CBP(K1535)/p300(K1499) antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>4771</td>
			<td>For Method 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetyl-CoA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2056</td>
			<td>for use in Method 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetyl-Histone H3 (Lys 27) antibody (H3K27ac)</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>CST 8173</td>
			<td>antoibodies for H3K27ac for immunoblots and ChIP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetyl-Histone H3 (Lys18) antibody (H3K18ac)</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>CST 9675</td>
			<td>antoibodies for H3K18ac for immunoblots and ChIP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>alpha tubulin antibody</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>T5168</td>
			<td>For Method 2. Dilute 1:20,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anacardic acid</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td>13144</td>
			<td>For Method 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse IgG HRP linked secondary antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>7076</td>
			<td>For Methods 1 and 2. Dilute 1:10,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-rabbit IgG secondary antibody</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>711-035-152</td>
			<td>For Methods 1 and 2. Dilute 1:10,000 to 1:20,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoradiography film</td>
			<td>MIDSCI</td>
			<td>BX810</td>
			<td>For Methods 1 and 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Belly Dancer Rotating Platform</td>
			<td>Stovall Life Science Incorporated</td>
			<td>not available</td>
			<td>For Methods 1 and 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Calf Serum (BCS)</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30072.03</td>
			<td>cell culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2153</td>
			<td>for buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol Blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B0126</td>
			<td>for SDS sample buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CDTA</td>
			<td>Spectrum Chemical</td>
			<td>125572-95-4</td>
			<td>For buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cell scraper</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>CLS3010</td>
			<td>For Method 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChIP dilution buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Method 3. See Table 1 for recipe.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChIP Elution Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Method 3. See Table 1 for recipe.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete DMEM for MCF-7 Cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Methods 2 and 3. See Table 1 for recipe.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Covaris 130 &#181;l microTUBE</td>
			<td>Covaris</td>
			<td>520045</td>
			<td>Sonication tube for use with Covaris S220 in Method 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Covaris S220 Focused-ultrasonicator</td>
			<td>Covaris</td>
			<td>S220</td>
			<td>DNA sonicator for use in Method 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>41639</td>
			<td>for drug dilution and vehicle control treatment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>43815</td>
			<td>for SDS sample buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-013-CV</td>
			<td>cell culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP120-1</td>
			<td>for buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Example transfer tank and transfer apparatus</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>1704070</td>
			<td>For Methods 1 and 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EZ-Magna ChIP A/G Chromatin Immunoprecipitation Kit</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>17-10086</td>
			<td>For Method 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FK228 (Romidepsin)</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td>128517-07-7</td>
			<td>HDAC Inhibitor for use in Method 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F8775</td>
			<td>for cell fixation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glycerol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP229-1</td>
			<td>For buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glycine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7126</td>
			<td>for buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>54457</td>
			<td>for buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High salt wash buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Method 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IGEPAL (NP-40)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I3021</td>
			<td>for buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilon Chemiluminescent HRP Substrate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>WBKLS0500</td>
			<td>For Methods 1 and 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP366-500</td>
			<td>for buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LiCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L9650</td>
			<td>For buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LiCl wash buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Method 3. See Table 1 for recipe.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low salt wash buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Method 3. See Table 1 for recipe.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic Separator</td>
			<td>Promega</td>
			<td>Z5341</td>
			<td>For use in Method 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>494437</td>
			<td>For buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini gel tank</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A25977</td>
			<td>For Methods 1 and 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS-275 (Entinostat)</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td>209783-80-2</td>
			<td>HDAC Inhibitor for use in Method 2. Dissolved in DMSO.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>7647-14-5</td>
			<td>for buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S318-100</td>
			<td>for buffer preparation in Methods 1 and 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Rabbit IgG</td>
			<td>Bethyl Laboratories</td>
			<td>P120-101</td>
			<td>Control rabbit antibody for use in Method 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclei swelling buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Method 3. See Table 1 for recipe.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR Cleanup Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28104</td>
			<td>For use in Method 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin 100X</td>
			<td>Corning</td>
			<td>30-002-CI</td>
			<td>cell culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td>For Methods 2 and 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>80635</td>
			<td>for buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>powdered milk</td>
			<td>Nestle Carnation</td>
			<td></td>
			<td>For Methods 1 and 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power Pac 200 for western blot transfer</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td></td>
			<td>For Methods 1 and 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power Pac 3000 for SDS gel running</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td></td>
			<td>For Methods 1 and 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prestained Protein Ladder</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>26616</td>
			<td>For Methods 1 and 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>PI8340</td>
			<td>for use in Method 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein A Magentic Beads</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>S1425S</td>
			<td>For use in Method 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>P8107S</td>
			<td>For use in Method 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTC-100 Programmable Thermal Controller</td>
			<td>MJ Research Inc.</td>
			<td>PTC-100</td>
			<td>For Method 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF Transfer Membrane</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>IEVH00005</td>
			<td>For Methods 1 and 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant H3.1</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>M2503S</td>
			<td>for use in Method 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant p300</td>
			<td>ENZO Life Sciences</td>
			<td>BML-SE451-0100</td>
			<td>for use in Method 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SAHA (Vorinostat)</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td>149647-78-9</td>
			<td>HDAC Inhibitor for use in Method 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS lysis buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Method 3. See Table 1 for recipe.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>26628-22-8</td>
			<td>For Methods 1 and 2. CAUTION: Sodium Azide is toxic. See SDS for proper handling.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S233-500</td>
			<td>for buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D6750</td>
			<td>for buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71725</td>
			<td>for SDS sample buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard Heatblock</td>
			<td>VWR Scientific Products</td>
			<td>MPN: 949030</td>
			<td>For Methods 1 and 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Table top centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5417R</td>
			<td>For all methods</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TE buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Method 3. See Table 1 for recipe.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Methods 1 and 2. See Table 1 for recipe.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichostatin A</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td>58880-19-6</td>
			<td>HDAC Inhibitor for use in Method 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP152-5</td>
			<td>for buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td>for buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9005-64-5</td>
			<td>for buffer preparation in Methods 1 and 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-ray film processor</td>
			<td>Konica Minolta Medical &#38; Graphic, Inc.</td>
			<td>SRX-101A</td>
			<td>For Methods 1 and 2</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assays for validating histone acetyltransferase inhibitors

Lysinacetyltransferaser (KATs) katalyserar acetylation av lysinrester på histoner och andra proteiner för att reglera kromatindynamik och genuttryck. KATs, såsom CBP/p300, är under intensiv utredning som terapeutiska mål på grund av deras kritiska roll i tumorigenesis av olika cancerformer. Utvecklingen av nya små molekylhämmare som riktar sig mot hitoncetyltransferas (HAT) funktion av KATs är utmanande och kräver robusta analyser som kan validera specificitet och potens av potentiella hämmare.
Denna artikel beskriver en pipeline av tre metoder som ger rigorös in vitro-validering för nya HAT-hämmare (HATi). Dessa metoder inkluderar en teströr HAT-analys, Chromatin Hyperacetylation Inhibition (ChHAI) analys, och Chromatin Immunoprecipitation-kvantitativa PCR (ChIP-qPCR). I HAT-analysen inkuberas rekombinanta HATs med histoner i en provrörsreaktion, vilket möjliggör acetylering av specifika lysinrester på histonstjärtarna. Denna reaktion kan blockeras av en HATi och de relativa nivåerna av platsspecifik histonacetylation kan mätas via immunoblotting. Hämmare som identifieras i HAT-analysen behöver bekräftas i cellulär miljö.
Den ChHAI analys använder immunoblotting att skärmen för romanen HATi som dämpar den robusta hyperacetylation av histoner framkallas av en histone deacetylase inhibitor (HDACi). Tillägget av en HDACi är till hjälp eftersom basala nivåer av histon acetylation kan vara svårt att upptäcka via immunoblotting.
HAT- och ChHAI-analyserna mäter globala förändringar i histonacetylation, men ger inte information angående acetylation vid specifika genomiska regioner. Därför används ChIP-qPCR för att undersöka effekterna av HATi på nivåerna för histonacetylation vid genreglerande element. Detta åstadkoms genom selektiv immunoprecipitation av histon-DNA-komplex och analys av det renade DNA genom qPCR. Tillsammans, dessa tre analyser möjliggör noggrann validering av specificitet, potens, och verkningsmekanismen för romanen HATi.

In vitro-histonacetyltransferas (HAT) analys kan användas för att sondera för föreningar som hämmar p300 HAT aktivitet mot ett histonsubstrat. Bild 1A ger ett experimentellt schema för HAT-analysen. Anakarsyra, en känd HATi3,38, utnyttjades i denna analys i ett koncentrationsintervall från 12,5-100 μM. Vid 100 μM, anakardisyra downregulates p300 katalyseras histon acetylation vid Histone 3, Lysin 9 och 18 mot kontrollen DMS...

Watch this Scientific Journal Video about Assays for Validating Histone Acetyltransferase Inhibitors at JoVE.com

Assays for Validating Histone Acetyltransferase Inhibitors

Hämmare av histonacetyltransferaser (HATs, även känd som lysinacetyltransferaser), såsom CBP/p300, är potentiella therapeutics för behandling av cancer. Men, rigorösa metoder för att validera dessa hämmare behövs. Tre in vitro-metoder för validering inkluderar HAT-analyser med rekombinanta acetyltransferaser, immunoblotting för histonacetylation i cellodling, och ChIP-qPCR.

Analyser för validering av Histone Acetyltransferas hämmare

Lysine acetyltransferases (KATs) catalyze acetylation of lysine residues on histones and other proteins to regulate chromatin dynamics and gene ...

Dessa protokoll är betydande eftersom de ger detaljerade steg för validering av styrkan och selektivitet av nya HAT-hämmare, som är viktiga forskningsverktyg och potentiella therapeutics. De tekniker som demonstreras i denna video är lätta att utföra och ge information om effekterna av HAT-hämmare på globala och regionala histon acetylation. De gör det möjlighet att förstå epigenetisk reglering av genuttryck.Uppmärksamhet på detaljerna är kritisk. Det är viktigt att följa protokollen steg för steg. Börja med att förbereda den enzymatiska reaktionen i en 10 mikrolitervolym inuti ett 0,2 milliliter PCR-rör enligt manuskriptriktningar.Inkubera sedan den kompletta reaktionsblandningen vid 30 grader Celsius i en timme i en PCR termisk cycler. Under tiden, tillsätt två merkaptoetanol vid en ett till 10 förhållande till 6X SDS provbuffert. Ta bort prover från PCR termisk cycler och tillsätt två mikroliter av den beredda SDS provbuffert till varje reaktion mix.Värm proverna till 95 grader Celsius i fem minuter på ett värmeblock och kyl dem sedan på is. Förvara proverna på minus 20 eller minus 80 grader Celsius eller fortsätt med gelelektrofores och immunoblotting. Seed 100, 000 MCF-7 celler i en milliliter cellodling medium i varje brunn av en 12-brunns platta och låta cellerna växa till 80 till 90%konfluency.När cellerna når önskad konfluency aspirera cellodlingsmediet från brunnarna fyra, fem och sex, och pipettera en milliliter av tre mikromolar MS275 i medium i varje brunn. Sedan aspirera cellodlingsmediet från brunnar ett, två och tre, och pipettera en milliliter av utspädd DMSO i varje brunn. Återför cellerna till inkubatorn i fyra timmar för att möjliggöra ackumulering av acetylerade histoner i celler som exponeras för MS275.Medan cellerna inkuberar, förbereda utspädningar av A-485 i DMSO enligt manuskriptriktningar. När inkubationen är klar, aspirera mediet från brunnarna och tillsätt spädningarna. Återför cellerna till inkubatorn och odla dem i 20 timmar, aspirera sedan cellodlingsmediet från brunnarna och tvätta cellerna med en milliliter PBS.Aspirera PBS och tillsätt 100 mikroliter av passiv lysbuffert. Förvara plattan på minus 80 grader Celsius över natten. Pipett 100 mikroliter av sonicated kromatin från celler som behandlats med DMSO i två 1,5 milliliter rör, sedan pipetter 400 mikroliter chip utspädning buffert till varje rör för att få den totala volymen upp till 500 mikroliter.Ta bort fem mikroliter av lösningen från ett av rören och förvara den på minus 20 grader Celsius som DMSO-ingång. Förbered två rör med sonicated kromatin från celler som behandlats med A-485 på samma sätt. Använd en pipett för att lägga till acetylantikropparna IgG och H3K27 i dmso- och A-485-proverna.Tillsätt sedan 20 mikroliter protein A magnetiska pärlor till varje rör, se till att pärlorna är väl resuspended. Rotera proverna över natten vid fyra grader Celsius. Pellet proteinet En magnetisk pärlor med hjälp av en magnetisk separator och avlägsna supernatanten utan att störa pärlorna.Tvätta pärlorna med 500 mikroliter till en milliliter låg salttvättbuffert och rotera dem i fem minuter vid fyra grader Celsius. Utför en snabb snurr ner, pelleta pärlorna med en magnetisk separator och ta bort supernatanten. Upprepa tvättproceduren med hög salttvättbuffert, litiumkloridtvättbuffert och TE-buffert.Efter tvätten med TE-buffert tar du ut ingångsproverna från frysen och lägger dem på is. Tina en alikvot av proteinase K, sedan pellet pärlorna med hjälp av en magnetisk separator och ta bort TE buffert från pärlorna. Tillsätt 100 mikroliter ChIP elueringsbuffert och en mikroliter proteinas K till varje prov inklusive inmatningsproverna och inkubera dem med skakningar vid 62 grader Celsius i två timmar med hjälp av en termocyklare.Efter inkubationen, värm proverna till 95 grader Celsius i 10 minuter, sedan kyla dem till rumstemperatur. Pellet de magnetiska pärlorna med en magnetisk separator och överför den DNA-innehållande supernatanten till ett nytt 1,5 milliliterrör. Rena DNA:t med hjälp av en pcr-rensedit av standard och kör qPCR.In vitro-histon acetyltransferas assay användes för att undersöka effekten av anakardisyra på p300 HAT aktivitet mot ett histonsubstrat. Ett koncentrationsintervall testades och acetyl- CoA lades inte till den negativa kontrollreaktionen. Immunoblot resultaten kvantifierades med ImageJ, visar en tydlig minskning av acetyl H3K18 och acetyl H3K9 på 100 micromolar anacardic syra jämfört med DMSO kontroll.I kromatin hyper-acetylation hämning analys, behandling av MCF-7 celler med HDACi MS275 starkt upregulated acetylation av histon 3 på flera lysin rester. De basala nivåerna av acetyl H3K18 och acetyl H3K27 var låga, visar fördelarna med att lägga till en HDACi i ChHAI-analysen. Tillsats av A-485 i celler som förbehandlas med MS275 dämpar den ökade histonestylationen vid H3K18 och H3K27, men inte H3K9.Immunoblotresultaten kvantifierades också med ImageJ. ChIP qPCR användes för att undersöka effekterna av HAT-hämmare vid genreglerande element som styr onkogenuttryck. I DMSO-provet gav det DNA som fälldes ut av IgG-kontrollantikroppen ett högre Ct-värde än acetyl H3K27-antikroppen i qPCR-reaktionen för cyklin D1-promotorn, vilket indikerar att den icke-specifika IgG-kontrollen fällde ut mindre DNA-histonskomplex än den acetyl H3K27 specifika antikroppen hos promotorn.Jämfört med DMSO-kontrollen minskade A-485 acetyl H3K27-anrikningen vid promotorn för cyclin D1. Viktigt, A-485 är känt för att avsevärt minska acetyl H3K27 i cellodling. När du försöker detta protokoll, tänk på att pre-inkubation steg av in vitro HAT och ChHAI analyser är väsentliga och bör inte glömmas bort.Det är också viktigt att komma ihåg att spara indataproverna och för att undvika förlust av pärlorna under ChIP. Efter att ha utfört dessa förfaranden, ChIP-seq är en ytterligare metod som kan utföras för att få global information om histonacetylation vid reglerande element för hela genomet. Dessa protokoll är till hjälp för forskare att noggrant validera nya HAT-hämmare och för att undvika publicering av låg kvalitet kemiska sonder i litteraturen.De validerade HAT-hämmarna kan genomgå ytterligare utveckling som potentiella therapeutics.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Coculture Assays to Study Macrophage and Microglia Stimulation of Glioblastoma Invasion

Coculture Analyser för att studera makrofager och mikroglia Stimulering av Glioblastoma Invasion

Glioblastoma multiforme (grade IV glioma) is a very aggressive human cancer with a median survival of 1 year post diagnosis. Despite the increased ...

Preclinical Assessment of the Bioactivity of the Anticancer Coumarin OT48 by Spheroids, Colony Formation Assays, and Zebrafish Xenografts

Preklinisk utvärdering av bioaktiviteten av den mot cancer kumarin OT48 av Spheroids, koloni bildandet analyser och zebrafiskar xenograft

In vitro and in vivo pre-clinical screening of novel therapeutic agents are an essential tool in cancer drug discovery. Although human cancer cell lines ...

Assessment of Resistance to Tyrosine Kinase Inhibitors by an Interrogation of Signal Transduction Pathways by Antibody Arrays

Bedömning av resistens mot tyrosinkinashämmare av ett förhör av cellsmedierade reaktioner av antikropp matriser

Cancer patients with an aberrant regulation of the protein phosphorylation networks are often treated with the tyrosine kinase inhibitors. Response rates ...

Live-Cell Imaging Assays to Study Glioblastoma Brain Tumor Stem Cell Migration and Invasion

Live-Cell Imaging analyser för studien Glioblastoma hjärnan tumören Stem cellmigration och Invasion

Glioblastoma (GBM) is an aggressive brain tumor that is poorly controlled with the currently available treatment options. Key features of GBMs include ...

Investigation of Genetic Dependencies Using CRISPR-Cas9-based Competition Assays

Utredning av genetiska beroenden med CRISPR-Cas9-baserade konkurrens analyser

Gene perturbation studies have been extensively used to investigate the role of individual genes in AML pathogenesis. For achieving complete gene ...

Yeast As a Chassis for Developing Functional Assays to Study Human P53

Jäst som chassi för att utveckla funktionella analyser för att studera humant p53

The finding that the well-known mammalian P53 protein can act as a transcription factor (TF) in the yeast S. cerevisiae has allowed for the development of ...

Characterization of the Effects of Migrastatic Inhibitors on 3D Tumor Spheroid Invasion by High-resolution Confocal Microscopy

Karakterisering av effekterna av Migrastatiska hämmare på 3D-tumör spheroid invasion av högupplöst Konfokal mikroskopi

Drug discovery and development in cancer research is increasingly being based on drug screens in a 3D format. Novel inhibitors targeting the migratory and ...

Combined Use of Tail Vein Metastasis Assays and Real-Time In Vivo Imaging to Quantify Breast Cancer Metastatic Colonization and Burden in the Lungs

Kombinerad användning av Stjärtvenmetastaser-analyser och real tids in vivo-avbildning för att kvantifiera bröst cancer metastaserande kolonisering och börda i lungorna

Metastasis is the main cause of cancer-related deaths and there are limited therapeutic options for patients with metastatic disease. The identification ...

Assessing Cellular Target Engagement by SHP2 (PTPN11) Phosphatase Inhibitors

Assessing Cellular Target Engagement by SHP2 PTPN11 Phosphatase Inhibitors

Bedöma cellulära Target Engagement av SHP2 (PTPN11) Fosfatashämmare

The Src-homology 2 (SH2) domain-containing phosphatase 2 (SHP2), encoded by the PTPN11 proto-oncogene, is a key mediator of receptor tyrosine kinase ...

Identification of EGFR and RAS Inhibitors using Caenorhabditis elegans

Identification of EGFR and RAS Inhibitors using Caenorhabditis elegans

Identifiering av EGFR- och RAS-hämmare med Caenorhabditis elegans

The changes in the plasma membrane localization of the epidermal growth factor receptor (EGFR) and its downstream effector RAS have been implicated in ...