Name: continuous measurement of biological noise in escherichia coli using time-lapse microscopy
Uploaded: 2021-04-27T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Continuous Measurement of Biological Noise in Escherichia Coli Using Time-lapse Microscopy at JoVE.com

نشكر السيد جيل غيلبرت (كلية الهندسة الكهربائية، تكنيون) على مساعدته في قانون MATLAB. نشكر الدكتور Ximing لي (كلية الهندسة الطبية الحيوية ، Technion) للمساعدة في التدقيق في هذه المقالة. تم دعم هذا البحث جزئيا من قبل مؤسسة عائلة نيوباور ووزارة العلوم الإسرائيلية، منحة 2027345.

1. إعداد الإعلام والثقافة
<ol><li>إعداد محلول المخزون من 1000x كاربينسيلين (50 ملغم / مل) أو المضادات الحيوية ذات الصلة.<ol>
<li>. وزن 0.5 غرام من كاربينسيلين. إضافة 10 مل من العقيم H2O. تذوب تماما.</li>
		<li>تعقيم الأسهم كاربينسيلين من خلال مرشح حقنة 0.22 ميكرومتر. Aliquot محلول المضادات الحيوية وتخز...

<ol>
	<li>Daniel, R., Rubens, J. R., Sarpeshkar, R., Lu, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+analog+computation+in+living+cells.">Synthetic analog computation in living cells.</a> Nature. 497, 619-623 (2013).</li><li>Yang, X. S. Y., L, A. B., Harwood, C., Jensen, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Imaging Bacterial Molecules, Structures and Cells. , (2016).</li><li>Joyce, G., Robertson, B. D., Williams, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modified+agar+pad+method+for+mycobacterial+live-cell+imaging.">A modified agar pad method for mycobacterial live-cell imaging.</a> Biomedcentral Research Notes. , (2011).</li><li>Cotlet, M., Goodwin, P. M., Waldo, G. S., Werner, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+the+fluorescence+dynamics+of+single+molecules+of+a+green+fluorescent+protein:+One-+versus+two-photon+excitation.">A comparison of the fluorescence dynamics of single molecules of a green fluorescent protein: One- versus two-photon excitation.</a> ChemPhysChem. , (2006).</li><li>Andersen, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+unstable+variants+of+green+fluorescent+protein+for+studies+of+transient+gene+expression+in+bacteria.">New unstable variants of green fluorescent protein for studies of transient gene expression in bacteria.</a> Applied and Environmental Microbiology. 64, 2240-2246 (1998).</li><li>Barger, N., Litovco, P., Li, X., Habib, M., Daniel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+metabolic+computation+in+a+bioluminescence-sensing+system.">Synthetic metabolic computation in a bioluminescence-sensing system.</a> Nucleic Acids Research. , (2019).</li><li>Young, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+single-cell+gene+expression+dynamics+in+bacteria+using+fluorescence+time-lapse+microscopy.">Measuring single-cell gene expression dynamics in bacteria using fluorescence time-lapse microscopy.</a> Nature Protocols. , (2012).</li><li>Swain, P. S., Elowitz, M. B., Siggia, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+and+extrinsic+contributions+to+stochasticity+in+gene+expression.">Intrinsic and extrinsic contributions to stochasticity in gene expression.</a> Proceedings of the National Academy of Science United States. , (2002).</li><li>Elowitz, M. B., Levine, A. J., Siggia, E. D., Swain, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stochastic+gene+expression+in+a+single+cell.">Stochastic gene expression in a single cell.</a> Science. , (2002).</li><li>Baumgart, L., Mather, W., Hasty, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synchronized+DNA+cycling+across+a+bacterial+population.">Synchronized DNA cycling across a bacterial population.</a> Nature Genetics. , (2017).</li><li>Arriaga, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+biological+noise+via+single+cell+analysis.">Determining biological noise via single cell analysis.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. , (2009).</li><li>Nielsen, A. A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+circuit+design+automation.">Genetic circuit design automation.</a> Science. , (2016).</li><li>Ozbudak, E. M., Thattai, M., Kurtser, I., Grossman, A. D., van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+noise+in+the+expression+of+a+single+gene.">Regulation of noise in the expression of a single gene.</a> Nature Genetics. 31, 69-73 (2002).</li><li>Pedraza, J. H., Van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noise+propagations+in+gene+networks.">Noise propagations in gene networks.</a> Science. , (2005).</li><li>Jennifer, A. N. B., Christopher, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+genetic+circuit+design.">Principles of genetic circuit design.</a> Nature Methods. , (2014).</li><li>Aoki, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+universal+biomolecular+integral+feedback+controller+for+robust+perfect+adaptation.">A universal biomolecular integral feedback controller for robust perfect adaptation.</a> Nature. , (2019).</li><li>Hanna, H. A., Danial, L., Kvatinsky, S., Daniel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cytomorphic Electronics with Memristors for Modeling Fundamental Genetic Circuits. 4545, (2020).</li><li>de Jong, I. G., Beilharz, K., Kuipers, O. P., Veening, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+cell+imaging+of+Bacillus+subtilis+and+Streptococcus+pneumoniae+using+automated+time-lapse+microscopy.">Live cell imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using automated time-lapse microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2011).</li><li>Eling, N., Morgan, M. D., Marioni, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+in+measuring+and+understanding+biological+noise.">Challenges in measuring and understanding biological noise.</a> Nature Reviews Genetics. , (2019).</li><li>Thattai, M., Van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Attenuation+of+noise+in+ultrasensitive+signaling+cascades.">Attenuation of noise in ultrasensitive signaling cascades.</a> Biophysical Journal. , (2002).</li><li>Thattai, M., Van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+noise+in+gene+regulatory+networks.">Intrinsic noise in gene regulatory networks.</a> Proceedings of the National Academy of Science United States. , (2001).</li><li>Rosenfeld, N., Young, J. W., Alon, U., Swain, P. S., Elowitz, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+regulation+at+the+single-cell+level.">Gene regulation at the single-cell level.</a> Science. , (2005).</li><li>Van Der Ziel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Noise in Measurements. , (1976).</li><li>Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+cloning:+A+laboratory+manual.+2nd+Edition.">Molecular cloning: A laboratory manual. 2nd Edition.</a> Cold Spring Harbor Laboratory Press. , (1989).</li><li>Carpenter, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CellProfiler:+Image+analysis+software+for+identifying+and+quantifying+cell+phenotypes.">CellProfiler: Image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes.</a> Genome Biology. , (2006).</li><li>Paintdakhi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oufti:+An+integrated+software+package+for+high-accuracy,+high-throughput+quantitative+microscopy+analysis.">Oufti: An integrated software package for high-accuracy, high-throughput quantitative microscopy analysis.</a> Molecular Microbiology. , (2016).</li><li>Ducret, A., Quardokus, E. M., Brun, Y. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicrobeJ,+a+tool+for+high+throughput+bacterial+cell+detection+and+quantitative+analysis.">MicrobeJ, a tool for high throughput bacterial cell detection and quantitative analysis.</a> Nature Microbiology. , (2016).</li><li>Stylianidou, S., Brennan, C., Molecular, S. B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> SuperSegger: robust image segmentation, analysis and lineage tracking of bacterial cells - Stylianidou - 2016 - Molecular Microbiology. , (2016).</li><li>Balomenos, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image+analysis+driven+single-cell+analytics+for+systems+microbiology.">Image analysis driven single-cell analytics for systems microbiology.</a> Biomedcentral System Biology. , (2017).</li><li>Smit, J. H., Li, Y., Warszawik, E. M., Herrmann, A., Cordes, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colicoords:+A+Python+package+for+the+analysis+of+bacterial+fluorescence+microscopy+data.">Colicoords: A Python package for the analysis of bacterial fluorescence microscopy data.</a> PLoS One. , (2019).</li><li>Guido, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bottom-up+approach+to+gene+regulation.">A bottom-up approach to gene regulation.</a> Nature. , (2006).</li><li>Beal, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signal-to-noise+ratio+measures+efficacy+of+biological+computing+devices+and+circuits.">Signal-to-noise ratio measures efficacy of biological computing devices and circuits.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. , (2015).</li><li>Marr, D., Hildreth, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Theory+of+edge+detection.">Theory of edge detection.</a> Proceedings of the Royal Society - Biology Science. 207, 187-217 (1980).</li><li>Otsu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Threshold+selection+method+from+gray-level+histograms.">Threshold selection method from gray-level histograms.</a> IEEE Transactions Systems Man Cybernetics. , (1979).</li><li>Soille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Morphological Image Analysis: Principles and Applications, Second edition. , (2000).</li><li>Bradley, D., Roth, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptive+Thresholding+using+the+Integral+Image.">Adaptive Thresholding using the Integral Image.</a> Journal of Graphics Tools. , (2007).</li><li>Meyer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topographic+distance+and+watershed+lines.">Topographic distance and watershed lines.</a> Signal Processing. , (1994).</li><li>Maurer, C. R., Qi, R., Raghavan, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+linear+time+algorithm+for+computing+exact+Euclidean+distance+transforms+of+binary+images+in+arbitrary+dimensions.">A linear time algorithm for computing exact Euclidean distance transforms of binary images in arbitrary dimensions.</a> IEEE Transactions on Pattern Analysis and Machine. , (2003).</li><li>Millo, R., Phillips, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+is+the+maturation+time+for+fluorescent+proteins.">What is the maturation time for fluorescent proteins.</a> Cell Biology by Numbers. , (2015).</li></ol>

في هذا العمل، قمنا بتطوير بروتوكول يمكن تتبع الكمبيوتر من الخلايا الحية الإشريكية القولونية، بعد مستويات الانقسام والفلورسنت على مدى فترة من الساعات. يسمح لنا هذا البروتوكول بتحديد الديناميكيات العشوائية للدوائر الجينية في الإشريكية القولونية من خلال قياس السيرة الذاتية وSNR ?...

علم الأحياء التركيبي هو مجال متعدد التخصصات ظهر في العقد الماضي ويهدف إلى ترجمة مبادئ التصميم الهندسي إلى تصميم بيولوجي عقلاني1،2،3 ،فيمحاولةلتحقيق التكامل والمعالجة متعددة الإشارات في الخلايا الحية لفهم العلوم الأساسية4و5والتطبيقات التشخيصية والعلاجية والتكنولوجيا الحيوية6و7و8و9و10. لقد أحدثت قدرتنا على قياس استجابة المدخلات والمخرجات من دوائر الجينات الاصطناعية ثورة بسبب التقدم الأخير في تكنولوجيا الخلية الواحدة ، بما في ذلك محلل التدفق وتصوير الخلايا الحية باستخدام المجهر الآلي الفاصل الزمني11. غالبا ما يستخدم محلل التدفق لقياس استجابة هذه الدوائر في الحالة الثابتة1،12، ويستخدم المجهر المقلوب لقياس الاستجابة الديناميكية للدوائر الجينية الاصطناعية على مستوى خلية واحدة3. على سبيل المثال، واحدة من الأعمال المبكرة في البيولوجيا الاصطناعية تنطوي على بناء شبكات المذبذب الجيني في الخلايا الحية باستخدام حلقات التغذية المرتدة السلبية مع تأخير3. في وقت لاحق ، تم تطبيق دوائر المذبذب الجيني لفهم التحكم الأيضي في البيئة الديناميكية للخلايا الحية4. المجهر الآلي الفاصل الزمني هو أحد الطرق لتوصيف مثل هذه الدوائر. نحن نفترض أن الخلايا المضيفة، الإشريكية القولونية،مزامنة عند تشكيل المستعمرات الصغيرة، مما يسمح لقياس إشارة وحساب الضوضاء دون تتبع العلاقات الدقيقة الأم وابنتها.
الضوضاء هي أحد الجوانب الأساسية المتأصلة في النظم البيولوجية التي تنشأ في كثير من الأحيان من مصادر متعددة. النظر على سبيل المثال، التفاعلات الكيميائية الحيوية التي تنطوي على الإشارات التي تنشأ من نقل ناقلات عشوائية منفصلة مثل نشر البروتينات13. هذه الإشارات تنتشر مع تقلبات عشوائية14. مصادر الضوضاء الأخرى هي توافر الموارد، وتقسيم الخلايا والاختلافات في الظروف البيئية مثل درجة الحرارة والرطوبة والضغط. غالبا ما يكون للإشارات البيولوجية التي تنتشر في دوائر الجينات الاصطناعية نسبة إشارة منخفضة جدا إلى الضوضاء (SNR) ، مما يزعج أداء هذه الدوائر. لذلك ، لا يزال تصميم الدائرة الوراثية أحد الجوانب الأكثر تحديا في الهندسة الوراثية15. على سبيل المثال ، على النقيض من معظم النهج التي تحسب فقط متوسط التعبير الجيني (تقاس على مجموع سكان الخلية) ، ويعتبر الفرق في إشارة قياس من أجل هندسة السلوك يمكن التنبؤ بها من خلال شبكات الجينات الاصطناعية12. على هذا النحو ، فإن مستويات التباين أو الضوضاء في التعبير البروتين تلعب دورا مهيمنا في تصميم وأداء الدوائر الجينية التناظرية والرقمية1،16،17.
وقد تم تطوير العديد من النهج لتحديد التباين من خلية إلى خلية، بما في ذلك في الإشريكية القولونية 3،7،18. وغالبا ما تستخدم هذه الأساليب لدراسة تنشيط الجينات ومسارات التمثيل الغذائي، ولكن مع تركيز أقل على دراسة ديناميات الضوضاء العشوائية، مثل قياس وتفكيك مصادر ضوضاء محددة، وخاصة بالنسبة للدوائر الوراثية في الخلايا الحية حيث هذا هو التحدي الأساسي19،20،21. عدة عوامل، سواء الموروثة إلى الدائرة نفسها (الجوهرية) والمستمدة من الخلايا المضيفة (extrinsic)، يمكن أن تعكر صفو الأداء المستمر للدوائر الوراثية. في هذه الورقة ، وضعنا بروتوكولا يهدف إلى تحديد إجمالي الضوضاء في خلايا الإشريكية القولونية ، بما في ذلك مصادر الضوضاء الجوهرية والقشرية6و22. من خلال تحديد إجمالي الضوضاء ومن ثم تقييم SNR23، يمكن تحسين تصميم دوائر الجينات. يمكن تعديل هذه الطريقة لقياس مصادر الضوضاء المستقلة بشكل منفصل ، من خلال مراقبة العديد من البروتينات الفلورية6،20. بالنسبة للبروتوكول الموصوف هنا ، نحافظ على الظروف البيئية تحت رقابة جيدة ونقيس باستمرار نشاط الخلايا دون تأثير العوامل الخارجية. نقيس الإشارة من البروتينات الفلورية في خلايا واحدة مع مرور الوقت ونصورها في وقت واحد تحت ركيزة الآغاروز. يتم تحليل الصور الناتجة باستخدام MATLAB المخصصة للمختبر.
من الناحية المثالية ، فإن القياس المستمر للنشاط في الوقت الحقيقي للبروتينات الفلورية داخل الخلية سينتج بيانات دقيقة من خلال نمو الخلايا وتقسيمها. ومع ذلك، فإنه من الصعب الحصول على هذه البيانات. ويرجع ذلك إلى تدهور البروتينات الفلورية ، والمعروفة باسم تبييض الصور7، عندما يتعرضون للإشعاع في عملية الإثارة. وعلاوة على ذلك، خلايا الإشريكية القولونية هي أيضا حساسة للإثارة، والتي قد تؤدي إلى السمية الضوئية7. وتحد المسألتان من كمية إطارات الصور التي يمكن الحصول عليها والوقت بين عمليات الاستحواذ. الركيزة والأنواع المتوسطة (مثل مرق الليوجيني) التي تستخدم لزراعة الخلايا أثناء التصوير لها أيضا دور حاسم. نوصي بشدة باستخدام الحد الأدنى من الوسط ، مما يقلل من الخلفية غير الفلورية ويطيل وقت تقسيم الخلية.
وعلاوة على ذلك، يجب إعداد العينة بالنظر إلى المتطلبات التالية (1) يسمح انخفاض معدل انقسام الخلايا بالتعرض بشكل أقل تواترا للتصوير عن كثب لدورة التقسيم وتقليل احتمال السمية الضوئية والbleaching. وضعنا وقت الاستحواذ على حوالي نصف وقت الانقسام المتوقع (2) كثافة الخلايا المنخفضة في بداية التجربة تسمح بتوحيد أفضل وتتبع الانقسام. تتأثر كثافة الخلايا بنسبة تخفيف خلايا الإشريكية القولونية، وهي معلمة مهمة لنجاح هذا البروتوكول وتحتاج إلى تحديد لكل مختبر. من أجل تحديد النسبة، ينبغي أن تكون مزودة كل سلالة جديدة من الإشريكية القولونية أو وسائل الإعلام المستخدمة مع الرسوم البيانية معدل النمو(الشكل التكميلي 1). تم تحقيق نسبة مناسبة إذا كانت الخلايا يمكن أن تنمو دون اهتزاز إضافي بعد حضانة قصيرة من كثافة أولية تبلغ حواليOD 600nm = 0.1. سوف تنقسم الخلايا في هذه المرحلة وفقا لدرجة حرارة البيئة فقط (3) تقييد حركة الخلية: حركة الخلية تعتمد بقوة على صلابة الركيزة (لوحة الآغاروز). يعتمد ثبات الركيزة على مقدار إجمالي الآغاروز ووقت التصلب الجلي. لا يمكن ترك المواد الهلامية لترسيخ بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة، كما القولونية Escherichia سيخضع الانقسام. وتشمل العوامل الأخرى التي تؤثر على استقرار الركيزة كمية المياه في العينة والرطوبة. يتم مناقشة قضايا إضافية بالتفصيل في نتائج الممثل. يوفر هذا البروتوكول العديد من التفاصيل وينتقل تدريجيا من خطوة إلى أخرى. يوفر البروتوكول استقرار طويل لتجارب التصوير ويوفر أداة أساسية لمعالجة الصور.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:748px;" width="747">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">35mm glass dish</td>
			<td style="width:216px;">mattek</td>
			<td style="width:137px;">P35G-0.170-14-C</td>
			<td style="width:172px;">thickness corresponding with microscope lense.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Agarose&#160;</td>
			<td style="width:216px;">Lonza</td>
			<td style="width:137px;">5004</td>
			<td>LB preperation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">AHL&#160;</td>
			<td style="width:216px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">K3007</td>
			<td>inducer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Bacto tryptone&#160;</td>
			<td style="width:216px;">BD - Becton, Dickinson and Company&#160;</td>
			<td style="width:137px;">211705</td>
			<td>LB preperation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Carb</td>
			<td style="width:216px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:137px;">10177-012</td>
			<td>antibiotic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Carb</td>
			<td style="width:216px;">Formedium</td>
			<td style="width:137px;">CAR0025</td>
			<td>antibiotic</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Casamino acids&#160;</td>
			<td style="width:216px;">BD - Becton, Dickinson and Company&#160;</td>
			<td style="width:137px;">223050</td>
			<td>minimal media solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">eclipse Ti</td>
			<td style="width:216px;">nikon</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td>inverted microscope</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Glucose</td>
			<td style="width:216px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">G5767</td>
			<td>minimal media solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Glyserol</td>
			<td style="width:216px;">Bio-Lab</td>
			<td style="width:137px;">000712050100</td>
			<td>minimal media substrate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Immersol 518F</td>
			<td style="width:216px;">zeiss</td>
			<td style="width:137px;">4449600000000</td>
			<td>immersion oil</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">M9 salt solution&#160;</td>
			<td style="width:216px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">M6030</td>
			<td>minimal media solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">NaCl</td>
			<td style="width:216px;">Bio-Lab</td>
			<td style="width:137px;">214010</td>
			<td>LB preperation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Noble agar</td>
			<td style="width:216px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">A5431</td>
			<td>minimal media substrate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">parafilm tape</td>
			<td style="width:216px;">Bemis</td>
			<td style="width:137px;">PM-996</td>
			<td>refered to as tape in text</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Seaplaque GTG Agarose</td>
			<td style="width:216px;">Lonza</td>
			<td style="width:137px;">50111</td>
			<td>minimal media substrate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">thaymine B1</td>
			<td style="width:216px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">T0376&#160;</td>
			<td>minimal media solution</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Yeast Extract</td>
			<td style="width:216px;">BD - Becton, Dickinson and Company&#160;</td>
			<td style="width:137px;">212750</td>
			<td>LB preperation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

continuous measurement of biological noise in escherichia coli using time-lapse microscopy

يقدم البروتوكول الذي تم تطويره هنا أداة لتمكين تتبع الكمبيوتر لقسم الإشريكية القولونية ومستويات الفلورسنت على مدى عدة ساعات. تبدأ العملية بالفحص بحثا عن المستعمرات التي تعيش على الحد الأدنى من الوسائط ، على افتراض أن الإشريكية القولونية التي تؤوي البلازميد الصحيح هي وحدها القادرة على الازدهار في الظروف المحددة. وبما أن عملية بناء دوائر جينية كبيرة، تتطلب تجميع العديد من أجزاء الحمض النووي، فإن مكونات الدائرة غالبا ما توزع بين البلازميدات المتعددة بأعداد نسخ مختلفة تتطلب استخدام العديد من المضادات الحيوية. الطفرات في البلازميد يمكن أن تدمر نسخ جينات مقاومة المضادات الحيوية وتتداخل مع إدارة الموارد في الخلية مما يؤدي إلى نخر. يتم تعيين مستعمرة مختارة على طبق بيتري الزجاج القاع ويتم اختيار عدد قليل من الطائرات التركيز لتتبع المجهر في كل من المجال مشرق والمجالات الفلورية. يحافظ البروتوكول على تركيز الصورة لأكثر من 12 ساعة في ظل ظروف أولية لا يمكن تنظيمها ، مما يخلق بعض الصعوبات. على سبيل المثال، تبدأ الخلايا الميتة في التراكم في مجال تركيز العدسات بعد بضع ساعات من التصوير، مما يؤدي إلى تراكم السموم وطمس الإشارة وتسوسها. استنفاد المواد الغذائية يدخل عمليات التمثيل الغذائي الجديدة وتعيق الاستجابة المرجوة من الدائرة. درجة حرارة التجربة يقلل من تأثير الحث والمضادات الحيوية، والتي يمكن أن تلحق المزيد من الضرر موثوقية الإشارة. يتقلص الحد الأدنى من هلام الوسائط ويجفف ، ونتيجة لذلك يتغير التركيز البصري بمرور الوقت. طورنا هذه الطريقة للتغلب على هذه التحديات في الإشريكية القولونية، على غرار الأعمال السابقة التي تطور أساليب مماثلة للكائنات الدقيقة الأخرى. بالإضافة إلى ذلك ، تقدم هذه الطريقة خوارزمية لتحديد إجمالي الضوضاء العشوائية في الخلايا غير المعدلة والمتغيرة ، حيث وجدت أن النتائج تتسق مع توقعات محلل التدفق كما هو موضح في معامل مماثل للاختلاف (CV).

يقوم البرنامج بتحليل صور مجال المجال الساطعة التي تكون بيضاء وسوداء. فإن Escherichia القولونية تبدو وكأنها أشكال مستطيلة سوداء على خلفية بيضاء قبالة ومجموعة ديناميكية من الإنارة يجب أن تظهر ارتفاع في مركزها(الشكل 1). في صور الفلورسنت الخلايا قد يكون لها هالة صغيرة ولكن الخ?...

Watch this Scientific Journal Video about Continuous Measurement of Biological Noise in Escherichia Coli Using Time-lapse Microscopy at JoVE.com

Continuous Measurement of Biological Noise in Escherichia Coli Using Time-lapse Microscopy

يقدم هذا العمل طريقة المجهر التي تسمح بالتصوير الحي لخلية واحدة من الإشريكية القولونية لتحليل وتكميم السلوك العشوائي للدوائر الجينية الاصطناعية.

القياس المستمر للضوضاء البيولوجية في الإشريكية القولونية باستخدام المجهر الفاصل الزمني

The protocol developed here offers a tool to enable computer tracking of Escherichia coli division and fluorescent levels over several hours. The process ...

هذا البروتوكول في الأعشاب قياس مستمر من الدوائر الوراثية في القولونية وحساب تقلب الإشارة ونسبة الإشارة إلى الضوضاء في الخلايا البكتيرية الفردية لتقييم أداء الدائرة. المزايا الرئيسية لهذه التقنية هي أنها قابلة للتكيف بسهولة مع سلالات ومختبرات مختلفة ، وتتطلب الحد الأدنى من التدريب وعدم وجود معدات خاصة ، وغير مكلفة نسبيا. الضوضاء هي دور هام في تحديد وظائف النظم البيولوجية.حاليا، هناك مصلحة في بناء دوائر الجينات على نطاق واسع. يمكن تثبيط هذه الأنظمة عن طريق الضوضاء تأكد من تجفيف العينات بشكل جيد ، للحفاظ على منصات البرد في أربع درجات مئوية لأطول فترة ممكنة ، وقطع وتقسيم الأجزاء بصبر وبلطف. لإعداد البكتيريا للتحليل تلقيح مستعمرة واحدة من ثقافة الإشريكية القولونية المصابة.على سبيل المثال، دائرة مع مراسل GFP. في أنبوب زجاجي يحتوي على خمسة ملليلتر من مرق LB تكملة ذلك مع المضادات الحيوية ذات الصلة. تنمو الخلايا في 37 درجة مئوية و 250 ثورة في الدقيقة الواحدة في حاضنة تهتز لمدة ساعتين حتى مرق غائم.في نهاية الحضانة ، قم بتدوير ملليلتر واحد من محلول التخفيف في جهازي طرد مركزي صغير صغير ملليلتر ، ونقل 30 ميكرولتر من البكتيريا والحجم الكامل لمحلول التخفيف إلى أنبوبين ملليلتر جديدين. ثم، احتضان الثقافة لمدة ساعة واحدة مع اهتزاز قبل بذر 40 إلى 60 ميكرولتر من هذا التعليق على لوحات الثقافة M9. لإعداد البكتيريا للتحليل، تلقيح مستعمرة واحدة من ثقافة الإشريكية القولونية المصابة.على سبيل المثال، دائرة مع مراسل GFP في أنبوب زجاجي يحتوي على خمسة ملليلترات من مرق LB تكملها المضادات الحيوية ذات الصلة. تنمو الخلايا في 37 درجة مئوية و 250 ثورة في الدقيقة الواحدة في حاضنة تهتز لمدة ساعتين حتى مرق غائم. في نهاية الحضانة ، قم بتدوير ملليلتر واحد من محلول التخفيف في أنبوب طرد مركزي صغير ملليلتر صغير ونقل 30 ميكرولتر من البكتيريا والحجم الكامل لمحلول التخفيف إلى أنبوبين ملليلتر جديدين.ثم احتضان الثقافة لمدة ساعة واحدة مع اهتزاز. لإعداد لوحات المجهر، مزيج 112.5 ملليغرام من أجار ذوبان منخفضة مع 40 ملليغرام من أجار، وميليلتر واحد من حمض كازامينو 2٪في قارورة إرلينماير 25 ملليلتر. بعد ذلك ، أضف 8.92 ملليلتر من الحد الأدنى من المتوسط على الشفاه الداخلية لقارورة Erlenmeyer 25 ملليلتر والميكروويف الحل الناتج باختصار ، رشقات نارية من ثانيتين إلى ثلاث ثوان.ثم تعيين حمام الماء إلى 55 درجة مئوية. عندما يكون الحل واضحا ، ضع قارورة Erlenmeyer 25 ملليلتر في حمام مائي 60 درجة مئوية والسماح لمحلول أجار بالتبريد حتى تنخفض درجة حرارته إلى حوالي 45 إلى 50 درجة مئوية. في حين أن التبريد أجار، وتنظيف مقاعد البدلاء مختبر مع 70٪ الإيثانول وسلس قطعة من الشريط المختبر على مقاعد البدلاء تنظيفها.وضع غطاء زجاجي واحد زلة على الشريط ووضع زلة غطاء الثاني بالقرب من. إضافة محلول أجار المبردة إلى المضادات الحيوية المناسبة والحل. صب 1.5 ملليلتر من أعدت حديثا إلى حل هلام على زلة الغطاء وضعت على الشريط ووضع زلة الغطاء الثاني على هلام، مع الحرص على تجنب فقاعات.أعد Erlenmeyer إلى حمام الماء الساخن وغطي زلات الغطاء لمدة 20 دقيقة. تقلب الغطاء لمدة ساعة واحدة حضانة في أربع درجات مئوية. في نهاية الحضانة، قم بإزالة زلات الغطاء من الجل الجاف وقطع وسادة صغيرة من الآغاروز.أثناء الحضانة ، أضف ست قطرات ميكرولتر من التعليق البكتيري المعد إلى طبق 35 ملليمترا واترك القطرات تجف لمدة 15 إلى 30 دقيقة على الأقل. ثم وضع بعناية لوحة في وقت واحد على قطرة واحدة من البكتيريا والسماح للعينات لتعيين لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. لوضع السرير أجار دون تشويه العينة، وضع بعناية لوحة باردة على قطرة مع التنصت لطيف.لتصوير العينات، قم بإزالة القارورة من الماء واترك محلول الجل يبرد لدرجة حرارة الجسم. صب ثلاثة ملليمترات من الجل على محيط لوحة العينة. عندما توطد agarose، ختم لوحة مع الشريط واستخدام إبرة قياس 25 لقطعة عدة ثقوب في الشريط.ثم ضع اللوحة رأسا على عقب عند أربع درجات مئوية لمدة 30 دقيقة على الأقل للسماح للأغاروز بترسيخ كامل ، مع منع ترسب الخلايا. في غضون 24 ساعة، استخدم مجهر كونفوكوكال مضان لتحديد موقع العينة في أدنى تكبير وإشراك نظام التركيز التلقائي للمجهر. تطبيق النفط على الهدف المناسب واستخدام وحدة تحكم منصة لنقل لوحة لنشر النفط بعناية.ثم إشراك التركيز التلقائي مرة أخرى واتبع الاقتراح الافتراضي ل Z الخطوة المقاطع العرضية لتصوير العينة. يجب أن تظهر الإشريكية القولونية كأشكال مستطيلة سوداء على خلفية بيضاء. والنطاق الديناميكي للإضاءة يجب أن يظهر ارتفاعا في مركزه.يمكن الكشف عن أحداث الميتوسيس أولا عن طريق المجهر الفلوري بعد 30 دقيقة. على الرغم من أن الخلايا الفردية قد يكون من الصعب الكشف عنها في التكبير منخفضة. يمكن أن تظهر ثقافات الخلايا البكتيرية التي تم إعدادها بنسبة تمييع غير صحيحة أعدادا غير متغيرة من الخلايا ، ويمكن أن تظهر العينات التي تم إعدادها بدون ختم لوحة انكماشا مفرطا ، مما يؤدي إلى فقدان التركيز.يمكن للخلايا أيضا المسافة البادئة الجل في بحثها عن المواد الغذائية، مما أدى إلى التراص من الخلايا البكتيرية فوق بعضها البعض والمساس أحادي الطبقة الخلية، ومنع الكشف عن الخلايا بشكل فعال وقياس إشارة الفلورسنت موثوق بها. وكما تشير هذه البيانات، فإن مرحلة الخلية في دورة التقسيم لا تؤثر على مستوى الضوضاء، حيث أن نطاقات مختلفة من المنطقة تظهر نفس الاتجاه. وعلاوة على ذلك، لا يلاحظ أي تغيير جوهري في نسبة الإشارة إلى الضوضاء بين GFP وGFP فائقة الجوانب، كما يتضح من هذه البيانات التمثيلية.عند إجراء هذا الإجراء، يجب الحرص على تحديد نسبة التخفيف الصحيحة للسلالة البكتيرية المستخدمة في التجربة. مقارنة نسبة الإشارة إلى الضوضاء لكل دوائر منظمة لهذا الخط الأساسي يسمح باختيار أفضل دائرة أداء ويمكن أن تكشف عن ظواهر مثيرة للاهتمام

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Continuous Measurement of Biological Noise in Escherichia Coli Using Time-lapse Microscopy

Engineering Biological-Based Vascular Grafts Using a Pulsatile Bioreactor

الطعوم الوعائية الهندسة البيولوجية ، عن طريق بناء مفاعل حيوي نابض

Much effort has been devoted to develop and advance the methodology to regenerate functional small-diameter arterial bypasses. In the physiological ...

Three-dimensional Optical-resolution Photoacoustic Microscopy

ثلاثي الأبعاد البصرية الميكروسكوب الضوئي الاستبانة

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As ...

Fluorescent Nanoparticles for the Measurement of Ion Concentration in Biological Systems

الفلورسنت النانوية لقياس تركيز ايون في النظم البيولوجية

Tightly regulated ion homeostasis throughout the body is necessary for the prevention of such debilitating states as dehydration.1 In contrast, rapid ion ...

Time-lapse Fluorescence Imaging of Arabidopsis Root Growth with Rapid Manipulation of The Root Environment Using The RootChip

الوقت الفاصل بين التصوير الإسفار من نمو الجذور Arabidopsis مع التلاعب السريع للبيئة الجذر باستخدام RootChip

The root functions as the physical anchor of the plant and is the organ responsible for uptake of water and mineral nutrients such as nitrogen, ...

In situ TEM of Biological Assemblies in Liquid

In situ TEM of Biological Assemblies in Liquid

في الموقع TEM من الجمعيات البيولوجية في السائل

Researchers regularly use Transmission Electron Microscopes (TEMs) to examine biological entities and to assess new materials. Here, we describe an ...

Sample Drift Correction Following 4D Confocal Time-lapse Imaging

عينة تصحيح الانجراف بعد 4D متحد البؤر التصوير الوقت الفاصل

The generation of four-dimensional (4D) confocal datasets; consisting of 3D image sequences over time; provides an excellent methodology to capture ...

Surface Potential Measurement of Bacteria Using Kelvin Probe Force Microscopy

سطح القياس المحتمل للبكتيريا عن طريق كلفن التحقيق قوة المجهر

Surface potential is a commonly overlooked physical characteristic that plays a dominant role in the adhesion of microorganisms to substrate surfaces. ...

Design and Construction of Artificial Extracellular Matrix (aECM) Proteins from Escherichia coli for Skin Tissue Engineering

Design and Construction of Artificial Extracellular Matrix aECM Proteins from Escherichia coli for Skin Tissue Engineering

تصميم وبناء الاصطناعي خارج الخلية مصفوفة (aECM) والبروتينات من<em&gt; الإشريكية القولونية</em&gt; للبشرة هندسة الأنسجة

Recombinant technology is a versatile platform to create novel artificial proteins with tunable properties. For the last decade, many artificial proteins ...

A Novel Technique for Generating and Observing Chemiluminescence in a Biological Setting

تقنية جديدة لتوليد ومراقبة التوهج في إعداد البيولوجي

Intraoperative imaging techniques have the potential to make surgical interventions safer and more effective; for these reasons, such techniques are ...