Name: continuous measurement of biological noise in escherichia coli using time-lapse microscopy
Uploaded: 2021-04-27T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Continuous Measurement of Biological Noise in Escherichia Coli Using Time-lapse Microscopy at JoVE.com

Wij danken de heer Gil Gelbert (Faculteit Elektrotechniek, Technion) voor het assisteren bij de MATLAB code. We danken Dr. Ximing Li (Faculty of bio-medical Engineering, Technion) voor het helpen bewijzen van dit artikel. Dit onderzoek werd gedeeltelijk ondersteund door de Neubauer Family Foundation en het Israëlische ministerie van Wetenschap, subsidie 2027345.

1. Media- en cultuurvoorbereiding
<ol><li>Bereid stamoplossing van 1.000x carbenicilline (50 mg/ml) of relevant antibioticum.<ol>
<li>. Weeg 0,5 g carbenicilline. Voeg 10 ml steriel H2O. Volledig oplossen toe.</li>
		<li>Steriliseer de carbenicillinevoorraad via een spuitfilter van 0,22 μm. Aliquot de antibiotica-oplossing en bewaar bij -20 °C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Voor het bereiden van lysogene bouillon (LB) platen, meng 5 g trypton, 5 g NaCl, 2,5 g gistextract en 7,5 g Bacto agar met 0...

<ol>
	<li>Daniel, R., Rubens, J. R., Sarpeshkar, R., Lu, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+analog+computation+in+living+cells.">Synthetic analog computation in living cells.</a> Nature. 497, 619-623 (2013).</li><li>Yang, X. S. Y., L, A. B., Harwood, C., Jensen, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Imaging Bacterial Molecules, Structures and Cells. , (2016).</li><li>Joyce, G., Robertson, B. D., Williams, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modified+agar+pad+method+for+mycobacterial+live-cell+imaging.">A modified agar pad method for mycobacterial live-cell imaging.</a> Biomedcentral Research Notes. , (2011).</li><li>Cotlet, M., Goodwin, P. M., Waldo, G. S., Werner, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+the+fluorescence+dynamics+of+single+molecules+of+a+green+fluorescent+protein:+One-+versus+two-photon+excitation.">A comparison of the fluorescence dynamics of single molecules of a green fluorescent protein: One- versus two-photon excitation.</a> ChemPhysChem. , (2006).</li><li>Andersen, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+unstable+variants+of+green+fluorescent+protein+for+studies+of+transient+gene+expression+in+bacteria.">New unstable variants of green fluorescent protein for studies of transient gene expression in bacteria.</a> Applied and Environmental Microbiology. 64, 2240-2246 (1998).</li><li>Barger, N., Litovco, P., Li, X., Habib, M., Daniel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+metabolic+computation+in+a+bioluminescence-sensing+system.">Synthetic metabolic computation in a bioluminescence-sensing system.</a> Nucleic Acids Research. , (2019).</li><li>Young, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+single-cell+gene+expression+dynamics+in+bacteria+using+fluorescence+time-lapse+microscopy.">Measuring single-cell gene expression dynamics in bacteria using fluorescence time-lapse microscopy.</a> Nature Protocols. , (2012).</li><li>Swain, P. S., Elowitz, M. B., Siggia, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+and+extrinsic+contributions+to+stochasticity+in+gene+expression.">Intrinsic and extrinsic contributions to stochasticity in gene expression.</a> Proceedings of the National Academy of Science United States. , (2002).</li><li>Elowitz, M. B., Levine, A. J., Siggia, E. D., Swain, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stochastic+gene+expression+in+a+single+cell.">Stochastic gene expression in a single cell.</a> Science. , (2002).</li><li>Baumgart, L., Mather, W., Hasty, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synchronized+DNA+cycling+across+a+bacterial+population.">Synchronized DNA cycling across a bacterial population.</a> Nature Genetics. , (2017).</li><li>Arriaga, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+biological+noise+via+single+cell+analysis.">Determining biological noise via single cell analysis.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. , (2009).</li><li>Nielsen, A. A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+circuit+design+automation.">Genetic circuit design automation.</a> Science. , (2016).</li><li>Ozbudak, E. M., Thattai, M., Kurtser, I., Grossman, A. D., van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+noise+in+the+expression+of+a+single+gene.">Regulation of noise in the expression of a single gene.</a> Nature Genetics. 31, 69-73 (2002).</li><li>Pedraza, J. H., Van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noise+propagations+in+gene+networks.">Noise propagations in gene networks.</a> Science. , (2005).</li><li>Jennifer, A. N. B., Christopher, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+genetic+circuit+design.">Principles of genetic circuit design.</a> Nature Methods. , (2014).</li><li>Aoki, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+universal+biomolecular+integral+feedback+controller+for+robust+perfect+adaptation.">A universal biomolecular integral feedback controller for robust perfect adaptation.</a> Nature. , (2019).</li><li>Hanna, H. A., Danial, L., Kvatinsky, S., Daniel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cytomorphic Electronics with Memristors for Modeling Fundamental Genetic Circuits. 4545, (2020).</li><li>de Jong, I. G., Beilharz, K., Kuipers, O. P., Veening, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+cell+imaging+of+Bacillus+subtilis+and+Streptococcus+pneumoniae+using+automated+time-lapse+microscopy.">Live cell imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using automated time-lapse microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2011).</li><li>Eling, N., Morgan, M. D., Marioni, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+in+measuring+and+understanding+biological+noise.">Challenges in measuring and understanding biological noise.</a> Nature Reviews Genetics. , (2019).</li><li>Thattai, M., Van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Attenuation+of+noise+in+ultrasensitive+signaling+cascades.">Attenuation of noise in ultrasensitive signaling cascades.</a> Biophysical Journal. , (2002).</li><li>Thattai, M., Van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+noise+in+gene+regulatory+networks.">Intrinsic noise in gene regulatory networks.</a> Proceedings of the National Academy of Science United States. , (2001).</li><li>Rosenfeld, N., Young, J. W., Alon, U., Swain, P. S., Elowitz, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+regulation+at+the+single-cell+level.">Gene regulation at the single-cell level.</a> Science. , (2005).</li><li>Van Der Ziel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Noise in Measurements. , (1976).</li><li>Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+cloning:+A+laboratory+manual.+2nd+Edition.">Molecular cloning: A laboratory manual. 2nd Edition.</a> Cold Spring Harbor Laboratory Press. , (1989).</li><li>Carpenter, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CellProfiler:+Image+analysis+software+for+identifying+and+quantifying+cell+phenotypes.">CellProfiler: Image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes.</a> Genome Biology. , (2006).</li><li>Paintdakhi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oufti:+An+integrated+software+package+for+high-accuracy,+high-throughput+quantitative+microscopy+analysis.">Oufti: An integrated software package for high-accuracy, high-throughput quantitative microscopy analysis.</a> Molecular Microbiology. , (2016).</li><li>Ducret, A., Quardokus, E. M., Brun, Y. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicrobeJ,+a+tool+for+high+throughput+bacterial+cell+detection+and+quantitative+analysis.">MicrobeJ, a tool for high throughput bacterial cell detection and quantitative analysis.</a> Nature Microbiology. , (2016).</li><li>Stylianidou, S., Brennan, C., Molecular, S. B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> SuperSegger: robust image segmentation, analysis and lineage tracking of bacterial cells - Stylianidou - 2016 - Molecular Microbiology. , (2016).</li><li>Balomenos, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image+analysis+driven+single-cell+analytics+for+systems+microbiology.">Image analysis driven single-cell analytics for systems microbiology.</a> Biomedcentral System Biology. , (2017).</li><li>Smit, J. H., Li, Y., Warszawik, E. M., Herrmann, A., Cordes, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colicoords:+A+Python+package+for+the+analysis+of+bacterial+fluorescence+microscopy+data.">Colicoords: A Python package for the analysis of bacterial fluorescence microscopy data.</a> PLoS One. , (2019).</li><li>Guido, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bottom-up+approach+to+gene+regulation.">A bottom-up approach to gene regulation.</a> Nature. , (2006).</li><li>Beal, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signal-to-noise+ratio+measures+efficacy+of+biological+computing+devices+and+circuits.">Signal-to-noise ratio measures efficacy of biological computing devices and circuits.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. , (2015).</li><li>Marr, D., Hildreth, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Theory+of+edge+detection.">Theory of edge detection.</a> Proceedings of the Royal Society - Biology Science. 207, 187-217 (1980).</li><li>Otsu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Threshold+selection+method+from+gray-level+histograms.">Threshold selection method from gray-level histograms.</a> IEEE Transactions Systems Man Cybernetics. , (1979).</li><li>Soille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Morphological Image Analysis: Principles and Applications, Second edition. , (2000).</li><li>Bradley, D., Roth, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptive+Thresholding+using+the+Integral+Image.">Adaptive Thresholding using the Integral Image.</a> Journal of Graphics Tools. , (2007).</li><li>Meyer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topographic+distance+and+watershed+lines.">Topographic distance and watershed lines.</a> Signal Processing. , (1994).</li><li>Maurer, C. R., Qi, R., Raghavan, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+linear+time+algorithm+for+computing+exact+Euclidean+distance+transforms+of+binary+images+in+arbitrary+dimensions.">A linear time algorithm for computing exact Euclidean distance transforms of binary images in arbitrary dimensions.</a> IEEE Transactions on Pattern Analysis and Machine. , (2003).</li><li>Millo, R., Phillips, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+is+the+maturation+time+for+fluorescent+proteins.">What is the maturation time for fluorescent proteins.</a> Cell Biology by Numbers. , (2015).</li></ol>

In dit werk hebben we een protocol ontwikkeld dat computertracering van Escherichia coli levende cellen mogelijk maakt, na deling en fluorescerende niveaus over een periode van uren. Dit protocol stelt ons in staat om de stochastische dynamiek van genetische circuits in Escherichia coli te kwantificeren door het CV en SNR in realtime te meten. In dit protocol vergeleken we het stochastische gedrag van twee verschillende circuits zoals weergegeven in figuur 10. Het is aangetoond dat plas...

Synthetische biologie is een multidisciplinair gebied dat in het afgelopen decennium is ontstaan en tot doel heeft technische ontwerpprincipes te vertalen naar rationeel biologisch ontwerp1,2,3, in een poging om multi-signaalintegratie en -verwerking in levende cellen te bereiken voor het begrijpen van de basiswetenschap4,5, diagnostische, therapeutische en biotechnologische toepassingen6,7,8,9,10. Ons vermogen om de input-output respons van synthetische gencircuits te kwantificeren is revolutionair veranderd door recente vooruitgang in eencellige technologie, waaronder de flow analyzer en live cell imaging met behulp van geautomatiseerde time-lapse microscopie11. Een stroomanalysator wordt vaak gebruikt om de respons van deze circuits in de steady state1,12te meten , en omgekeerde microscopie wordt gebruikt om de dynamische respons van synthetische gencircuits op het niveau van een enkele cel te meten3. Een van de vroege werken in de synthetische biologie betrof bijvoorbeeld de bouw van genetische oscillatornetwerken in levende cellen met behulp van negatieve feedbacklussen met een vertraging3. Later werden de genetische oscillatorcircuits toegepast om de metabolische controle in de dynamische omgeving van levende cellen te begrijpen4. Geautomatiseerde time-lapse microscopie is een methode om dergelijke circuits te karakteriseren. We veronderstellen dat de gastheercellen, Escherichia coli,synchroniseren bij het vormen van microkolonies, waardoor het meten van signaal en berekening van ruis mogelijk is zonder exacte moeder-dochterrelaties te volgen.
Lawaai is een fundamenteel, inherent aspect van biologische systemen die vaak uit meerdere bronnen voortkomen. Denk bijvoorbeeld aan biochemische reacties met signalen die afkomstig zijn van het transport van discrete willekeurige dragers, zoals diffusie van eiwitten13. Deze signalen verspreiden zich met willekeurige fluctuaties14. Andere geluidsbronnen zijn de beschikbaarheid van hulpbronnen, celdeling en variaties in omgevingsomstandigheden zoals temperatuur, vochtigheid en druk. Biologische signalen die zich voortplanten in synthetische gencircuits hebben vaak een zeer lage signaal-ruisverhouding (SNR), wat de prestaties van dergelijke circuits verstoort. Daarom blijft het ontwerp van genetische circuits een van de meest uitdagende aspecten van genetische manipulatie15. In tegenstelling tot de meeste benaderingen die alleen de gemiddelde genexpressie berekenen (gemeten over de gehele celpopulatie), wordt bijvoorbeeld de variantie van het gemeten signaal overwogen om voorspelbaar gedrag te ontwikkelen via synthetische gennetwerken12. Als zodanig spelen de variabiliteits - of ruisniveaus in de eiwitexpressie een dominante rol bij het ontwerp en de prestaties van analoge en digitale gencircuits1,16,17.
Er zijn vele benaderingen ontwikkeld om de variabiliteit tussen cellen te kwantificeren, onder meer in Escherichia coli3,7,18. Deze methoden worden vaak gebruikt om genactivatie en metabole routes te bestuderen, maar met minder focus op de studie van stochastische geluidsdynamica, zoals het meten en ontwarren van specifieke geluidsbronnen, vooral voor genetische circuits in levende cellen waar dit een fundamentele uitdaging is19,20,21. Verschillende factoren, zowel overgeërfd aan het circuit zelf (intrinsiek) als afgeleid van de gastheercellen (extrinsiek), kunnen de continue prestaties van genetische circuits verstoren. In dit artikel hebben we een protocol ontwikkeld dat tot doel heeft het totale geluid in Escherichia coli-cellen te kwantificeren, inclusief de intrinsieke en extrinsieke geluidsbronnen6,22. Door het totale geluid te kwantificeren en vervolgens de SNR23te evalueren, kan het ontwerp van gencircuits worden verbeterd. Deze methode kan worden aangepast om onafhankelijke geluidsbronnen afzonderlijk te meten, door verschillende fluorescerende eiwitten6,20temonitoren . Voor het hier beschreven protocol houden we de omgevingsomstandigheden goed onder controle en meten we continu de activiteit van cellen zonder invloed van externe factoren. We meten het signaal van fluorescerende eiwitten in enkele cellen in de loop van de tijd en stellen ze tegelijkertijd in beeld onder een agarosesubstraat. De resulterende beelden worden geanalyseerd met behulp van het aangepaste MATLAB van het laboratorium.
Idealiter zal continue meting van de real-time activiteit van fluorescerende eiwitten in een cel nauwkeurige gegevens produceren door de groei en deling van de cellen. Het is echter een uitdaging om dergelijke gegevens te verkrijgen. Dit komt door afbraak van fluorescerende eiwitten, bekend als fotobleken7, wanneer ze worden blootgesteld aan straling in het excitatieproces. Bovendien zijn Escherichia coli-cellen ook gevoelig voor de excitatie, wat kan leiden tot fototoxiciteit7. Beide kwesties beperken de hoeveelheid fotolijsten die kunnen worden verkregen en de tijd tussen verwervingen. Ook het substraat en de mediumtypes (bijv. lysogeney bouillon) die worden gebruikt om de cellen tijdens beeldvorming te laten groeien, spelen een cruciale rol. We raden ten zeerste aan om minimaal medium te gebruiken, dat de niet-fluorescerende achtergrond minimaliseert en de celdelingstijd verlengt.
Bovendien moet het monster worden bereid met inachtneming van de volgende vereisten (1) Een lage celdelingsgraad maakt minder frequente blootstellingen mogelijk om de delingcyclus nauwkeurig in beeld te brengen en de kans op fototoxiciteit en fotobleaching te verminderen. We hebben de acquisitietijd ingesteld op ongeveer de helft van de voorspelde mitosetijd (2) Lage celdichtheid aan het begin van het experiment zorgt voor een betere uniformiteit en trackability van deling. De celdichtheid wordt beïnvloed door de verdunningsverhouding van de Escherichia coli-cellen, wat een belangrijke parameter is voor het succes van dit protocol en voor elk laboratorium moet worden bepaald. Om de verhouding vast te stellen, moet elke nieuwe Escherichia coli-stam of -medium die wordt gebruikt, worden uitgerust met groeisnelheidsgrafieken (aanvullende figuur 1). Een geschikte verhouding is bereikt als cellen kunnen groeien zonder extra schudden na een korte incubatie van een initiële dichtheid van ongeveer OD600nm = 0,1. Cellen in deze fase zullen zich alleen delen afhankelijk van de omgevingstemperatuur (3) Beperking van celbeweging: celbeweging is sterk afhankelijk van de stevigheid van substraat (agarose pad). De stevigheid van het substraat hangt af van de hoeveelheid totale agarose en de gelstollingstijd. Gels kunnen niet 's nachts bij kamertemperatuur worden gestold, omdat de Escherichia coli mitose zal ondergaan. Andere factoren die de substraatstabiliteit beïnvloeden, zijn de hoeveelheid water in het monster en de vochtigheid. Aanvullende kwesties worden in detail besproken in de representatieve resultaten. Dit protocol biedt veel details en gaat geleidelijk van de ene stap naar de andere. Het protocol biedt lange stabiliteit voor beeldvormingsexperimenten en biedt een basistool voor beeldverwerking.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:748px;" width="747">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">35mm glass dish</td>
			<td style="width:216px;">mattek</td>
			<td style="width:137px;">P35G-0.170-14-C</td>
			<td style="width:172px;">thickness corresponding with microscope lense.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Agarose&#160;</td>
			<td style="width:216px;">Lonza</td>
			<td style="width:137px;">5004</td>
			<td>LB preperation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">AHL&#160;</td>
			<td style="width:216px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">K3007</td>
			<td>inducer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Bacto tryptone&#160;</td>
			<td style="width:216px;">BD - Becton, Dickinson and Company&#160;</td>
			<td style="width:137px;">211705</td>
			<td>LB preperation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Carb</td>
			<td style="width:216px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:137px;">10177-012</td>
			<td>antibiotic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Carb</td>
			<td style="width:216px;">Formedium</td>
			<td style="width:137px;">CAR0025</td>
			<td>antibiotic</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Casamino acids&#160;</td>
			<td style="width:216px;">BD - Becton, Dickinson and Company&#160;</td>
			<td style="width:137px;">223050</td>
			<td>minimal media solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">eclipse Ti</td>
			<td style="width:216px;">nikon</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td>inverted microscope</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Glucose</td>
			<td style="width:216px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">G5767</td>
			<td>minimal media solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Glyserol</td>
			<td style="width:216px;">Bio-Lab</td>
			<td style="width:137px;">000712050100</td>
			<td>minimal media substrate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Immersol 518F</td>
			<td style="width:216px;">zeiss</td>
			<td style="width:137px;">4449600000000</td>
			<td>immersion oil</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">M9 salt solution&#160;</td>
			<td style="width:216px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">M6030</td>
			<td>minimal media solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">NaCl</td>
			<td style="width:216px;">Bio-Lab</td>
			<td style="width:137px;">214010</td>
			<td>LB preperation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Noble agar</td>
			<td style="width:216px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">A5431</td>
			<td>minimal media substrate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">parafilm tape</td>
			<td style="width:216px;">Bemis</td>
			<td style="width:137px;">PM-996</td>
			<td>refered to as tape in text</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Seaplaque GTG Agarose</td>
			<td style="width:216px;">Lonza</td>
			<td style="width:137px;">50111</td>
			<td>minimal media substrate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">thaymine B1</td>
			<td style="width:216px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">T0376&#160;</td>
			<td>minimal media solution</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Yeast Extract</td>
			<td style="width:216px;">BD - Becton, Dickinson and Company&#160;</td>
			<td style="width:137px;">212750</td>
			<td>LB preperation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

continuous measurement of biological noise in escherichia coli using time-lapse microscopy

Het hier ontwikkelde protocol biedt een hulpmiddel om computertracking van Escherichia coli-deling en fluorescerende niveaus gedurende meerdere uren mogelijk te maken. Het proces begint met het screenen op kolonies die overleven op minimale media, ervan uitgaande dat alleen Escherichia coli die de juiste plasmide herbergt, in staat zal zijn om te gedijen in de specifieke omstandigheden. Omdat het proces van het bouwen van grote genetische circuits, waarvoor de assemblage van veel DNA-onderdelen vereist is, een uitdaging is, worden circuitcomponenten vaak verdeeld over meerdere plasmiden op verschillende kopieernummers die het gebruik van verschillende antibiotica vereisen. Mutaties in de plasmide kunnen transcriptie van de antibioticaresistentiegenen vernietigen en interject met middelenbeheer in de cel die leidt tot necrose. De geselecteerde kolonie is ingesteld op een petrischaal met glazen bodem en een paar focusvlakken zijn geselecteerd voor microscopietracking in zowel heldere veld- als fluorescerende domeinen. Het protocol handhaaft de beeldfocus gedurende meer dan 12 uur onder initiële omstandigheden die niet kunnen worden gereguleerd, waardoor een paar problemen ontstaan. Dode cellen beginnen zich bijvoorbeeld op te hopen in het scherpstelgebied van de lenzen na een paar uur beeldvorming, waardoor gifstoffen zich ophopen en het signaal vervaagt en vervaagt. Uitputting van voedingsstoffen introduceert nieuwe metabolische processen en belemmert de gewenste reactie van het circuit. De temperatuur van het experiment verlaagt de effectiviteit van inductoren en antibiotica, wat de betrouwbaarheid van het signaal verder kan schaden. De minimale mediagel krimpt en droogt, waardoor de optische focus in de loop van de tijd verandert. We ontwikkelden deze methode om deze uitdagingen in Escherichia colite overwinnen , vergelijkbaar met eerdere werken die analoge methoden voor andere micro-organismen ontwikkelden. Bovendien biedt deze methode een algoritme om de totale stochastische ruis in ongewijzigde en gewijzigde cellen te kwantificeren, waarbij wordt vastgesteld dat de resultaten consistent zijn met voorspellingen van stroomanalysatoren, zoals aangetoond door een vergelijkbare variatiecoëfficiënt (CV).

De software analyseert heldere velddomeinafbeeldingen die niet wit en zwart zijn. De Escherichia coli zal eruit zien als zwarte langwerpige vormen op een off-white achtergrond en dynamisch luminantiebereik moet een piek in het midden laten zien (Figuur 1). In fluorescerende beelden kunnen cellen een kleine halo hebben, maar individuele cellen met langwerpige vormen kunnen nog steeds worden opgelost. Een mitosegebeurtenis moet eerst na 30 minuten worden gedetecteerd. De focus van de ...

Watch this Scientific Journal Video about Continuous Measurement of Biological Noise in Escherichia Coli Using Time-lapse Microscopy at JoVE.com

Continuous Measurement of Biological Noise in Escherichia Coli Using Time-lapse Microscopy

Dit werk presenteert een microscopiemethode die live beeldvorming van een enkele cel Escherichia coli mogelijk maakt voor analyse en kwantificering van het stochastische gedrag van synthetische gencircuits.

Continue meting van biologische ruis in Escherichia Coli met behulp van time-lapse microscopie

The protocol developed here offers a tool to enable computer tracking of Escherichia coli division and fluorescent levels over several hours. The process ...

Dit protocol in kruiden continue meting van genetische circuits in E.coli en de berekening van de signaalvariabiliteit en signaal-ruisverhouding in individuele bacteriële cel om circuitprestaties te beoordelen. De belangrijkste voordelen van deze techniek zijn dat het gemakkelijk kan worden aangepast aan verschillende soorten en laboratoria, minimale training vereist en geen speciale apparatuur, en relatief goedkoop is. Geluid speelt een belangrijke rol bij het bepalen van de functionaliteit van biologische systemen.Momenteel is er interesse in het bouwen van grootschalige gencircuits. Deze systemen kunnen worden geremd door lawaai Zorg ervoor dat u de monsters goed droogt, om die koelpads zo lang mogelijk op vier graden Celsius te houden en om de onderdelen geduldig en voorzichtig te snijden en te verdelen. Om de bacteriën voor te bereiden op de analyse ent u een enkele kolonie uit een getransfecteerde E.coli-cultuur.Bijvoorbeeld een circuit met een GFP-verslaggever. In een glazen buis met vijf milliliter LB bouillon vullen het aan met de relevante antibiotica. Kweek de cellen op 37 graden Celsius en 250 omwentelingen per minuut in een schuddende incubator gedurende twee uur totdat de bouillon troebel is.Draai aan het einde van de incubatie een milliliter verdunningsoplossing in een mini-microcentrifuge van twee milliliter en breng 30 microliter bacteriën en het hele volume verdunningsoplossing over in een nieuwe buis van twee milliliter. Incubeer vervolgens de cultuur gedurende een uur met schudden voordat u 40 tot 60 microliters van deze suspensie op M9-cultuurplaten zaait. Om de bacteriën voor te bereiden op de analyse, ent u een enkele kolonie uit een getransfecteerde E.Coli-cultuur.Bijvoorbeeld een circuit met een GFP-verslaggever in een glazen buis met vijf milliliter LB-bouillon aangevuld met de relevante antibiotica. Kweek de cellen op 37 graden Celsius en 250 omwentelingen per minuut in een schuddende incubator gedurende twee uur totdat de bouillon troebel is. Draai aan het einde van de incubatie een milliliter verdunningsoplossing in een mini-microcentrifugebuis van twee milliliter en breng 30 microliter bacteriën en het hele volume verdunningsoplossing over in een nieuwe buis met twee milliliter.Incubeer vervolgens de cultuur een uur met schudden. Om microscoopplaten te bereiden, mengt u 112,5 milligram laagsmeltende agar met 40 milligram agar en één milliliter 2%casaminozuur in een Erlenmeyerkolf van 25 milliliter. Voeg vervolgens 8,92 milliliter minimaal medium toe over de binnenlippen van een Erlenmeyerkolf van 25 milliliter en magnetron de resulterende oplossing in het kort, twee tot drie seconden uitbarstingen.Zet vervolgens het waterbad op 55 graden Celsius. Wanneer de oplossing helder is, plaatst u de Erlenmeyer van 25 milliliter in een waterbad van 60 graden Celsius en laat u de agar-oplossing afkoelen tot de temperatuur daalt tot ongeveer 45 tot 50 graden Celsius. Reinig tijdens het koelen de labbank met 70% ethanol en strijk een stuk labtape glad op de gereinigde bank.Plaats een glazen afdekslip op de tape en plaats een tweede afdekslip in de buurt. Voeg gekoelde agar-oplossing toe aan de juiste antibiotica en oplossing. Giet 1,5 milliliter vers bereide geloplossing op de afdekslip die over de tape is geplaatst en plaats de tweede afdekslip op de gel, waarbij u ervoor zorgt dat bubbels worden vermeden.Breng de Erlenmeyer terug naar het warmwaterbad en bedek de afdekstroken gedurende 20 minuten. Draai de hoes slips voor een incubatie van een uur bij vier graden Celsius. Verwijder aan het einde van de incubatie de afdekglijders van de droge gel en snijd een klein kussentje uit de agarose.Voeg tijdens de incubatie zes microliterdruppels van de bereide bacteriële suspensie toe aan een schaal van 35 millimeter en laat de druppels minstens 15 tot 30 minuten drogen. Plaats de pad vervolgens voorzichtig op één druppel bacteriën en laat de monsters 20 minuten op kamertemperatuur zetten. Om het agarbed te plaatsen zonder het monster in te smeren, plaatst u de koele pad voorzichtig op de druppel met zacht tikken.Om de monsters in beeld te brengen, verwijdert u de kolf uit het water en laat u de geloplossing afkoelen tot lichaamstemperatuur. Giet drie millimeter van de gel op de omtrek van de monsterplaat. Wanneer de agarose is gestold, sluit u de plaat af met tape en gebruikt u een naald van 25 gauge om verschillende gaten in de tape te maken.Plaats vervolgens de plaat ondersteboven op vier graden Celsius gedurende ten minste 30 minuten om de agarose volledig te laten stollen, terwijl cel mitose wordt voorkomen. Gebruik binnen 24 uur een fluorescentie confocale microscoop om het monster bij de laagste vergroting te lokaliseren en het automatische scherpstelsysteem van de microscoop in te schakelen. Breng olie aan op het juiste doel en gebruik de platformcontroller om de plaat te verplaatsen om de olie voorzichtig te verspreiden.Schakel vervolgens de automatische scherpstelling opnieuw in en volg de standaardsuggestie voor Z-stapdoorsneden om het voorbeeld weer te geven. De E.coli moet verschijnen als zwarte langwerpige vormen op een off white achtergrond. En het dynamische bereik van de luminantie moet een piek in het midden laten zien.Mitosegebeurtenissen kunnen eerst na 30 minuten worden gedetecteerd door fluorescentiemicroscopie. Hoewel afzonderlijke cellen moeilijk te detecteren zijn bij een lage vergroting. Bacteriële celculturen bereid met een onjuiste verdunningsverhouding kunnen onveranderlijke aantallen cellen aantonen, en monsters die zonder plaatafdichting zijn bereid, kunnen overmatig krimp vertonen, wat resulteert in een verlies van focus.Cellen kunnen de gel ook inspringen in hun zoektocht naar voedingsstoffen, wat resulteert in het stapelen van de bacteriële cellen op elkaar en het compromitteren van de celmonolaag, waardoor celdetectie en betrouwbare fluorescerende signaalmeting effectief worden voorkomen. Zoals voorgesteld door deze gegevens, heeft de celfase in de delingscyclus geen invloed op het geluidsniveau, omdat verschillende oppervlaktebereiken dezelfde trend vertonen. Verder wordt geen substantiële verandering in de signaal-ruisverhouding waargenomen tussen GFP en supervoudig GFP, zoals blijkt uit deze representatieve gegevens.Let er bij het uitvoeren van deze procedure op dat u de juiste verdunningsverhouding bepaalt voor de bacteriële stam die voor het experiment wordt gebruikt. Het vergelijken van de signaal-ruisverhouding van elke gereguleerde circuits met deze basislijn maakt selectie van het beste prestatiecircuit mogelijk en kan interessante verschijnselen onthullen

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Continuous Measurement of Biological Noise in Escherichia Coli Using Time-lapse Microscopy

Engineering Biological-Based Vascular Grafts Using a Pulsatile Bioreactor

Techniek Biologisch-Based vaattransplantaten Met behulp van een Pulsatiele Bioreactor

Much effort has been devoted to develop and advance the methodology to regenerate functional small-diameter arterial bypasses. In the physiological ...

Three-dimensional Optical-resolution Photoacoustic Microscopy

Drie-dimensionale Optische resolutie Fotoakoestisch Microscopie

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As ...

Fluorescent Nanoparticles for the Measurement of Ion Concentration in Biological Systems

Fluorescerende Nanodeeltjes voor het meten van Ion Concentratie in Biological Systems

Tightly regulated ion homeostasis throughout the body is necessary for the prevention of such debilitating states as dehydration.1 In contrast, rapid ion ...

Time-lapse Fluorescence Imaging of Arabidopsis Root Growth with Rapid Manipulation of The Root Environment Using The RootChip

Time-lapse fluorescentie beeldvorming van Arabidopsis wortelgroei met Rapid Manipulatie van het wortelmilieu Het gebruik van de RootChip

The root functions as the physical anchor of the plant and is the organ responsible for uptake of water and mineral nutrients such as nitrogen, ...

In situ TEM of Biological Assemblies in Liquid

In situ TEM of Biological Assemblies in Liquid

Ter plaatse TEM van biologische assemblages in vloeistof

Researchers regularly use Transmission Electron Microscopes (TEMs) to examine biological entities and to assess new materials. Here, we describe an ...

Sample Drift Correction Following 4D Confocal Time-lapse Imaging

Monster Tijdafwijkingscorrectie Na 4D Confocal time-lapse imaging

The generation of four-dimensional (4D) confocal datasets; consisting of 3D image sequences over time; provides an excellent methodology to capture ...

Surface Potential Measurement of Bacteria Using Kelvin Probe Force Microscopy

Oppervlakte Potentieel Meting van Bacteriën Met behulp Kelvin Probe Force Microscopy

Surface potential is a commonly overlooked physical characteristic that plays a dominant role in the adhesion of microorganisms to substrate surfaces. ...

Design and Construction of Artificial Extracellular Matrix (aECM) Proteins from Escherichia coli for Skin Tissue Engineering

Design and Construction of Artificial Extracellular Matrix aECM Proteins from Escherichia coli for Skin Tissue Engineering

Ontwerp en constructie van kunstmatige extracellulaire matrix (AECM) Eiwitten uit<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Voor Skin Tissue Engineering

Recombinant technology is a versatile platform to create novel artificial proteins with tunable properties. For the last decade, many artificial proteins ...

A Novel Technique for Generating and Observing Chemiluminescence in a Biological Setting

Een nieuwe techniek voor het genereren en Observing Chemiluminescence in een biologische instelling

Intraoperative imaging techniques have the potential to make surgical interventions safer and more effective; for these reasons, such techniques are ...