Name: continuous measurement of biological noise in escherichia coli using time-lapse microscopy
Uploaded: 2021-04-27T12:30:00
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我们感谢吉尔·盖尔伯特先生（电气工程学院，技术学院）协助MATLAB代码。我们感谢李锡铭博士（生物医学工程学院，技术）协助校对本文。这项研究得到了Neubauer家庭基金会和以色列科学部的部分支持，授予2027345。

1.媒体和文化准备
<ol><li>准备1000x卡本西林（50毫克/mL）或相关抗生素的库存溶液。<ol>
<li>.重 0.5 克卡苯甲酸林。添加10毫升无菌H2O.完全溶解。</li>
		<li>通过 0.22μm 注射器过滤器对苯甲酸素库存进行灭菌。阿里引用抗生素溶液，储存在-20°C。</li>
	</ol>
</li>
	<li>要准备溶酶肉汤 （LB） 板， 混合 5 克 tryptone， 5 克 NaCl， 2.5 克酵母提取物和 7.5 克 Bacto agar 与 0.5 升无菌 H2O. ?...

<ol>
	<li>Daniel, R., Rubens, J. R., Sarpeshkar, R., Lu, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+analog+computation+in+living+cells.">Synthetic analog computation in living cells.</a> Nature. 497, 619-623 (2013).</li><li>Yang, X. S. Y., L, A. B., Harwood, C., Jensen, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Imaging Bacterial Molecules, Structures and Cells. , (2016).</li><li>Joyce, G., Robertson, B. D., Williams, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modified+agar+pad+method+for+mycobacterial+live-cell+imaging.">A modified agar pad method for mycobacterial live-cell imaging.</a> Biomedcentral Research Notes. , (2011).</li><li>Cotlet, M., Goodwin, P. 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在这项工作中，我们开发了一个协议，使计算机跟踪 大肠杆菌 活细胞，在几个小时内跟随分裂和荧光水平。该协议使我们能够通过实时测量简历和SNR来量化 大肠杆菌 遗传电路的随机动力学。在此协议中，我们比较了 图 10中显示的两个不同电路的随机行为。研究表明，拷贝数低的质粒更容易产生痉挛效应，受细胞分裂的影响较小。第一个电路构成表示GFP（图10a）?...

合成生物学是近十年来出现的一个多学科领域，旨在将工程设计原理转化为合理的生物设计1、2、3，努力实现活细胞的多信号集成和处理，以理解基础科学4、5、诊断、治疗和生物技术应用6、7、8、9、10。我们量化合成基因电路输入输出响应的能力已经随着单细胞技术的最新进展而发生了革命性进展，包括使用自动延时显微镜11的流动分析仪和活细胞成像。流分析仪常用于测量这些电路在稳定状态1、12的反应，倒显微镜用于测量合成基因回路在单细胞3水平上的动态反应。例如，合成生物学的早期工作之一涉及利用负反馈回路在活细胞中建立遗传振荡器网络，延迟3。后来，基因振荡器回路被应用于了解活细胞4的动态环境中的代谢控制。自动延时显微镜是描述此类电路的一种方法。我们假设宿主细胞，大肠杆菌，在形成微殖民地时同步，允许测量信号和计算噪音，而无需跟踪确切的母女关系。
噪音是生物系统的基本固有方面，通常由多种来源产生。例如，生化反应涉及来自分离随机载体的传输的信号，如蛋白质的扩散13。这些信号以随机波动14传播。其他噪声源包括资源可用性、细胞分裂和环境条件的变化，如温度、湿度和压力。在合成基因电路中传播的生物信号通常具有非常低的信号与噪声比（SNR），这扰乱了这些电路的性能。因此，基因电路设计仍然是基因工程15最具挑战性的方面之一。例如，与大多数只计算平均基因表达的方法（测量整个细胞群）相比，考虑测量信号的方差，以便通过合成基因网络12来设计可预测的行为。因此，蛋白质表达中的变异性或噪声水平在模拟和数字基因电路1、16、17的设计和性能中起着主导作用。
已经开发出许多方法来量化细胞对细胞的变异性，包括在大肠杆菌3，7，18。这些方法通常用于研究基因活化和代谢通路，但较少侧重于随机噪声动力学的研究，如测量和分离特定的噪声源，特别是活细胞中的遗传回路，这是一个根本的挑战19，20，21。几个因素，既继承到电路本身（内在的），又从宿主细胞（外在）中衍生出来，可以扰乱遗传电路的连续性能。在本文中，我们制定了一个协议，旨在量化大肠杆菌细胞的总噪声，包括内在和外在噪声源6，22。通过量化总噪声，然后评估SNR23，基因电路的设计可以改进。通过监测几种荧光蛋白6、20，可以修改这种方法，分别测量独立的噪声源。对于此处描述的协议，我们保持良好的环境条件控制，并不断测量细胞的活性，而不受外部因素的影响。随着时间的推移，我们测量单个细胞中荧光蛋白发出的信号，并同时在蔗糖基板下对它们进行成像。使用实验室的自定义 MATLAB 分析生成的图像。
理想情况下，连续测量细胞内荧光蛋白的实时活性将通过细胞的生长和分裂产生准确的数据。然而，获取此类数据是具有挑战性的。这是由于荧光蛋白的退化，称为光漂白7，当他们暴露在辐射的兴奋过程中。此外， 大肠杆菌 细胞对兴奋也很敏感，这可能导致光毒性7。这两个问题都限制了可获取的相框数量和收购之间的时间。用于在成像过程中生长细胞的基质和中等类型（如溶酶肉汤）也具有关键作用。我们强烈建议使用最小的介质，最大限度地减少非荧光背景，延长细胞分裂时间。
此外，需要根据以下要求（1） 低细胞分裂率来准备样本，以便减少频繁的暴露，从而密切成像分裂周期并降低光毒性和光漂白的概率。我们在实验开始时将采集时间设定为预测的线粒体时间 （2） 低细胞密度的一半左右，从而能够提高分裂的均匀性和可跟踪性。细胞密度受 大肠杆菌 细胞稀释比的影响，大肠杆菌是该协议成功的一个重要参数，需要为每个实验室确定。为了确定这一比率，使用的每一个新的 大肠杆菌 菌株或介质应安装增长率图（补充图1）。如果细胞在初始密度约为600nm = 0.1 的短暂孵化后无需额外摇晃即可生长，则已实现适当的比率。处于这一阶段的细胞将仅根据环境温度（3） 限制细胞运动而分裂：细胞运动在很大程度上取决于基板（糖垫）的牢固性。基板的硬度取决于总糖量和凝胶凝固时间。凝胶不能在室温下过夜凝固，因为 大肠杆菌 将经历线粒体。影响基板稳定性的其他因素包括样品中的水量和湿度。代表结果中详细讨论了其他问题。此协议提供了许多详细信息，并逐渐从一个步骤移动到另一个步骤。该协议为成像实验提供了长期稳定性，并提供了一个基本的图像处理工具。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:748px;" width="747">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">35mm glass dish</td>
			<td style="width:216px;">mattek</td>
			<td style="width:137px;">P35G-0.170-14-C</td>
			<td style="width:172px;">thickness corresponding with microscope lense.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Agarose&#160;</td>
			<td style="width:216px;">Lonza</td>
			<td style="width:137px;">5004</td>
			<td>LB preperation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">AHL&#160;</td>
			<td style="width:216px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">K3007</td>
			<td>inducer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Bacto tryptone&#160;</td>
			<td style="width:216px;">BD - Becton, Dickinson and Company&#160;</td>
			<td style="width:137px;">211705</td>
			<td>LB preperation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Carb</td>
			<td style="width:216px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:137px;">10177-012</td>
			<td>antibiotic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Carb</td>
			<td style="width:216px;">Formedium</td>
			<td style="width:137px;">CAR0025</td>
			<td>antibiotic</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Casamino acids&#160;</td>
			<td style="width:216px;">BD - Becton, Dickinson and Company&#160;</td>
			<td style="width:137px;">223050</td>
			<td>minimal media solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">eclipse Ti</td>
			<td style="width:216px;">nikon</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td>inverted microscope</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Glucose</td>
			<td style="width:216px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">G5767</td>
			<td>minimal media solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Glyserol</td>
			<td style="width:216px;">Bio-Lab</td>
			<td style="width:137px;">000712050100</td>
			<td>minimal media substrate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Immersol 518F</td>
			<td style="width:216px;">zeiss</td>
			<td style="width:137px;">4449600000000</td>
			<td>immersion oil</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">M9 salt solution&#160;</td>
			<td style="width:216px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">M6030</td>
			<td>minimal media solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">NaCl</td>
			<td style="width:216px;">Bio-Lab</td>
			<td style="width:137px;">214010</td>
			<td>LB preperation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Noble agar</td>
			<td style="width:216px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">A5431</td>
			<td>minimal media substrate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">parafilm tape</td>
			<td style="width:216px;">Bemis</td>
			<td style="width:137px;">PM-996</td>
			<td>refered to as tape in text</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Seaplaque GTG Agarose</td>
			<td style="width:216px;">Lonza</td>
			<td style="width:137px;">50111</td>
			<td>minimal media substrate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">thaymine B1</td>
			<td style="width:216px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">T0376&#160;</td>
			<td>minimal media solution</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Yeast Extract</td>
			<td style="width:216px;">BD - Becton, Dickinson and Company&#160;</td>
			<td style="width:137px;">212750</td>
			<td>LB preperation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

continuous measurement of biological noise in escherichia coli using time-lapse microscopy

这里开发的协议提供了一个工具，使计算机跟踪 大肠杆菌 分裂和荧光水平在几个小时内。这个过程开始于筛选在最少的媒体上生存的殖民地，假设只有窝藏正确质粒的 大肠杆菌 才能在特定条件下茁壮成长。由于构建大型基因电路（需要组装许多DNA部分）的过程具有挑战性，因此电路组件通常以不同的拷贝数分布在多个质粒之间，需要使用多种抗生素。质粒中的突变会破坏抗生素耐药基因的转录，并与细胞中的资源管理相交，导致坏死。选定的殖民地设置在玻璃底培养皿上，并选择几个焦点平面在明亮的领域和荧光域进行显微镜跟踪。该协议在无法监管的初始条件下将图像焦点保持在 12 小时以上，造成一些困难。例如，经过几个小时的成像后，死细胞开始积聚在透镜的聚焦领域，这会导致毒素积聚，信号变得模糊和衰变。营养物质的消耗引入了新的代谢过程，阻碍了电路的预期反应。实验的温度降低了诱导剂和抗生素的疗效，这会进一步损害信号的可靠性。最小的介质凝胶收缩和干燥，因此光学对焦会随着时间而改变。我们开发了这种方法来克服 大肠杆菌的这些挑战，类似于以前为其他微生物开发类似方法的工作。此外，该方法还提供了一种算法来量化未改变和改变的细胞中的总随机噪声，发现结果与类似变异系数 （CV） 所示的流量分析仪预测一致。

该软件分析白色和黑色的明亮字段域图像。 大肠杆菌 在白色背景上看起来像黑色长方形，动态亮度范围应在其中心显示尖峰（图 1）。在荧光图像中，细胞可能有一个小光环，但具有长方形的单个细胞仍然可以得到解决。应在 30 分钟后首先检测到线粒体病事件。显微镜聚焦应随着时间的推移保持稳定，尽管细胞在这 30 分钟内移动缓慢，但不太可能离开视野。这样的?...

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Continuous Measurement of Biological Noise in Escherichia Coli Using Time-lapse Microscopy

这项工作提出了一种显微镜方法，允许对 大肠杆菌 的单个细胞进行活成像，以便分析和量化合成基因电路的随机行为。

使用延时显微镜连续测量 大肠杆菌 中的生物噪声

The protocol developed here offers a tool to enable computer tracking of Escherichia coli division and fluorescent levels over several hours. The process ...

本协议在草药中连续测量大肠杆菌的遗传电路，并计算单个细菌细胞中的信号变异性和信号噪声比，以评估电路性能。该技术的主要优点是，它易于适应不同的菌株和实验室，需要最少的培训，没有特殊设备，而且价格相对便宜。噪音在决定生物系统的功能方面起着重要作用。目前，人们有兴趣建立大规模的基因电路。这些系统可以受到噪音的抑制，请务必将样品干燥好，尽可能长时间地将冷却垫保持在摄氏四度，并耐心而温和地切割和分割部件。为分析准备细菌，从受感染的大肠杆菌培养中接种单个菌落。例如，与 GFP 记者的电路。在含有五毫升LB汤的玻璃管中，用相关抗生素补充。在摇晃的孵化器中以每分钟 37 摄氏度和 250 圈的速度生长细胞两个小时，直到汤多云。在孵化结束时，在两毫升迷你离心机中旋转一毫升稀释溶液，并将 30 微升细菌和整个稀释溶液体积转移到一个新的两毫升管中。然后，在将 40 到 60 微升悬浮剂播种到 M9 培养板上之前，先用摇晃将培养子孵育一小时。为了使细菌为分析做好准备，从受感染的大肠杆菌培养中接种单个菌落。例如，一个装有GFP记者的电路在玻璃管中含有五毫升的LB汤，并辅以相关的抗生素。在摇晃的孵化器中以每分钟 37 摄氏度和 250 圈的速度生长细胞两个小时，直到汤多云。在孵化结束时，在两毫升迷你离心管中旋转一毫升稀释溶液，并将 30 微升细菌和整个稀释溶液体积转移到新的两毫升管中。然后用震动孵育文化一小时。要准备显微镜板，将 112.5 毫克低熔化的 agar 与 40 毫克的 agar 混合，在 25 毫升 Erlenmeyer 烧瓶中混合 1 毫升 2% 的卡萨米诺酸。接下来，在 25 毫升 Erlenmeyer 烧瓶的内唇上加入 8.92 毫升的最小介质，并在短短两到三秒内微波处理由此产生的溶液。然后将水浴温度设置为 55 摄氏度。当溶液清晰时，将 25 毫升 Erlenmeyer 烧瓶放在 60 摄氏度的水浴中，让 agar 溶液冷却，直到温度降至约 45 至 50 摄氏度。在阿加冷却时，用 70% 乙醇清洁实验室长凳，并将一块实验室胶带平滑到清洁的长凳上。将一个玻璃盖滑到磁带上，并在附近放置第二个盖片。将冷却的阿加溶液添加到适当的抗生素和溶液中。将 1.5 毫升新鲜准备的凝胶溶液倒入放在胶带上的盖片上，并将第二个盖滑倒到凝胶上，小心避免气泡。将 Erlenmeyer 返回热水浴池，盖住盖子 20 分钟。翻转盖片，在摄氏四度下孵化一小时。在孵化结束时，从干凝胶中取出盖片，从蔗糖中切下一个小垫子。在孵化过程中，将制备细菌悬浮液中的六个微滑液滴加入 35 毫米的盘中，使滴子干燥至少 15 至 30 分钟。然后小心地将垫子一次放置在一滴细菌上，让样品在室温下放置20分钟。要放置 agar 床而不涂抹样品，请小心地将冷却垫放在液滴上，轻轻敲击。要对样品进行成像，请从水中取出烧瓶，并让凝胶溶液冷却至体温。将三毫米的凝胶倒入样品板的外围。当糖体凝固后，用胶带密封板，并用25米针将几个孔插入胶带中。然后将盘子倒置在摄氏4度，至少30分钟，使糖体完全凝固，同时防止细胞间质疏松。在 24 小时内，使用荧光共聚焦显微镜将样品定位在最低放大倍率，并采用显微镜的自动对焦系统。将油涂抹在适当的目标上，并使用平台控制器移动板，以小心地铺开油。然后再次进行自动对焦，并按照 Z 步横截面的默认建议对示例进行映像。大肠杆菌应在白色背景上显示为黑色长方形。发光的动态范围应该显示其中心的峰值。30分钟后，荧光显微镜可首先检测到线粒体事件。虽然单个细胞在低倍率下可能难以检测。以不正确的稀释比率制备的细菌细胞培养物可以证明细胞数量不变，而未密封板的样品可能表现出过度收缩，导致注意力丧失。细胞还可以在寻找营养物质时吸收凝胶，导致细菌细胞相互叠叠，并损害细胞单层，有效防止细胞检测和可靠的荧光信号测量。根据这些数据的建议，分裂周期中的单元格阶段不影响噪声水平，因为不同区域范围表现出相同的趋势。此外，GFP 和超级倍频 GFP 之间的信号与噪声比率没有显著变化，这些代表性数据就说明了这一点。执行此程序时，请注意确定用于实验的细菌菌株的正确稀释比。将每个受监管电路的信号噪声比与此基线进行比较，可以选择最佳性能电路，并揭示有趣的现象

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Continuous Measurement of Biological Noise in Escherichia Coli Using Time-lapse Microscopy

Engineering Biological-Based Vascular Grafts Using a Pulsatile Bioreactor

基于生物工程，人造血管使用脉动生物反应器

Much effort has been devoted to develop and advance the methodology to regenerate functional small-diameter arterial bypasses. In the physiological ...

科研

生物工程

Three-dimensional Optical-resolution Photoacoustic Microscopy

三维光学分辨率的光声显微镜

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As ...

Fluorescent Nanoparticles for the Measurement of Ion Concentration in Biological Systems

在生物系统中的离子浓度测量荧光纳米粒子

Tightly regulated ion homeostasis throughout the body is necessary for the prevention of such debilitating states as dehydration.1 In contrast, rapid ion ...

Time-lapse Fluorescence Imaging of Arabidopsis Root Growth with Rapid Manipulation of The Root Environment Using The RootChip

时间推移荧光成像拟南芥根系生长的根环境的快速操作使用RootChip

The root functions as the physical anchor of the plant and is the organ responsible for uptake of water and mineral nutrients such as nitrogen, ...

In situ TEM of Biological Assemblies in Liquid

In situ TEM of Biological Assemblies in Liquid

就地 液体生物组件的 TEM

Researchers regularly use Transmission Electron Microscopes (TEMs) to examine biological entities and to assess new materials. Here, we describe an ...

Sample Drift Correction Following 4D Confocal Time-lapse Imaging

样品漂移校正继4D共焦时间推移成像

The generation of four-dimensional (4D) confocal datasets; consisting of 3D image sequences over time; provides an excellent methodology to capture ...

Surface Potential Measurement of Bacteria Using Kelvin Probe Force Microscopy

细菌表面电位测量用开尔文探针力显微镜

Surface potential is a commonly overlooked physical characteristic that plays a dominant role in the adhesion of microorganisms to substrate surfaces. ...

Design and Construction of Artificial Extracellular Matrix (aECM) Proteins from Escherichia coli for Skin Tissue Engineering

Design and Construction of Artificial Extracellular Matrix aECM Proteins from Escherichia coli for Skin Tissue Engineering

设计和人工细胞外基质的构建（AECM）蛋白质<em&gt;大肠杆菌</em&gt;对皮肤组织工程

Recombinant technology is a versatile platform to create novel artificial proteins with tunable properties. For the last decade, many artificial proteins ...

A Novel Technique for Generating and Observing Chemiluminescence in a Biological Setting

在生物环境的新技术的产生和观测化学发光

Intraoperative imaging techniques have the potential to make surgical interventions safer and more effective; for these reasons, such techniques are ...

使用延时显微镜连续测量 大肠杆菌 中的生物噪声

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