Name: assays for validating histone acetyltransferase inhibitors
Uploaded: 2020-08-06T15:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assays for Validating Histone Acetyltransferase Inhibitors at JoVE.com

Bu çalışma James ve Esther King Biyomedikal Araştırma Programı (6JK03 ve 20K07) ve Bankhead-Coley Kanser Araştırma Programı (4BF02 ve 6BC03), Florida Sağlık Bakanlığı, Florida Meme Kanseri Vakfı ve UF Sağlık Kanser Merkezi hibe tarafından desteklenmiştir. Ayrıca, dr Zachary Osking ve Dr Andrea Lin yayın sürecinde destek için teşekkür etmek istiyorum.

1. In vitro HAT istif
<ol><li>Arabellek hazırlığı NOT: Tampon tarifleri için Tablo 1'e bakınız.<ol>
<li>5x teşbi arabellek ve 6x Sodyum Dodecyl Sülfat (SDS) hazırlayın ve -20 °C'de saklayın. Aliquot SDS 1 mL aliquots içinde.</li>
		<li>10x SDS jel çalışan tampon ve 10x TBST hazırlayın ve oda sıcaklığında saklayın.</li>
		<li>1x transfer tamponu hazırlayın ve 4 °C'de saklayın. DİkKAT: Bu protokolde kullanılan tüm kimyasallar için güvenlik veri say...

Lizin asetiltransferazlar (KATs) histon kuyrukları ve transkripsiyon faktörleri gen transkripsiyondüzenlemekiçin çeşitli lizin kalıntıları asetit 2,3. Son yirmi yılda yapılan çalışmalar, CBP/p300, PCAF ve GCN5 gibi KAT'ların onkojenik transkripsiyon faktörleri ile etkileşime girdiği ve çeşitli solid tümör tiplerinde tümör büyümesini artırmaya yardımcı olduğunu ortaya koymuştur4,5<...

Lizin asetiltransferazlar (KATs) hem histon hem de histon olmayan proteinler11,2,3,4lizin kalıntılarının asetilasyon katalaz. Son araştırmalar KATs ve asetiltransferaz fonksiyonu katı tümör büyümesini teşvik edebilir ortaya koymaktadır4,5,6,7,8,9. Örneğin, CREB bağlayıcı protein (CBP)/p300 kanser çok sayıda sinyal yollarını düzenleyen iki paralog KATsvardır 2,3. CBP/ p300 iyi histon asetiltransferaz karakterize var (HAT) fonksiyonu ve histon katalize 3 Lizin 27 asetilasyon (H3K27ac)2,4,5,10,11, aktif arttırıcılar için önemli bir belirteç, organizatör bölgeleri ve aktif gen transkripsiyon12,13,,14. CBP/p300, mitaşlar ve diğer transkripsiyon faktörlerinin asetilasyonu ile onkogenlerin transkripsiyonaktik tarafından katı tümörlerde pro-büyüme sinyal yolları için kritik ko-aktivatörler olarak hizmetvermektedir 4,9,15,16,17,18. Tümör ilerlemesindeki rollerinden dolayı, CBP/p300 ve diğer KAT'ler onkojenik fonksiyonlarını engelleyen yeni inhibitörlerin gelişimi için araştırma altındadır4,5,6,7,8,9,18,19,,20. A-485 ve GNE-049 CBP/p3004için güçlü ve spesifik inhibitörleri geliştirmek için iki başarılı girişimleri temsil,9. Ek inhibitörleri şu anda CBP/p300 ve diğer KATs için soruşturma altındadır.
Daha önce açıklanan KAT inhibitörlerinin (KATi) kalitesi sorgulanıyor, birçok inhibitör hedef etkileri ve kötü karakterizasyonu gösteren21. Bu nedenle, yeni ilaç adaylarının titiz karakterizasyonu ve doğrulanması yüksek kaliteli kimyasal probların geliştirilmesi için gereklidir. Burada özetlenen tarama için bir boru hattı oluşturan ve titizlikle potens ve yeni KATi özgüllüğü doğrulayan üç protokolleri, HAT fonksiyonu inhibe belirli bir odak ile (HATi) KATs. CBP/p300 ve inhibitörleri örnek olarak kullanılır, ancak bu protokoller HATfonksiyonu7 olan diğer KAT'lar için uyarlanabilir.
İlk protokol, kontrollü test tüpü reaksiyonunda saflaştırılmış rekombinant p300 ve histones kullanan in vitro histone asetilea (HAT) testidir. Bu testi gerçekleştirmek kolaydır, maliyet-etkindir, bileşikleri düşük iş ortamında taramak için kullanılabilir ve radyoaktif maddeler gerektirmez. Bu protokolde, rekombinant p300 kısa bir kuluçka döneminde histon kuyruklarında lizin asetilasyonunu katalizler ve histon asetilasyon düzeyleri standart immünoblotlama prosedürleri kullanılarak ölçülür. Enzimatik reaksiyon histon asetilasyonu azaltan bileşikleri taramak için CBP/p300 inhibitörlerinin varlığında veya yokluğunda gerçekleştirilebilir. Ayrıca, HAT tsay yeni bileşikler CBP / p300 için seçici olup olmadığını doğrulamak için pcaf gibi diğer saflaştırılmış KATs karşı faaliyetlerini değerlendirerek kullanılabilir. HAT tsay, basitliği, düşük maliyeti ve bir inhibitörün gücünü/seçiciliğini belirleme yeteneği nedeniyle yeni inhibitörleri araştırmak için mükemmel bir başlangıç noktasıdır. Nitekim, bu protokol genellikle bir in vitro ekran5,,10olarak literatürde kullanılır. Ancak, HAT testinde tanımlanan inhibitörler hücre kültüründe her zaman etkili değildir, çünkü bir test tüpü reaksiyonu yaşayan bir hücre sisteminden çok daha basittir. Bu nedenle, hücre kültürü deneylerinde inhibitörleri daha fazla karakterize etmek esastır22,23.
Boru hattındaki ikinci protokol Kromatin Hiperasetilasyon İnhibisyonu (ChHAI) tetkiktir. Bu hücre bazlı test histon deasetilaz inhibitörleri kullanır (HDACi) bir HATi ile co-kuluçka önce kromatin histones hiperacetylate bir araç olarak24. Bazal histon asetilasyon hücre kültüründe düşük olabilir, zor asetilasyonu artırmak için bir HDACi eklenmesi olmadan immünoblotting yoluyla probe yapmak. ChHAI tsay amacı HDAC inhibisyonu neden histon asetilasyon artışı zayıflatmak yeni HATi belirlemektir. Bu testin avantajları düşük maliyet, göreceli performans kolaylığı ve test tüpü HAT testi daha fizyolojik alaka sağlar kültür, hücrelerin kullanımı içerir. HAT testindeki benzer şekilde, bu protokol veri toplama için standart immünoblotlama kullanır.
HAT ve ChHAI tahlilleri, küresel histon asetilasyonu inhibe etmek için yeni bileşiklerin potens hakkında veri sağlamak, ancak bu bileşiklerin belirli genomik bölgelerde modifikasyonları nasıl etkilediği hakkında fikir vermez. Bu nedenle son protokol olan Chromatin İmmünopan-nicel Polimeraz Zincir Reaksiyonu (ChIP-qPCR) genomun belirli bölgelerindeki DNA-protein etkileşimlerini araştıran bir hücre kültürü deneyidir. ChIP protokolünde, kromatin DNA-protein etkileşimlerini korumak için çapraz bağlanır. Kromatin daha sonra hücrelerden çıkarılır ve DNA-protein kompleksi ilgi proteini için selektif immünoprebata uğrar (örn. H3K27ac'a özgü bir antikor kullanılır). DNA daha sonra saflaştırılır ve qPCR kullanılarak analiz edilir. Örneğin, ChIP-qPCR yeni bir HATi'nin siklin D125gibi bireysel onkojenlerde histon asetiyonu aşağı yasedip düzenlemedığını belirlemek için kullanılabilir. ChIP-qPCR alanında kullanılan yaygın bir teknik olmakla birlikte,4,10,,26optimize etmek zor olabilir. Bu protokol, ChIP-qPCR yordamını gerçekleştirirken oluşabilecek olası tuzakları önlemek için ipuçları sağlar ve veriler üzerinde gerçekleştirilmesi gereken kalite kontrol denetimleri içerir.
Birlikte kullanıldığında, bu üç protokol leri sıkı karakterizasyonu ve roman HATi doğrulama sağlar. Ayrıca, bu yöntemler gerçekleştirmek kolay, nispeten ucuz ve küresel yanı sıra bölgesel histon asetilasyon veri sağlamak, çünkü birçok avantaj sunuyoruz.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 ml tube</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td>For all methods</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm dish</td>
			<td>Sarstedt AG &#38; Co.</td>
			<td>83.3902</td>
			<td>For cell culture of MCF-7 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 ul tips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-707-454</td>
			<td>For all Methods</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 ul tips</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4846</td>
			<td>For all Methods</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X Glycine buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Method 3. See Table 1 for recipe.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X Running Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Methods 1 and 2. See Table 1 for recipe.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X TBST</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Methods 1 and 2. See Table 1 for recipe.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3513</td>
			<td>For Method 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 cm dish</td>
			<td>Sarstedt AG &#38; Co.</td>
			<td>83.3903</td>
			<td>For Method 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml conical tube</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-200249</td>
			<td>For Methods 2 and 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X TBST with 5% milk and 0.02% Sodium Azide</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Methods 1 and 2. Can be used to dilute primary antibodies that will be used more than once. Allows for short-term storage of primary antibody dilutions. Do not use for secondary antibody diluton. CAUTION: Sodium Azide is toxic.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X TBST with 5% milk</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Methods 1 and 2. Used to block PVDF membrane and for antibody diltions. See Table 1 for recipe.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 ul tips</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4844</td>
			<td>For all Methods</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3148</td>
			<td>for SDS sample buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-20% polyacrylamide gel</td>
			<td>Thermo Fisher: Invitrogen</td>
			<td>XP04205BOX</td>
			<td>For Methods 1 and 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5X Assay buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Method 1. See Table 1 for recipe.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5X Passive lysis buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Method 2. See Table 1 for recipe.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6X Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Methods 1 and 2. See Table 1 for recipe.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A-485</td>
			<td>MedChemExpress</td>
			<td>HY-107455</td>
			<td>CBP/p300 Inhbitor for use in Methods 2 and 3. Dissolved in DMSO.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetyl-CBP(K1535)/p300(K1499) antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>4771</td>
			<td>For Method 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetyl-CoA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2056</td>
			<td>for use in Method 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetyl-Histone H3 (Lys 27) antibody (H3K27ac)</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>CST 8173</td>
			<td>antoibodies for H3K27ac for immunoblots and ChIP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetyl-Histone H3 (Lys18) antibody (H3K18ac)</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>CST 9675</td>
			<td>antoibodies for H3K18ac for immunoblots and ChIP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>alpha tubulin antibody</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>T5168</td>
			<td>For Method 2. Dilute 1:20,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anacardic acid</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td>13144</td>
			<td>For Method 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse IgG HRP linked secondary antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>7076</td>
			<td>For Methods 1 and 2. Dilute 1:10,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-rabbit IgG secondary antibody</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>711-035-152</td>
			<td>For Methods 1 and 2. Dilute 1:10,000 to 1:20,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoradiography film</td>
			<td>MIDSCI</td>
			<td>BX810</td>
			<td>For Methods 1 and 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Belly Dancer Rotating Platform</td>
			<td>Stovall Life Science Incorporated</td>
			<td>not available</td>
			<td>For Methods 1 and 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Calf Serum (BCS)</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30072.03</td>
			<td>cell culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2153</td>
			<td>for buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol Blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B0126</td>
			<td>for SDS sample buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CDTA</td>
			<td>Spectrum Chemical</td>
			<td>125572-95-4</td>
			<td>For buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cell scraper</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>CLS3010</td>
			<td>For Method 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChIP dilution buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Method 3. See Table 1 for recipe.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChIP Elution Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Method 3. See Table 1 for recipe.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete DMEM for MCF-7 Cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Methods 2 and 3. See Table 1 for recipe.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Covaris 130 &#181;l microTUBE</td>
			<td>Covaris</td>
			<td>520045</td>
			<td>Sonication tube for use with Covaris S220 in Method 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Covaris S220 Focused-ultrasonicator</td>
			<td>Covaris</td>
			<td>S220</td>
			<td>DNA sonicator for use in Method 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>41639</td>
			<td>for drug dilution and vehicle control treatment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>43815</td>
			<td>for SDS sample buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-013-CV</td>
			<td>cell culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP120-1</td>
			<td>for buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Example transfer tank and transfer apparatus</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>1704070</td>
			<td>For Methods 1 and 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EZ-Magna ChIP A/G Chromatin Immunoprecipitation Kit</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>17-10086</td>
			<td>For Method 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FK228 (Romidepsin)</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td>128517-07-7</td>
			<td>HDAC Inhibitor for use in Method 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F8775</td>
			<td>for cell fixation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glycerol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP229-1</td>
			<td>For buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glycine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7126</td>
			<td>for buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>54457</td>
			<td>for buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High salt wash buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Method 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IGEPAL (NP-40)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I3021</td>
			<td>for buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilon Chemiluminescent HRP Substrate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>WBKLS0500</td>
			<td>For Methods 1 and 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP366-500</td>
			<td>for buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LiCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L9650</td>
			<td>For buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LiCl wash buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Method 3. See Table 1 for recipe.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low salt wash buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Method 3. See Table 1 for recipe.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic Separator</td>
			<td>Promega</td>
			<td>Z5341</td>
			<td>For use in Method 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>494437</td>
			<td>For buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini gel tank</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A25977</td>
			<td>For Methods 1 and 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS-275 (Entinostat)</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td>209783-80-2</td>
			<td>HDAC Inhibitor for use in Method 2. Dissolved in DMSO.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>7647-14-5</td>
			<td>for buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S318-100</td>
			<td>for buffer preparation in Methods 1 and 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Rabbit IgG</td>
			<td>Bethyl Laboratories</td>
			<td>P120-101</td>
			<td>Control rabbit antibody for use in Method 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclei swelling buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Method 3. See Table 1 for recipe.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR Cleanup Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28104</td>
			<td>For use in Method 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin 100X</td>
			<td>Corning</td>
			<td>30-002-CI</td>
			<td>cell culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td>For Methods 2 and 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>80635</td>
			<td>for buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>powdered milk</td>
			<td>Nestle Carnation</td>
			<td></td>
			<td>For Methods 1 and 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power Pac 200 for western blot transfer</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td></td>
			<td>For Methods 1 and 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power Pac 3000 for SDS gel running</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td></td>
			<td>For Methods 1 and 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prestained Protein Ladder</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>26616</td>
			<td>For Methods 1 and 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>PI8340</td>
			<td>for use in Method 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein A Magentic Beads</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>S1425S</td>
			<td>For use in Method 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>P8107S</td>
			<td>For use in Method 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTC-100 Programmable Thermal Controller</td>
			<td>MJ Research Inc.</td>
			<td>PTC-100</td>
			<td>For Method 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF Transfer Membrane</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>IEVH00005</td>
			<td>For Methods 1 and 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant H3.1</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>M2503S</td>
			<td>for use in Method 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant p300</td>
			<td>ENZO Life Sciences</td>
			<td>BML-SE451-0100</td>
			<td>for use in Method 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SAHA (Vorinostat)</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td>149647-78-9</td>
			<td>HDAC Inhibitor for use in Method 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS lysis buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Method 3. See Table 1 for recipe.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>26628-22-8</td>
			<td>For Methods 1 and 2. CAUTION: Sodium Azide is toxic. See SDS for proper handling.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S233-500</td>
			<td>for buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D6750</td>
			<td>for buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71725</td>
			<td>for SDS sample buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard Heatblock</td>
			<td>VWR Scientific Products</td>
			<td>MPN: 949030</td>
			<td>For Methods 1 and 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Table top centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5417R</td>
			<td>For all methods</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TE buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Method 3. See Table 1 for recipe.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Methods 1 and 2. See Table 1 for recipe.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichostatin A</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td>58880-19-6</td>
			<td>HDAC Inhibitor for use in Method 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP152-5</td>
			<td>for buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td>for buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9005-64-5</td>
			<td>for buffer preparation in Methods 1 and 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-ray film processor</td>
			<td>Konica Minolta Medical &#38; Graphic, Inc.</td>
			<td>SRX-101A</td>
			<td>For Methods 1 and 2</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assays for validating histone acetyltransferase inhibitors

Lizin asetiltransferazlar (KATs) kromatin dinamiklerini ve gen ekspresyonunu düzenlemek için histones ve diğer proteinler üzerindeki lizin kalıntılarının asetilasyonını katalizler. CBP/p300 gibi KAT'lar, çeşitli kanserlerin tümörigenezindeki kritik rollerinden dolayı terapötik hedefler olarak yoğun bir araştırma altındadır. KAT'ların histon asetiltransferaz (HAT) fonksiyonunu hedefleyen yeni küçük molekül inhibitörlerinin geliştirilmesi zordur ve potansiyel inhibitörlerin özgüllüğünü ve gücünü doğrulayabilen sağlam tahliller gerektirir.
Bu makalede, yeni HAT inhibitörleri (HATi) için titiz in vitro doğrulama sağlayan üç yöntemden oluşan bir boru hattı özetlenmiştir. Bu yöntemler arasında test tüpü HAT testi, Kromatin Hiperasetilasyon İnhibisyonu (ChHAI) testi ve Kromatin İmmünen-kantitatif PCR (ChIP-qPCR) sayılabilir. HAT testinde, rekombinant HAT'ler bir test tüpü reaksiyonunda histones ile kuluçkaya yatırılır, histon kuyruklarında spesifik lizin kalıntılarının asetilasyonuna izin verilir. Bu reaksiyon bir HATi ile engellenebilir ve bölgeye özgü histon asetilasının göreceli düzeyleri immünoblotting ile ölçülebilir. HAT satoyonunda tanımlanan inhibitörlerin hücresel ortamda doğrulanmaları gerekir.
ChHAI testi, histon deasetilaz inhibitörü (HDACi) tarafından indüklenen histones'un sağlam hiperasetilasyonunun zayıflatılan yeni HATi'yi taramak için immünolotlama kullanır. Histon asetilasyonunun bazal düzeylerini immünoblotting yoluyla tespit etmek zor olabilir, çünkü bir HDACi eklenmesi yararlıdır.
HAT ve ChHAI tahlilleri histon asetilasyonundaki küresel değişiklikleri ölçer, ancak spesifik genomik bölgelerde asetilasyon hakkında bilgi vermez. Bu nedenle, ChIP-qPCR gen düzenleyici elementlerde histon asetilasyon düzeyleri üzerinde HATi etkilerini araştırmak için kullanılır. Bu histon-DNA komplekslerinin selektif immünopresidasyon ve qPCR ile saflaştırılmış DNA analizi ile gerçekleştirilir. Birlikte, bu üç tahliller özgüllük, potens ve roman HATi eylem mekanizması dikkatli doğrulama için izin verir.

In vitro histon asetiltransferaz (HAT) tsuraj ı, p300 HAT aktivitesini histon substrata doğru inhibe eden bileşikleriçin prob için kullanılabilir. Şekil 1A, HAT tsurciçin deneysel bir şema sağlar. Anakardik asit, bilinen BIR HATi3,38, 12.5-100 μM arasında bir konsantrasyon aralığında bu titretinde kullanılmıştır. 100 μM'de, anakardik asit histon 3, Lizinler 9 ve 18'de histon asetilasyonunu katalize eder (<strong c...

Watch this Scientific Journal Video about Assays for Validating Histone Acetyltransferase Inhibitors at JoVE.com

Assays for Validating Histone Acetyltransferase Inhibitors

Histon asetiltransferaz inhibitörleri (HATs, ayrıca lizin asetiltransferazolarak da bilinir), CBP/p300 gibi, kanser tedavisi için potansiyel tedavi vardır. Ancak, bu inhibitörleri doğrulamak için sıkı yöntemler gereklidir. Doğrulama için üç in vitro yöntem rekombinant asetiltransferazlar ile HAT tahlilleri dahil, hücre kültüründe histon asetilasyon için immünoblot, ve ChIP-qPCR.

Histon Asetiltransferaz Inhibitörlerinin Doğrulanması için tahliller

Lysine acetyltransferases (KATs) catalyze acetylation of lysine residues on histones and other proteins to regulate chromatin dynamics and gene ...

Bu protokoller önemli araştırma araçları ve potansiyel terapötikler olan yeni HAT inhibitörlerinin gücünü ve seçiciliğini doğrulamak için ayrıntılı adımlar sağladıkları için önemlidir. Bu videoda gösterilen teknikleri gerçekleştirmek kolaydır ve küresel ve bölgesel histon asetilasyonu üzerine HAT inhibitörleri etkileri hakkında bilgi sağlar. Gen ekspresyonunun epigenetik düzenlemesini anlamalarını mümkün kılarlar.Detaylara dikkat çok önemlidir. Protokolleri adım adım takip etmek önemlidir. El yazması talimatlara göre 0,2 mililitrelik bir PCR tüp içinde 10 mikrolitre hacimde enzimatik reaksiyon hazırlayarak başlayın.Daha sonra tam reaksiyon karışımını 30 santigrat derecede bir PCR termal döngüde bir saat kuluçkaya yatırın. Bu arada, 6X SDS örnek tampon bir ila 10 oranında iki mercaptoethanol ekleyin. PCR termal döngücüden numuneleri çıkarın ve her reaksiyon karışımına hazırlanan SDS numune arabelleğinden iki mikrolitre ekleyin.Numuneleri bir ısı bloğunda beş dakika boyunca 95 dereceye ısıtın, sonra buzda soğutun. Örnekleri eksi 20 veya eksi 80 santigrat derecede saklayın veya jel elektroforezi ve immünoblotting ile devam edin. Tohum 100, 000 MCF-7 hücreleri hücre kültürü orta bir mililitre içinde 12-iyi plaka her kuyuiçine ve hücrelerin% 80-90 biraraya büyümeye izin.Hücreler istenilen biraraya ulaştığında, hücre kültürü ortamını dört, beş ve altı kuyulardan aspiratve pipet bir mililitre üç mikromolar MS275'in her kuyuya orta olarak yerleştirin. Daha sonra hücre kültürünü bir, iki ve üç kuyulardan aspire edin ve pipet bir mililitre seyreltilmiş DMSO'yu her kuyuya aspire edin. MS275'e maruz kalan hücrelerde asetillenmiş histones birikimine izin vermek için hücreleri dört saat boyunca kuvöze geri verin.Hücreler kuluçkaya yatarken, el yazması yönlere göre DMSO'da A-485 seyreltmelerini hazırlayın. Kuluçka bittiğinde, kuyulardan orta aspire ve seyreltme ekleyin. Hücreleri kuvöze geri döndürün ve 20 saat boyunca kültürlendirin, sonra hücre kültür ortamını kuyulardan aspire edin ve hücreleri bir mililitre PBS ile yıkayın.PBS aspire ve pasif lysis tampon 100 mikrolitre ekleyin. Plakayı bir gecede eksi 80 derecede saklayın. Pipet 100 mikrolitre dmso ile tedavi edilen hücrelerden iki 1,5 mililitrelik tüpler halinde, daha sonra pipet 400 mikrolitre ChIP seyreltme tampon her tüp için toplam hacmi 500 mikrolitreye kadar getirmek için.Çözeltinin beş mikrolitresini tüplerden çıkarın ve DMSO girişi olarak eksi 20 derecede saklayın. Aynı şekilde A-485 ile tedavi hücrelerden sonicated kromatin ile iki tüp hazırlayın. DMSO ve A-485 örneklerine IgG ve H3K27 asetil antikorları eklemek için bir pipet kullanın.Sonra her tüpe 20 mikrolitre protein ekleyin Bir manyetik boncuk, boncukların iyice askıya alınmasını sağlamak. Örnekleri bir gecede dört santigrat derecede döndürün. Pelet protein Manyetik ayırıcı kullanarak manyetik boncuklar ve boncukrahatsız etmeden supernatant kaldırın.Boncukları 500 mikrolitre ile bir mililitre düşük tuz yıkama tamponu ile yıkayın ve dört santigrat derecede beş dakika döndürün. Hızlı bir spin aşağı gerçekleştirin, bir manyetik ayırıcı ile boncuk pelet ve supernatant kaldırın. Yüksek tuz yıkama tamponu, lityum klorür yıkama tamponu ve TE tamponu ile yıkama işlemini tekrarlayın.TE tamponu ile yıkadıktan sonra, giriş örneklerini dondurucudan çıkarın ve buza koyun. Proteinaz K'nin bir aliquot'unu eritin, sonra da manyetik ayırıcı kullanarak boncukları peletleyip TE tamponu boncuklardan çıkarın. Giriş örnekleri de dahil olmak üzere her numuneye 100 mikrolitre ChIP elüsyon tamponu ve bir mikrolitre proteinaz K ekleyin ve bir termocycler kullanarak 62 derecede sallayarak iki saat boyunca tüplü olarak inkülersiniz.Kuluçkadan sonra numuneleri 10 dakika boyunca 95 dereceye ısıtın, ardından oda sıcaklığında soğutun. Manyetik ayırıcı ile manyetik boncukpelet ve yeni bir 1.5 mililitrelik tüp için DNA içeren supernatant aktarın. Standart bir PCR temizleme kiti kullanarak DNA'yı arındırın ve qPCR çalıştırın.In vitro histon asetiltransferaz tsay bir histon substrat doğru p300 HAT aktivitesi üzerinde anakardik asit etkisini araştırmak için kullanılmıştır. Bir konsantrasyon aralığı test edildi ve asetil-CoA negatif kontrol reaksiyonuna eklenmedi. İmmünoblot sonuçları ImageJ ile ölçüldü, DMSO kontrolüne göre 100 mikromolar anakardik asitte asetil H3K18 ve asetil H3K9'da belirgin bir azalma görüldü.Kromatin hiper-asetilasyon inhibisyonu tetkikinde, McF-7 hücrelerinin HDACi MS275 ile tedavisi histonin insetazasyonu 3'ün çeşitli lizin kalıntıları üzerinde güçlü bir şekilde yükseltilmesi. Asetil H3K18 ve asetil H3K27 bazal düzeyleri düşüktü, ChHAI tsay bir HDACi eklemenin faydalarını gösteren. MS275 ile tedavi edilen hücrelerde A-485 eklenmesi H3K18 ve H3K27'de artmış histon asetiyonu zayıflatır, ancak H3K9'u zayıflatmamaktadır.İmmünoblot sonuçları da ImageJ ile ölçüldü. ChIP qPCR onkogen ekspresyonu kontrol gen düzenleyici elemanları nda HAT inhibitörleri etkilerini araştırmak için kullanılmıştır. DMSO örneğinde, IgG kontrol antikortarafından çökeltilen DNA siklin D1 organizatörü için qPCR reaksiyonunda asetil H3K27 antikordan daha yüksek bir Ct değeri üretti, spesifik olmayan IgG kontrolünün promotördeki asetil H3K27 spesifik antikordan daha az DNA histon komplekslerine çöktüğünü gösteriyor.DMSO kontrolü ile karşılaştırıldığında, A-485 siklin D1 organizatörü nde asetil H3K27 zenginleştirme azaltılmış. Daha da önemlisi, A-485 hücre kültüründe asetil H3K27 önemli ölçüde azaltmak bilinmektedir. Bu protokolü denerken, in vitro HAT ve ChHAI testlerinin kuluçka öncesi adımlarının gerekli olduğunu ve unutulmaması gerektiğini unutmayın.Ayrıca giriş örneklerini kaydetmeyi ve ChIP sırasında boncuk kaybını önlemeyi unutmamak da önemlidir. Bu prosedürleri uyguladıktan sonra, ChIP-seq tüm genom için düzenleyici elementlerde histon asetilasyonu hakkında küresel bilgi elde etmek için yürütülebilir ek bir yöntemdir. Bu protokoller bilim adamları için dikkatle yeni HAT inhibitörleri doğrulamak ve literatürde düşük kaliteli kimyasal problar yayınlamaktan kaçınmak için yararlıdır.Doğrulanmış HAT inhibitörleri potansiyel terapötik olarak daha fazla gelişme geçirebilir.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Coculture Assays to Study Macrophage and Microglia Stimulation of Glioblastoma Invasion

Coculture Tahliller Glioblastoma Invasion Makrofaj ve Mikroglia Stimülasyon Eğitim için

Glioblastoma multiforme (grade IV glioma) is a very aggressive human cancer with a median survival of 1 year post diagnosis. Despite the increased ...

Preclinical Assessment of the Bioactivity of the Anticancer Coumarin OT48 by Spheroids, Colony Formation Assays, and Zebrafish Xenografts

Preklinik antikanser Coumarin OT48 pulcuklarının, koloni oluşumu deneyleri ve zebra balığı Xenografts Bioactivity değerlendirilmesi

In vitro and in vivo pre-clinical screening of novel therapeutic agents are an essential tool in cancer drug discovery. Although human cancer cell lines ...

Assessment of Resistance to Tyrosine Kinase Inhibitors by an Interrogation of Signal Transduction Pathways by Antibody Arrays

Direnç Tirozin kinaz inhibitörleri sinyal iletim yollarının antikor dizileri tarafından bir sorgulama tarafından değerlendirilmesi

Cancer patients with an aberrant regulation of the protein phosphorylation networks are often treated with the tyrosine kinase inhibitors. Response rates ...

Live-Cell Imaging Assays to Study Glioblastoma Brain Tumor Stem Cell Migration and Invasion

Canlı hücre görüntüleme deneyleri için çalışma Glioblastoma Beyin tümör kök hücre göç ve işgali

Glioblastoma (GBM) is an aggressive brain tumor that is poorly controlled with the currently available treatment options. Key features of GBMs include ...

Investigation of Genetic Dependencies Using CRISPR-Cas9-based Competition Assays

CRISPR-Cas9-tabanlı rekabet deneyleri kullanarak genetik bağımlılıkları incelenmesi

Gene perturbation studies have been extensively used to investigate the role of individual genes in AML pathogenesis. For achieving complete gene ...

Yeast As a Chassis for Developing Functional Assays to Study Human P53

Insan p53 çalışma fonksiyonel Assays geliştirmek için bir şasi olarak Maya

The finding that the well-known mammalian P53 protein can act as a transcription factor (TF) in the yeast S. cerevisiae has allowed for the development of ...

Characterization of the Effects of Migrastatic Inhibitors on 3D Tumor Spheroid Invasion by High-resolution Confocal Microscopy

Migrastatik İnhibitörlerin 3Boyutlu Tümör Spheroid İnvazyonu Üzerine Etkilerinin Yüksek Çözünürlüklü Konfokal Mikroskopi Ile Karakterizasyonu

Drug discovery and development in cancer research is increasingly being based on drug screens in a 3D format. Novel inhibitors targeting the migratory and ...

Combined Use of Tail Vein Metastasis Assays and Real-Time In Vivo Imaging to Quantify Breast Cancer Metastatic Colonization and Burden in the Lungs

Kuyruk Ven Metastaz Tahlilleri ve Gerçek Zamanlı Vivo Görüntüleme Kombine Kullanımı Meme Kanseri Metastatik Kolonizasyon ve Yük Akciğerlerde Quantify için

Metastasis is the main cause of cancer-related deaths and there are limited therapeutic options for patients with metastatic disease. The identification ...

Assessing Cellular Target Engagement by SHP2 (PTPN11) Phosphatase Inhibitors

Assessing Cellular Target Engagement by SHP2 PTPN11 Phosphatase Inhibitors

Hücresel Hedef Etkileşiminin SHP2 (PTPN11) Fosfataz Inhibitörleri ile Değerlendirilmesi

The Src-homology 2 (SH2) domain-containing phosphatase 2 (SHP2), encoded by the PTPN11 proto-oncogene, is a key mediator of receptor tyrosine kinase ...

Identification of EGFR and RAS Inhibitors using Caenorhabditis elegans

Identification of EGFR and RAS Inhibitors using Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans kullanılarak EGFR ve RAS inhibitörlerinin tanımlanması

The changes in the plasma membrane localization of the epidermal growth factor receptor (EGFR) and its downstream effector RAS have been implicated in ...