Name: continuous measurement of biological noise in escherichia coli using time-lapse microscopy
Uploaded: 2021-04-27T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Continuous Measurement of Biological Noise in Escherichia Coli Using Time-lapse Microscopy at JoVE.com

Vi takker Mr. Gil Gelbert (Fakultetet for Elektroteknik, Technion) for at hjælpe med MATLAB-koden. Vi takker Dr. Ximing Li (Fakultetet for bio-medicinsk Engineering, Technion) for at hjælpe med proofing denne artikel. Denne forskning blev delvist støttet af Neubauer Family Foundation og Israel Ministry of Science, tilskud 2027345.

1. Forberedelse af medier og kultur
<ol><li>Forbered stamopløsning på 1.000x Carbenicillin (50 mg/mL) eller relevant antibiotikum.<ol>
<li>. Afvejes 0,5 g karburator. Der tilsættes 10 mL steril H2O. Opløses fuldstændigt.</li>
		<li>Karburatorbestanden steriliseres gennem et 0,22 μm sprøjtefilter. Antibiotisk opløsning til aliquot og opbevares ved -20 °C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>For at tilberede lysogene bouillonplader (LB) blandes 5 g tryptone, 5 g NaCl, 2,5 g gærekstrakt og 7,5 g B...

<ol>
	<li>Daniel, R., Rubens, J. R., Sarpeshkar, R., Lu, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+analog+computation+in+living+cells.">Synthetic analog computation in living cells.</a> Nature. 497, 619-623 (2013).</li><li>Yang, X. S. Y., L, A. B., Harwood, C., Jensen, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Imaging Bacterial Molecules, Structures and Cells. , (2016).</li><li>Joyce, G., Robertson, B. D., Williams, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modified+agar+pad+method+for+mycobacterial+live-cell+imaging.">A modified agar pad method for mycobacterial live-cell imaging.</a> Biomedcentral Research Notes. , (2011).</li><li>Cotlet, M., Goodwin, P. M., Waldo, G. S., Werner, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+the+fluorescence+dynamics+of+single+molecules+of+a+green+fluorescent+protein:+One-+versus+two-photon+excitation.">A comparison of the fluorescence dynamics of single molecules of a green fluorescent protein: One- versus two-photon excitation.</a> ChemPhysChem. , (2006).</li><li>Andersen, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+unstable+variants+of+green+fluorescent+protein+for+studies+of+transient+gene+expression+in+bacteria.">New unstable variants of green fluorescent protein for studies of transient gene expression in bacteria.</a> Applied and Environmental Microbiology. 64, 2240-2246 (1998).</li><li>Barger, N., Litovco, P., Li, X., Habib, M., Daniel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+metabolic+computation+in+a+bioluminescence-sensing+system.">Synthetic metabolic computation in a bioluminescence-sensing system.</a> Nucleic Acids Research. , (2019).</li><li>Young, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+single-cell+gene+expression+dynamics+in+bacteria+using+fluorescence+time-lapse+microscopy.">Measuring single-cell gene expression dynamics in bacteria using fluorescence time-lapse microscopy.</a> Nature Protocols. , (2012).</li><li>Swain, P. S., Elowitz, M. B., Siggia, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+and+extrinsic+contributions+to+stochasticity+in+gene+expression.">Intrinsic and extrinsic contributions to stochasticity in gene expression.</a> Proceedings of the National Academy of Science United States. , (2002).</li><li>Elowitz, M. B., Levine, A. J., Siggia, E. D., Swain, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stochastic+gene+expression+in+a+single+cell.">Stochastic gene expression in a single cell.</a> Science. , (2002).</li><li>Baumgart, L., Mather, W., Hasty, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synchronized+DNA+cycling+across+a+bacterial+population.">Synchronized DNA cycling across a bacterial population.</a> Nature Genetics. , (2017).</li><li>Arriaga, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+biological+noise+via+single+cell+analysis.">Determining biological noise via single cell analysis.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. , (2009).</li><li>Nielsen, A. A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+circuit+design+automation.">Genetic circuit design automation.</a> Science. , (2016).</li><li>Ozbudak, E. M., Thattai, M., Kurtser, I., Grossman, A. D., van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+noise+in+the+expression+of+a+single+gene.">Regulation of noise in the expression of a single gene.</a> Nature Genetics. 31, 69-73 (2002).</li><li>Pedraza, J. H., Van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noise+propagations+in+gene+networks.">Noise propagations in gene networks.</a> Science. , (2005).</li><li>Jennifer, A. N. B., Christopher, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+genetic+circuit+design.">Principles of genetic circuit design.</a> Nature Methods. , (2014).</li><li>Aoki, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+universal+biomolecular+integral+feedback+controller+for+robust+perfect+adaptation.">A universal biomolecular integral feedback controller for robust perfect adaptation.</a> Nature. , (2019).</li><li>Hanna, H. A., Danial, L., Kvatinsky, S., Daniel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cytomorphic Electronics with Memristors for Modeling Fundamental Genetic Circuits. 4545, (2020).</li><li>de Jong, I. G., Beilharz, K., Kuipers, O. P., Veening, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+cell+imaging+of+Bacillus+subtilis+and+Streptococcus+pneumoniae+using+automated+time-lapse+microscopy.">Live cell imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using automated time-lapse microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2011).</li><li>Eling, N., Morgan, M. D., Marioni, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+in+measuring+and+understanding+biological+noise.">Challenges in measuring and understanding biological noise.</a> Nature Reviews Genetics. , (2019).</li><li>Thattai, M., Van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Attenuation+of+noise+in+ultrasensitive+signaling+cascades.">Attenuation of noise in ultrasensitive signaling cascades.</a> Biophysical Journal. , (2002).</li><li>Thattai, M., Van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+noise+in+gene+regulatory+networks.">Intrinsic noise in gene regulatory networks.</a> Proceedings of the National Academy of Science United States. , (2001).</li><li>Rosenfeld, N., Young, J. W., Alon, U., Swain, P. S., Elowitz, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+regulation+at+the+single-cell+level.">Gene regulation at the single-cell level.</a> Science. , (2005).</li><li>Van Der Ziel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Noise in Measurements. , (1976).</li><li>Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+cloning:+A+laboratory+manual.+2nd+Edition.">Molecular cloning: A laboratory manual. 2nd Edition.</a> Cold Spring Harbor Laboratory Press. , (1989).</li><li>Carpenter, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CellProfiler:+Image+analysis+software+for+identifying+and+quantifying+cell+phenotypes.">CellProfiler: Image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes.</a> Genome Biology. , (2006).</li><li>Paintdakhi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oufti:+An+integrated+software+package+for+high-accuracy,+high-throughput+quantitative+microscopy+analysis.">Oufti: An integrated software package for high-accuracy, high-throughput quantitative microscopy analysis.</a> Molecular Microbiology. , (2016).</li><li>Ducret, A., Quardokus, E. M., Brun, Y. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicrobeJ,+a+tool+for+high+throughput+bacterial+cell+detection+and+quantitative+analysis.">MicrobeJ, a tool for high throughput bacterial cell detection and quantitative analysis.</a> Nature Microbiology. , (2016).</li><li>Stylianidou, S., Brennan, C., Molecular, S. B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> SuperSegger: robust image segmentation, analysis and lineage tracking of bacterial cells - Stylianidou - 2016 - Molecular Microbiology. , (2016).</li><li>Balomenos, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image+analysis+driven+single-cell+analytics+for+systems+microbiology.">Image analysis driven single-cell analytics for systems microbiology.</a> Biomedcentral System Biology. , (2017).</li><li>Smit, J. H., Li, Y., Warszawik, E. M., Herrmann, A., Cordes, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colicoords:+A+Python+package+for+the+analysis+of+bacterial+fluorescence+microscopy+data.">Colicoords: A Python package for the analysis of bacterial fluorescence microscopy data.</a> PLoS One. , (2019).</li><li>Guido, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bottom-up+approach+to+gene+regulation.">A bottom-up approach to gene regulation.</a> Nature. , (2006).</li><li>Beal, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signal-to-noise+ratio+measures+efficacy+of+biological+computing+devices+and+circuits.">Signal-to-noise ratio measures efficacy of biological computing devices and circuits.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. , (2015).</li><li>Marr, D., Hildreth, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Theory+of+edge+detection.">Theory of edge detection.</a> Proceedings of the Royal Society - Biology Science. 207, 187-217 (1980).</li><li>Otsu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Threshold+selection+method+from+gray-level+histograms.">Threshold selection method from gray-level histograms.</a> IEEE Transactions Systems Man Cybernetics. , (1979).</li><li>Soille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Morphological Image Analysis: Principles and Applications, Second edition. , (2000).</li><li>Bradley, D., Roth, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptive+Thresholding+using+the+Integral+Image.">Adaptive Thresholding using the Integral Image.</a> Journal of Graphics Tools. , (2007).</li><li>Meyer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topographic+distance+and+watershed+lines.">Topographic distance and watershed lines.</a> Signal Processing. , (1994).</li><li>Maurer, C. R., Qi, R., Raghavan, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+linear+time+algorithm+for+computing+exact+Euclidean+distance+transforms+of+binary+images+in+arbitrary+dimensions.">A linear time algorithm for computing exact Euclidean distance transforms of binary images in arbitrary dimensions.</a> IEEE Transactions on Pattern Analysis and Machine. , (2003).</li><li>Millo, R., Phillips, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+is+the+maturation+time+for+fluorescent+proteins.">What is the maturation time for fluorescent proteins.</a> Cell Biology by Numbers. , (2015).</li></ol>

I dette arbejde udviklede vi en protokol, der muliggør computersporing af Escherichia coli levende celler efter division og fluorescerende niveauer over en periode på timer. Denne protokol giver os mulighed for at kvantificere den stokastiske dynamik i genetiske kredsløb i Escherichia coli ved at måle CV'et og SNR i realtid. I denne protokol sammenlignede vi den stokastiske adfærd i to forskellige kredsløb som vist i figur 10. Det har vist sig, at plasmider med lave kopinumre er m...

Syntetisk biologi er et tværfagligt område, der er opstået i det seneste årti og har til formål at omsætte tekniske designprincipper til rationelt biologisk design1,2,3, i et forsøg på at opnå multisignalintegration og behandling i levende celler til forståelse af grundforskningen4,5, diagnostiske, terapeutiske og bioteknologiske applikationer6,7,8,9,10. Vores evne til at kvantificere input-output respons syntetiske gen kredsløb er blevet revolutioneret af de seneste fremskridt inden for encellet teknologi, herunder flow analysator og levende celle billeddannelse ved hjælp af automatiseret time-lapse mikroskopi11. En flowanalysator bruges ofte til at måle reaktionen fra disse kredsløb i stabil tilstand1,12, og omvendt mikroskopi bruges til at måle den dynamiske respons fra syntetiske genkredsløb på niveau med en enkelt celle3. For eksempel involverede et af de tidlige værker i syntetisk biologi opførelsen af genetiske oscillatornetværk i levende celler ved hjælp af negative feedback-sløjfer med en forsinkelse3. Senere blev de genetiske oscillatorkredsløb anvendt til at forstå metabolisk kontrol i det dynamiske miljø i levende celler4. Automatiseret time-lapse mikroskopi er en metode til at karakterisere sådanne kredsløb. Vi hypotese, at værten celler, Escherichia coli, synkronisere, når der dannes mikrokolonier, så måling af signal og beregning af støj uden at spore nøjagtige mor-datter relationer.
Støj er et grundlæggende, iboende aspekt af biologiske systemer, der ofte stammer fra flere kilder. Overvej for eksempel biokemiske reaktioner, der involverer signaler, der stammer fra transport af diskrete tilfældige bærere som diffusion af proteiner13. Disse signaler spredes med tilfældige udsving14. Andre støjkilder er ressourcetilgængelighed, celledeling og variationer i miljøforhold som temperatur, fugtighed og tryk. Biologiske signaler, der spredes i syntetiske genkredsløb, har ofte et meget lavt signal til støjforhold (SNR), hvilket forstyrrer sådanne kredsløbs ydeevne. Derfor er genetisk kredsløbsdesign fortsat et af de mest udfordrende aspekter af genteknologi15. I modsætning til de fleste metoder, der kun beregner middelgenudtrykket (målt over hele cellepopulationen), overvejes variansen af det målte signal for at konstruere forudsigelig adfærd gennem syntetiske gennetværk12. Som sådan spiller variabilitets- eller støjniveauerne i proteinudtrykket en dominerende rolle i design og ydeevne af analoge og digitale genkredsløb1,16,17.
Der er udviklet mange metoder til at kvantificere celle-til-celle-variabilitet, herunder i Escherichia coli3,7,18. Disse metoder bruges ofte til at studere genaktivering og metaboliske veje, men med mindre fokus på studiet af stokastisk støjdynamik, som måling og disentangling specifikke støjkilder, især for genetiske kredsløb i levende celler, hvor dette er en grundlæggende udfordring19,20,21. Flere faktorer, både arvet til selve kredsløbet (iboende) og afledt af værtscellerne (ydre), kan forstyrre den kontinuerlige ydeevne af genetiske kredsløb. I dette papir udviklede vi en protokol, der har til formål at kvantificere den samlede støj i Escherichia coli-celler, herunder de iboende og ydre støjkilder6,22. Ved at kvantificere den samlede støj og derefter evaluere SNR23kan designet af genkredsløb forbedres. Denne metode kan ændres for at måle uafhængige støjkilder separat ved at overvåge flere fluorescerende proteiner6,20. For den protokol, der er beskrevet her, holder vi miljøforholdene godt kontrolleret og måler løbende cellernes aktivitet uden påvirkning af eksterne faktorer. Vi måler signalet fra fluorescerende proteiner i enkelte celler over tid og samtidig billede dem under en agarose substrat. De resulterende billeder analyseres ved hjælp af laboratoriets brugerdefinerede MATLAB.
Ideelt set vil kontinuerlig måling af realtidsaktiviteten af fluorescerende proteiner inde i en celle producere nøjagtige data gennem cellernes vækst og opdeling. Det er imidlertid en udfordring at erhverve sådanne data. Dette skyldes nedbrydning af fluorescerende proteiner, kendt som fotoblegning7, når de udsættes for stråling i excitationsprocessen. Desuden er Escherichia coli celler også følsomme for excitation, hvilket kan føre til fototoksicitet7. Begge problemer begrænser mængden af fotorammer, der kan erhverves, og tiden mellem erhvervelser. Det substrat og de mellemtyper (f.eks. lysogene bouillon), der bruges til at dyrke cellerne under billeddannelse, spiller også en afgørende rolle. Vi anbefaler på det kraftigste at bruge minimalt medium, hvilket minimerer ikke-fluorescerende baggrund og forlænger celledelingstiden.
Desuden skal prøven fremstilles under hensyntagen til følgende krav (1) Lav celledelingshastighed giver mulighed for mindre hyppige eksponeringer for nøje billeddannelse af opdelingscyklussen og reducerer sandsynligheden for fototoksicitet og fotobleaching. Vi indstiller erhvervelsestiden til omkring halvdelen af den forventede mitosetid (2) Lav celletæthed i begyndelsen af eksperimentet giver mulighed for bedre ensartethed og sporbarhed af division. Celletætheden påvirkes af fortyndingsforholdet for Escherichia coli-cellerne, som er en væsentlig parameter for denne protokols succes og skal bestemmes for hvert laboratorium. For at fastslå forholdet bør hver ny Escherichia coli-stamme eller de anvendte medier være forsynet med vækstratediagrammer (supplerende figur 1). Der er opnået et passende forhold, hvis cellerne kan vokse uden yderligere rysten efter en kort inkubation fra en indledende tæthed på ca. OD600nm = 0,1. Celler i denne fase vil opdeles i henhold til miljøtemperaturen kun (3) Begrænsning af cellebevægelse: cellebevægelse afhænger stærkt af substrat (agarose pad) fasthed. Substratet fasthed afhænger af mængden af total agarose og gel størkning tid. Geler kan ikke overlades til størkne natten over ved stuetemperatur, da Escherichia coli vil gennemgå mitose. Andre faktorer, der påvirker substratstabiliteten, omfatter mængden af vand i prøven og fugtigheden. Yderligere spørgsmål behandles i detaljer i de repræsentative resultater. Denne protokol indeholder mange detaljer og flytter gradvist fra et trin til et andet. Protokollen giver lang stabilitet til billedeksperimenter og giver et grundlæggende billedbehandlingsværktøj.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:748px;" width="747">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">35mm glass dish</td>
			<td style="width:216px;">mattek</td>
			<td style="width:137px;">P35G-0.170-14-C</td>
			<td style="width:172px;">thickness corresponding with microscope lense.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Agarose&#160;</td>
			<td style="width:216px;">Lonza</td>
			<td style="width:137px;">5004</td>
			<td>LB preperation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">AHL&#160;</td>
			<td style="width:216px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">K3007</td>
			<td>inducer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Bacto tryptone&#160;</td>
			<td style="width:216px;">BD - Becton, Dickinson and Company&#160;</td>
			<td style="width:137px;">211705</td>
			<td>LB preperation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Carb</td>
			<td style="width:216px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:137px;">10177-012</td>
			<td>antibiotic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Carb</td>
			<td style="width:216px;">Formedium</td>
			<td style="width:137px;">CAR0025</td>
			<td>antibiotic</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Casamino acids&#160;</td>
			<td style="width:216px;">BD - Becton, Dickinson and Company&#160;</td>
			<td style="width:137px;">223050</td>
			<td>minimal media solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">eclipse Ti</td>
			<td style="width:216px;">nikon</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td>inverted microscope</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Glucose</td>
			<td style="width:216px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">G5767</td>
			<td>minimal media solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Glyserol</td>
			<td style="width:216px;">Bio-Lab</td>
			<td style="width:137px;">000712050100</td>
			<td>minimal media substrate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Immersol 518F</td>
			<td style="width:216px;">zeiss</td>
			<td style="width:137px;">4449600000000</td>
			<td>immersion oil</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">M9 salt solution&#160;</td>
			<td style="width:216px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">M6030</td>
			<td>minimal media solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">NaCl</td>
			<td style="width:216px;">Bio-Lab</td>
			<td style="width:137px;">214010</td>
			<td>LB preperation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Noble agar</td>
			<td style="width:216px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">A5431</td>
			<td>minimal media substrate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">parafilm tape</td>
			<td style="width:216px;">Bemis</td>
			<td style="width:137px;">PM-996</td>
			<td>refered to as tape in text</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Seaplaque GTG Agarose</td>
			<td style="width:216px;">Lonza</td>
			<td style="width:137px;">50111</td>
			<td>minimal media substrate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">thaymine B1</td>
			<td style="width:216px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">T0376&#160;</td>
			<td>minimal media solution</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Yeast Extract</td>
			<td style="width:216px;">BD - Becton, Dickinson and Company&#160;</td>
			<td style="width:137px;">212750</td>
			<td>LB preperation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

continuous measurement of biological noise in escherichia coli using time-lapse microscopy

Protokollen udviklet her tilbyder et værktøj til at muliggøre computer sporing af Escherichia coli division og fluorescerende niveauer over flere timer. Processen starter med screening for kolonier, der overlever på minimale medier, idet det antages, at kun Escherichia coli huser den korrekte plasmid vil være i stand til at trives i de specifikke forhold. Da processen med at opbygge store genetiske kredsløb, der kræver samling af mange DNA-dele, er udfordrende, er kredsløbskomponenter ofte fordelt mellem flere plasmider ved forskellige kopinumre, der kræver brug af flere antibiotika. Mutationer i plasmid kan ødelægge transskription af antibiotikaresistens gener og indskyde med ressourcer forvaltning i cellen, der fører til nekrose. Den valgte koloni er sat på en glasbundet petriskål, og et par fokusplaner er udvalgt til mikroskopisporing i både lyse felt- og fluorescerende domæner. Protokollen opretholder billedfokus i mere end 12 timer under indledende forhold, der ikke kan reguleres, hvilket skaber nogle få vanskeligheder. For eksempel begynder døde celler at akkumulere i linsernes fokusområde efter et par timers billeddannelse, hvilket får toksiner til at opbygge og signalet til at sløre og forfalde. Udtømning af næringsstoffer introducerer nye metaboliske processer og hindrer kredsløbets ønskede respons. Eksperimentets temperatur sænker effektiviteten af inducere og antibiotika, hvilket yderligere kan skade signalets pålidelighed. Den minimale mediegel krymper og tørrer, og som følge heraf ændres det optiske fokus over tid. Vi udviklede denne metode til at overvinde disse udfordringer i Escherichia coli, svarende til tidligere værker, der udvikler analoge metoder til andre mikroorganismer. Derudover tilbyder denne metode en algoritme til at kvantificere den samlede stokastiske støj i uændrede og ændrede celler og finder ud af, at resultaterne er i overensstemmelse med flowanalysatorforudsigelser som vist ved en lignende variationskoefficient (CV).

Softwaren analyserer lyse felt domæne billeder, der er off-white og sort. Den Escherichia coli vil ligne sorte aflange former på en off-white baggrund og dynamisk område af luminans bør vise en spike i centrum(Figur 1). I fluorescerende billeder celler kan have en lille glorie, men individuelle celler med aflange former kan stadig løses. En mitosehændelse skal først påvises efter 30 minutter. Mikroskop fokus bør forblive stabil over tid, og selv om cellerne kan bevæge sig ...

Watch this Scientific Journal Video about Continuous Measurement of Biological Noise in Escherichia Coli Using Time-lapse Microscopy at JoVE.com

Continuous Measurement of Biological Noise in Escherichia Coli Using Time-lapse Microscopy

Dette arbejde præsenterer en mikroskopi metode, der tillader levende billeddannelse af en enkelt celle af Escherichia coli til analyse og kvantificering af stokastisk adfærd syntetiske gen kredsløb.

Kontinuerlig måling af biologisk støj i Escherichia Coli ved hjælp af time-lapse mikroskopi

The protocol developed here offers a tool to enable computer tracking of Escherichia coli division and fluorescent levels over several hours. The process ...

Denne protokol i naturlægemidler kontinuerlig måling af genetiske kredsløb i E.coli og beregning af signalvariationen og signal-til-støj-forholdet i individuelle bakterieceller for at vurdere kredsløbets ydeevne. De vigtigste fordele ved denne teknik er, at den let kan tilpasses forskellige stammer og laboratorier, kræver minimal træning og intet specielt udstyr og er relativt billigt. Støj er en væsentlig rolle i fastlæggelsen af funktionaliteten af biologiske systemer.I øjeblikket er der en interesse i at bygge store genkredsløb. Disse systemer kan hæmmes af støj Sørg for at tørre prøverne godt, for at holde chill pads ved fire grader Celsius så længe som muligt, og for at skære og opdele delene tålmodigt og forsigtigt. At forberede bakterierne til analysen vaccinere en enkelt koloni fra en transfected E.coli kultur.For eksempel et kredsløb med en GFP reporter. I et glasrør, der indeholder fem milliliter LB bouillon supplere det med de relevante antibiotika. Vokse cellerne ved 37 grader Celsius og 250 omdrejninger i minuttet i en rystende inkubator i to timer, indtil bouillon er overskyet.Ved afslutningen af inkubationen skal du dreje en milliliter fortyndingsopløsning ned i en to milliliter mini mikrocentrifuge og overføre 30 mikroliter bakterier og hele mængden af fortyndingsopløsning til et nyt to milliliterrør. Derefter inkuberes kulturen i en time med rysten, før du sår 40 til 60 mikroliter af denne suspension på M9-kulturplader. For at forberede bakterierne til analysen skal du vaccinere en enkelt koloni fra en transfected E.Coli-kultur.For eksempel et kredsløb med en GFP reporter i et glasrør, der indeholder fem milliliter LB bouillon suppleret med de relevante antibiotika. Vokse cellerne ved 37 grader Celsius og 250 omdrejninger i minuttet i en rystende inkubator i to timer, indtil bouillon er overskyet. Ved afslutningen af inkubationen skal du dreje en milliliter fortyndingsopløsning ned i et to milliliter mini mikrocentrifugerør og overføre 30 mikroliter bakterier og hele mængden af fortyndingsopløsning til et nyt to milliliterrør.Derefter inkubere kulturen i en time med rysten. For at forberede mikroskopplader blandes 112,5 milligram lav smeltende agar med 40 milligram agar og en milliliter 2%casaminosyre i en 25 milliliter Erlenmeyer kolbe. Dernæst tilsættes 8,92 milliliter minimal medium over de indre læber af en 25 milliliter Erlenmeyer kolbe og mikrobølgeovn den resulterende opløsning i korte, to til tre sekunder brister.Sæt derefter vandbadet til 55 grader Celsius. Når opløsningen er klar, skal du placere 25 milliliter Erlenmeyer kolben i et 60 grader Celsius vandbad og lad agaropløsningen køle af, indtil temperaturen falder til ca. 45 til 50 grader Celsius. Mens agarkøling, rengør lab bænken med 70% ethanol og glat et stykke lab tape på den rensede bænk.Placer et glasdæksel slip på båndet og placere en anden dækning slip i nærheden. Tilsæt afkølet agaropløsning til de relevante antibiotika og opløsning. Hæld 1,5 milliliter frisklavet til gelopløsning på dækslet glide placeret over båndet og læg det andet dæksel glide på gelen, idet man sørger for at undgå bobler.Returner Erlenmeyer til varmtvandsbadet og dæk dækslet i 20 minutter. Vend dækslet glider i en times inkubation ved fire grader Celsius. I slutningen af inkubationen fjernes dækslet fra den tørre gel og skæres en lille pude fra agarose.Under inkubationen tilsættes seks mikroliterdråber af den forberedte bakteriele suspension i en 35 millimeter skål og lad dråberne tørre i mindst 15 til 30 minutter. Placer derefter forsigtigt puden ad gangen på en dråbe bakterier og lad prøverne indstille i 20 minutter ved stuetemperatur. Hvis du vil placere agarbunden uden at smøre prøven, skal du forsigtigt placere den kølige pude på dråben med skånsomt tryk.For at afbilde prøverne skal du fjerne kolben fra vandet og lade gelopløsningen køle af til kropstemperaturen. Hæld tre millimeter af gelen på prøvepladens omkreds. Når agarose har størknet, forsegle pladen med tape og bruge en 25 gauge nål til at stykke flere huller i båndet.Placer derefter pladen på hovedet ved fire grader Celsius i mindst 30 minutter for at lade agarose fuldt størkne, samtidig med at cellemideose forhindres. Inden for 24 timer skal du bruge et fluorescenskonfokalt mikroskop til at lokalisere prøven ved den laveste forstørrelse og engagere mikroskopets automatiske fokussystem. Påfør olie til det relevante mål, og brug platformcontrolleren til at flytte pladen for omhyggeligt at sprede olien.Derefter engagere den automatiske fokus igen og følg standardforslaget til Z trin tværsnit for at billedet prøven. E.coli skal fremstå som sorte aflange former på en ikke-hvid baggrund. Og det dynamiske område af luminansen skal vise en stigning i midten.Mitosehændelser kan først påvises ved fluorescensmikroskopi efter 30 minutter. Selvom individuelle celler kan være svære at opdage ved lav forstørrelse. Bakteriecellekulturer, der er udarbejdet ved et forkert fortyndingsforhold, kan påvise uændrede antal celler, og prøver, der er tilberedt uden pladeforsegling, kan udvise overdreven krympning, hvilket resulterer i tab af fokus.Celler kan også indrykke gelen i deres søgen efter næringsstoffer, hvilket resulterer i stabling af bakteriecellerne oven på hinanden og kompromittere cellens monolayer, hvilket effektivt forhindrer celledetektion og pålidelig fluorescerende signalmåling. Som foreslået af disse data påvirker cellestadiet i opdelingscyklussen ikke støjniveauet, da forskellige områdeområder viser den samme tendens. Desuden observeres der ingen væsentlig ændring i signal-til-støj-forholdet mellem GFP og superfoldig GFP, som det fremgår af disse repræsentative data.Når du udfører denne procedure, skal du sørge for at bestemme det korrekte fortyndingsforhold for den bakteriestamme, der bruges til forsøget. Sammenligning af signal-til-støj-forholdet for hvert reguleret kredsløb til denne basislinje giver mulighed for valg af det bedste ydelseskredsløb og kan afsløre interessante fænomener

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Continuous Measurement of Biological Noise in Escherichia Coli Using Time-lapse Microscopy

Engineering Biological-Based Vascular Grafts Using a Pulsatile Bioreactor

Much effort has been devoted to develop and advance the methodology to regenerate functional small-diameter arterial bypasses. In the physiological ...

Three-dimensional Optical-resolution Photoacoustic Microscopy

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As ...

Fluorescent Nanoparticles for the Measurement of Ion Concentration in Biological Systems

Tightly regulated ion homeostasis throughout the body is necessary for the prevention of such debilitating states as dehydration.1 In contrast, rapid ion ...

Time-lapse Fluorescence Imaging of Arabidopsis Root Growth with Rapid Manipulation of The Root Environment Using The RootChip

Time-lapse fluorescensimagografi af Arabidopsis rodvækst med Rapid Manipulation af The Root miljøet ved hjælp af RootChip

The root functions as the physical anchor of the plant and is the organ responsible for uptake of water and mineral nutrients such as nitrogen, ...

In situ TEM of Biological Assemblies in Liquid

In situ TEM of Biological Assemblies in Liquid

På stedet TEM af biologiske samlinger i væske

Researchers regularly use Transmission Electron Microscopes (TEMs) to examine biological entities and to assess new materials. Here, we describe an ...

Sample Drift Correction Following 4D Confocal Time-lapse Imaging

Sample Drift Korrektion Efter 4D Confocal Time-lapse Imaging

The generation of four-dimensional (4D) confocal datasets; consisting of 3D image sequences over time; provides an excellent methodology to capture ...

Surface Potential Measurement of Bacteria Using Kelvin Probe Force Microscopy

Overflade Potentiel Måling af Bakterier Brug Kelvin Probe force mikroskopi

Surface potential is a commonly overlooked physical characteristic that plays a dominant role in the adhesion of microorganisms to substrate surfaces. ...

Design and Construction of Artificial Extracellular Matrix (aECM) Proteins from Escherichia coli for Skin Tissue Engineering

Design and Construction of Artificial Extracellular Matrix aECM Proteins from Escherichia coli for Skin Tissue Engineering

Design og konstruktion af Artificial ekstracellulære matrix (aECM) Proteiner fra<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Til Hud Tissue Engineering

Recombinant technology is a versatile platform to create novel artificial proteins with tunable properties. For the last decade, many artificial proteins ...

A Novel Technique for Generating and Observing Chemiluminescence in a Biological Setting

En ny teknik til generering og Observing Kemiluminescens i en biologisk indstilling

Intraoperative imaging techniques have the potential to make surgical interventions safer and more effective; for these reasons, such techniques are ...