Name: continuous measurement of biological noise in escherichia coli using time-lapse microscopy
Uploaded: 2021-04-27T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Continuous Measurement of Biological Noise in Escherichia Coli Using Time-lapse Microscopy at JoVE.com

Wir danken Herrn Gil Gelbert (Fakultät für Elektrotechnik, Technion) für die Unterstützung mit dem MATLAB-Code. Wir danken Dr. Ximing Li (Fakultät für biomedizinische Technik, Technion) für die Unterstützung bei der Korrektur dieses Artikels. Diese Forschung wurde teilweise von der Neubauer Family Foundation und dem israelischen Wissenschaftsministerium, Stipendium 2027345, unterstützt.

1. Medien- und Kulturvorbereitung
<ol><li>Bereiten Sie die Stammlösung von 1.000x Carbenicillin (50 mg/ml) oder relevantem Antibiotikum vor.<ol>
<li>. Wiegen Sie 0,5 g Carbenicillin. 10 ml sterilhh2O. vollständig auflösen.</li>
		<li>Sterilisieren Sie Carbenicillin-Lager durch einen 0,22 m Spritzenfilter. Aliquot die Antibiotikum-Lösung und lagern bei -20 °C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Zur Herstellung von Lysogeny-Brühe (LB) Platten, mischen 5 g Trypton, 5 g NaCl, 2,5 g Hefeextrakt und 7,5...

<ol>
	<li>Daniel, R., Rubens, J. R., Sarpeshkar, R., Lu, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+analog+computation+in+living+cells.">Synthetic analog computation in living cells.</a> Nature. 497, 619-623 (2013).</li><li>Yang, X. S. Y., L, A. B., Harwood, C., Jensen, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Imaging Bacterial Molecules, Structures and Cells. , (2016).</li><li>Joyce, G., Robertson, B. D., Williams, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modified+agar+pad+method+for+mycobacterial+live-cell+imaging.">A modified agar pad method for mycobacterial live-cell imaging.</a> Biomedcentral Research Notes. , (2011).</li><li>Cotlet, M., Goodwin, P. 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In dieser Arbeit haben wir ein Protokoll entwickelt, das die Computerverfolgung von Escherichia coli-Lebendzellen ermöglicht, die Teilung und Fluoreszenzüberstand über einen Zeitraum von Stunden verfolgen. Dieses Protokoll ermöglicht es uns, die stochastische Dynamik genetischer Schaltkreise in Escherichia coli zu quantifizieren, indem wir den Lebenslauf und SNR in Echtzeit messen. In diesem Protokoll haben wir das stochastische Verhalten von zwei verschiedenen Schaltkreisen verglichen, wie in <stro...

Synthetische Biologie ist ein multidisziplinäres Feld, das in den letzten zehn Jahren entstanden ist und darauf abzielt, technische Designprinzipien in rationales biologisches Design zu übersetzen1,2,3, in dem Bemühen, Multi-Signal-Integration und Verarbeitung in lebenden Zellen für das Verständnis der grundlegenden Wissenschaft4,5, diagnostische, therapeutische und biotechnologische Anwendungen6,7,8,9,10zu erreichen. Unsere Fähigkeit, die Input-Output-Antwort synthetischer Genkreise zu quantifizieren, wurde durch die jüngsten Fortschritte in der Einzelzelltechnologie, einschließlich des Durchflussanalysators und der Live-Zell-Bildgebung mittels automatisierter Zeitraffermikroskopie11, revolutioniert. Ein Strömungsanalysator wird häufig verwendet, um das Ansprechen dieser Schaltkreise im stationären Zustand1,12, und invertierte Mikroskopie wird verwendet, um die dynamische Reaktion von synthetischen Genkreisen auf der Ebene einer einzelnen Zelle3zu messen. Zum Beispiel, eine der frühen Arbeiten in der synthetischen Biologie beinhaltete den Aufbau von genetischen Oszillator-Netzwerken in lebenden Zellen mit negativen Rückkopplungsschleifen mit einer Verzögerung3. Später wurden die genetischen Oszillator-Schaltungen angewendet, um die metabolische Kontrolle in der dynamischen Umgebung der lebenden Zellen zu verstehen4. Die automatisierte Zeitraffermikroskopie ist eine Methode, um solche Schaltkreise zu charakterisieren. Wir vermuten, dass die Wirtszellen, Escherichia coli, bei der Bildung von Mikrokolonien synchronisieren, was die Messung von Signal und die Berechnung von Rauschen ermöglicht, ohne genaue Mutter-Tochter-Beziehungen zu verfolgen.
Lärm ist ein grundlegender, inhärenter Aspekt biologischer Systeme, die oft aus mehreren Quellen stammen. Man denke beispielsweise an biochemische Reaktionen mit Signalen, die aus dem Transport diskreter Zufälliger Träger wie die Diffusion von Proteinen13stammen. Diese Signale verbreiten sich mit zufälligen Schwankungen14. Weitere Lärmquellen sind Ressourcenverfügbarkeit, Zellteilung und Schwankungen der Umgebungsbedingungen wie Temperatur, Luftfeuchtigkeit und Druck. Biologische Signale, die sich in synthetischen Genkreisen ausbreiten, haben oft ein sehr niedriges Signal-Rausch-Verhältnis (SNR), das die Leistung solcher Schaltkreise stört. Daher bleibt das genetische Schaltungsdesign einer der anspruchsvollsten Aspekte der Gentechnik15. Im Gegensatz zu den meisten Ansätzen, die nur die mittlere Genexpression berechnen (gemessen über die gesamte Zellpopulation), wird die Varianz des gemessenen Signals berücksichtigt, um ein vorhersagbares Verhalten durch synthetische Gennetzwerke zu entwickeln12. Daher spielen die Variabilitäts- oder Rauschengrade in der Proteinexpression eine dominierende Rolle bei der Gestaltung und Leistung analoger und digitaler Genkreise1,16,17.
Viele Ansätze wurden entwickelt, um die Zell-zu-Zell-Variabilität zu quantifizieren, unter anderem in Escherichia coli3,7,18. Diese Methoden werden häufig verwendet, um Genaktivierung und Stoffwechselwege zu studieren, jedoch mit weniger Fokus auf die Untersuchung der stochastischen Lärmdynamik, wie das Messen und Entwirren spezifischer Lärmquellen, insbesondere für genetische Schaltkreise in lebenden Zellen, wo dies eine grundlegende Herausforderung ist19,20,21. Mehrere Faktoren, die sowohl an den Schaltkreis selbst (intrinsisch) vererbt als auch von den Wirtszellen abgeleitet werden (extrinsisch), können die kontinuierliche Leistung genetischer Schaltkreise stören. In diesem Beitrag haben wir ein Protokoll entwickelt, das darauf abzielt, das Gesamtrauschen in Escherichia coli-Zellen zu quantifizieren, einschließlich der intrinsischen und extrinsischen Lärmquellen6,22. Durch quantifizieren des Gesamtrauschens und anschließende Bewertung des SNR23kann die Konstruktion von Genkreisläufen verbessert werden. Diese Methode kann modifiziert werden, um unabhängige Rauschquellen getrennt zu messen, indem mehrere fluoreszierende Proteine6,20überwacht werden. Für das hier beschriebene Protokoll halten wir die Umgebungsbedingungen gut kontrolliert und messen kontinuierlich die Aktivität von Zellen ohne Einfluss externer Faktoren. Wir messen das Signal von fluoreszierenden Proteinen in einzelnen Zellen im Laufe der Zeit und stellen es gleichzeitig unter einem Agarosesubstrat ab. Die resultierenden Bilder werden mit dem kundenspezifischen MATLAB des Labors analysiert.
Im Idealfall wird die kontinuierliche Messung der Echtzeitaktivität von fluoreszierenden Proteinen in einer Zelle genaue Daten durch das Wachstum und die Teilung der Zellen erzeugen. Es ist jedoch schwierig, solche Daten zu erfassen. Dies ist auf den Abbau von fluoreszierenden Proteinen, bekannt als Photobleichung7, zurückzuführen, wenn sie im Anregungsprozess Strahlung ausgesetzt sind. Darüber hinaus sind Escherichia coli Zellen auch empfindlich für die Anregung, die zu Phototoxizität führen könnte7. Beide Ausgaben begrenzen die Anzahl der fotorahmen, die erworben werden können, und die Zeit zwischen den Akquisitionen. Eine entscheidende Rolle spielen auch die Substrat- und Mitteltypen (z.B. Lysogeny-Brühe), die zum Wachstum der Zellen während der Bildgebung verwendet wird. Wir empfehlen dringend die Verwendung von minimalem Medium, das den nicht fluoreszierenden Hintergrund minimiert und die Zellteilungszeit verlängert.
Darüber hinaus muss die Probe unter Berücksichtigung der folgenden Anforderungen vorbereitet werden (1) Niedrige Zellteilungsrate ermöglicht weniger häufige Expositionen für die genaue Abbildung des Teilungszyklus und die Verringerung der Wahrscheinlichkeit von Phototoxizität und Photobleichungen. Wir stellen die Erfassungszeit auf etwa die Hälfte der vorhergesagten Mitosezeit (2) Niedrige Zelldichte zu Beginn des Experiments ermöglicht eine bessere Homogenität und Nachverfolgbarkeit der Teilung. Die Zelldichte wird durch das Verdünnungsverhältnis der Escherichia coli-Zellen beeinflusst, das ein wichtiger Parameter für den Erfolg dieses Protokolls ist und für jedes Labor bestimmt werden muss. Um das Verhältnis zu ermitteln, sollte jeder neue Escherichia coli-Stamm oder jede verwendete Form mit Wachstumsratendiagrammen versehen werden (Zusatzabbildung 1). Ein angemessenes Verhältnis wurde erreicht, wenn Zellen nach einer kurzen Inkubation von einer Anfangsdichte von etwa OD600nm = 0,1 ohne zusätzliches Schütteln wachsen können. Zellen in dieser Phase teilen sich nur nach der Umgebungstemperatur (3) Einschränkung der Zellbewegung: Die Zellbewegung hängt stark von der Festigkeit des Substrats (Agarosepad) ab. Die Festigkeit des Substrats hängt von der Menge der gesamten Agarose und der Gelerstarrungszeit ab. Gele können nicht über Nacht bei Raumtemperatur erstarren, da die Escherichia coli an Einer Mitose erleidet. Andere Faktoren, die die Substratstabilität beeinflussen, sind die Wassermenge in der Probe und die Feuchtigkeit. Weitere Fragen werden in den repräsentativen Ergebnissenausführlich erörtert. Dieses Protokoll bietet viele Details und wechselt schrittweise von einem Schritt zum anderen. Das Protokoll bietet lange Stabilität für Bildgebungsexperimente und bietet ein grundlegendes Bildverarbeitungswerkzeug.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:748px;" width="747">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">35mm glass dish</td>
			<td style="width:216px;">mattek</td>
			<td style="width:137px;">P35G-0.170-14-C</td>
			<td style="width:172px;">thickness corresponding with microscope lense.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Agarose&#160;</td>
			<td style="width:216px;">Lonza</td>
			<td style="width:137px;">5004</td>
			<td>LB preperation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">AHL&#160;</td>
			<td style="width:216px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">K3007</td>
			<td>inducer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Bacto tryptone&#160;</td>
			<td style="width:216px;">BD - Becton, Dickinson and Company&#160;</td>
			<td style="width:137px;">211705</td>
			<td>LB preperation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Carb</td>
			<td style="width:216px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:137px;">10177-012</td>
			<td>antibiotic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Carb</td>
			<td style="width:216px;">Formedium</td>
			<td style="width:137px;">CAR0025</td>
			<td>antibiotic</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Casamino acids&#160;</td>
			<td style="width:216px;">BD - Becton, Dickinson and Company&#160;</td>
			<td style="width:137px;">223050</td>
			<td>minimal media solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">eclipse Ti</td>
			<td style="width:216px;">nikon</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td>inverted microscope</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Glucose</td>
			<td style="width:216px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">G5767</td>
			<td>minimal media solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Glyserol</td>
			<td style="width:216px;">Bio-Lab</td>
			<td style="width:137px;">000712050100</td>
			<td>minimal media substrate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Immersol 518F</td>
			<td style="width:216px;">zeiss</td>
			<td style="width:137px;">4449600000000</td>
			<td>immersion oil</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">M9 salt solution&#160;</td>
			<td style="width:216px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">M6030</td>
			<td>minimal media solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">NaCl</td>
			<td style="width:216px;">Bio-Lab</td>
			<td style="width:137px;">214010</td>
			<td>LB preperation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Noble agar</td>
			<td style="width:216px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">A5431</td>
			<td>minimal media substrate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">parafilm tape</td>
			<td style="width:216px;">Bemis</td>
			<td style="width:137px;">PM-996</td>
			<td>refered to as tape in text</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Seaplaque GTG Agarose</td>
			<td style="width:216px;">Lonza</td>
			<td style="width:137px;">50111</td>
			<td>minimal media substrate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">thaymine B1</td>
			<td style="width:216px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">T0376&#160;</td>
			<td>minimal media solution</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Yeast Extract</td>
			<td style="width:216px;">BD - Becton, Dickinson and Company&#160;</td>
			<td style="width:137px;">212750</td>
			<td>LB preperation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

continuous measurement of biological noise in escherichia coli using time-lapse microscopy

Das hier entwickelte Protokoll bietet ein Tool, um die Computerverfolgung der Escherichia coli-Division und der Fluoreszenzüberschüsse über mehrere Stunden hinweg zu ermöglichen. Der Prozess beginnt mit einem Screening auf Kolonien, die auf minimalen Medien überleben, vorausgesetzt, dass nur Escherichia coli, die das richtige Plasmid beherbergt, in der Lage sein wird, unter den spezifischen Bedingungen zu gedeihen. Da der Prozess des Aufbaus großer genetischer Schaltkreise, der die Montage vieler DNA-Teile erfordert, eine Herausforderung darstellt, werden Schaltkreiskomponenten oft zwischen mehreren Plasmiden in verschiedenen Kopiernummern verteilt, die den Einsatz mehrerer Antibiotika erfordern. Mutationen im Plasmid können die Transkription der Antibiotikaresistenzgene zerstören und mit Ressourcenmanagement in der Zelle intervenieren, was zu Nekrose führt. Die ausgewählte Kolonie wird auf einer Glasboden-Petrischale gesetzt und einige Fokusebenen werden für die Mikroskopie-Tracking in hellen Feld- und Fluoreszenzdomänen ausgewählt. Das Protokoll behält den Bildfokus für mehr als 12 Stunden unter anfänglichen Bedingungen, die nicht reguliert werden können, was einige Schwierigkeiten verursacht. Zum Beispiel beginnen sich abgestorbene Zellen im Fokusfeld der Linsen nach ein paar Stunden der Bildgebung anzusammeln, was dazu führt, dass sich Giftstoffe ansammeln und das Signal verschwimmt und zerfällt. Der Erschöpfungswert von Nährstoffen führt zu neuen Stoffwechselprozessen und behindert die gewünschte Reaktion des Kreislaufs. Die Temperatur des Experiments senkt die Wirksamkeit von Induktoren und Antibiotika, was die Zuverlässigkeit des Signals weiter beeinträchtigen kann. Das minimale Mediengel schrumpft und trocknet, und dadurch ändert sich der optische Fokus im Laufe der Zeit. Wir haben diese Methode entwickelt, um diese Herausforderungen in Escherichia colizu überwinden, ähnlich wie frühere Arbeiten, die analoge Methoden für andere Mikroorganismen entwickeln. Darüber hinaus bietet diese Methode einen Algorithmus zur Quantifizierung des gesamten stochastischen Rauschens in unveränderten und veränderten Zellen und stellt fest, dass die Ergebnisse mit den Strömungsanalysevorhersagen übereinstimmen, wie ein ähnlicher Variationskoeffizient (CV) zeigt.

Die Software analysiert helle Feld-Domänenbilder, die nicht weiß und schwarz sind. Die Escherichia coli wird wie schwarze längliche Formen auf einem weißen Hintergrund aussehen und dynamischer Bereich der Luminanz sollte eine Spitze in ihrer Mitte zeigen (Abbildung 1). In fluoreszierenden Bildern können Zellen einen kleinen Halo haben, aber einzelne Zellen mit längigen Formen können immer noch aufgelöst werden. Ein Mitose-Ereignis sollte zuerst nach 30 Minuten erkannt werden...

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Continuous Measurement of Biological Noise in Escherichia Coli Using Time-lapse Microscopy

Diese Arbeit stellt eine Mikroskopiemethode vor, die eine Live-Bildgebung einer einzelnen Zelle von Escherichia coli zur Analyse und Quantifizierung des stochastischen Verhaltens synthetischer Genkreise ermöglicht.

Kontinuierliche Messung des biologischen Rauschens in Escherichia Coli mittels Zeitraffermikroskopie

The protocol developed here offers a tool to enable computer tracking of Escherichia coli division and fluorescent levels over several hours. The process ...

Dieses Protokoll in Kräutern kontinuierliche Messung von genetischen Schaltkreisen in E.coli und die Berechnung der Signalvariabilität und Signal-Rausch-Verhältnis in einzelnen Bakterienzellen zur Beurteilung der Schaltungsleistung. Die Hauptvorteile dieser Technik sind, dass sie leicht an verschiedene Stämme und Labore angepasst werden kann, minimale sorgsam und ohne spezielle Ausrüstung erfordert und relativ kostengünstig ist. Lärm spielt eine wichtige Rolle bei der Bestimmung der Funktionalität biologischer Systeme.Derzeit besteht ein Interesse am Bau von groß angelegten Genkreisläufen. Diese Systeme können durch Lärm gehemmt werden Achten Sie darauf, die Proben gut zu trocknen, diese Chillpads so lange wie möglich bei vier Grad Celsius zu halten und die Teile geduldig und schonend zu schneiden und zu teilen. Um die Bakterien für die Analyse vorzubereiten, impfen Sie eine einzelne Kolonie aus einer transfizierten E.coli-Kultur.Zum Beispiel eine Schaltung mit einem GFP-Reporter. In einem Glasrohr mit fünf Millilitern LB-Brühe wird es mit den entsprechenden Antibiotika ergänzt. Wachsen Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius und 250 Umdrehungen pro Minute in einem zitternden Inkubator für zwei Stunden, bis die Brühe trüb ist.Am Ende der Inkubation einen Milliliter Verdünnungslösung in einer Zwei-Milliliter-Mini-Mikrozentrifuge abdrehen und 30 Mikroliter Bakterien und das gesamte Volumen der Verdünnungslösung in eine neue Zwei-Milliliter-Röhre übertragen. Dann bebrüten Sie die Kultur für eine Stunde mit Schütteln, bevor Sie 40 bis 60 Mikroliter dieser Suspension auf M9-Kulturplatten säen. Um die Bakterien für die Analyse vorzubereiten, impfen Sie eine einzelne Kolonie aus einer transfizierten E.Coli-Kultur.Zum Beispiel eine Schaltung mit einem GFP-Reporter in einem Glasrohr mit fünf Millilitern LB-Brühe, ergänzt durch die entsprechenden Antibiotika. Wachsen Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius und 250 Umdrehungen pro Minute in einem zitternden Inkubator für zwei Stunden, bis die Brühe trüb ist. Am Ende der Inkubation einen Milliliter Verdünnungslösung in einem Zwei-Milliliter-Mini-Mikrozentrifugenrohr versenken und 30 Mikroliter Bakterien und das gesamte Volumen der Verdünnungslösung in ein neues Zwei-Milliliter-Rohr übertragen.Dann bebrüten Die Kultur für eine Stunde mit Schütteln. Um Mikroskopplatten herzustellen, mischen Sie 112,5 Milligramm niedrigschmelzenden Agar mit 40 Milligramm Agar und einen Milliliter 2%Casaminosäure in einem 25 Milliliter Erlenmeyer Kolben. Als nächstes fügen Sie 8,92 Milliliter minimales Medium über die inneren Lippen eines 25 Milliliter Erlenmeyer Kolbens und Mikrowelle die resultierende Lösung in kurzen, zwei bis drei Sekunden Bursts.Dann stellen Sie das Wasserbad auf 55 Grad Celsius. Wenn die Lösung klar ist, legen Sie den 25 Milliliter Erlenmeyer-Kolben in ein 60 Grad Celsius-Wasserbad und lassen Sie die Agar-Lösung abkühlen, bis ihre Temperatur auf etwa 45 bis 50 Grad Celsius fällt. Während der Agarkühlung, reinigen Sie die Laborbank mit 70% Ethanol und glätten Sie ein Stück Laborband auf die gereinigte Bank.Legen Sie einen Glasdeckel auf das Band und legen Sie einen zweiten Deckelschlupf in der Nähe. Die gekühlte Agarlösung zu den entsprechenden Antibiotika und der entsprechenden Lösung hinzufügen. Gießen Sie 1,5 Milliliter frisch zubereitete Gellösung auf den über das Band platzierten Deckelschlupf und legen Sie den zweiten Deckelschlupf auf das Gel, wobei Sie darauf achten, Blasen zu vermeiden.Bringen Sie den Erlenmeyer ins Warmwasserbad zurück und decken Sie die Deckelschlupffürst2 minutenlang ab. Drehen Sie die Abdeckung Slips für eine Stunde Inkubation bei vier Grad Celsius. Am Ende der Inkubation die Deckelschlupf vom trockenen Gel entfernen und ein kleines Pad aus der Agarose schneiden.Während der Inkubation sechs Mikrolitertröpfchen der vorbereiteten bakteriellen Suspension in eine 35-Millimeter-Schale geben und die Tropfen mindestens 15 bis 30 Minuten trocknen lassen. Dann legen Sie das Pad vorsichtig auf ein Tröpfchen von Bakterien und lassen Sie die Proben für 20 Minuten bei Raumtemperatur einstellen. Um das Agarbett ohne Verschmieren der Probe zu platzieren, positionieren Sie das kühle Pad vorsichtig mit sanftem Klopfen auf das Tröpfchen.Um die Proben abzubilden, entfernen Sie den Kolben aus dem Wasser und lassen Sie die Gellösung auf Körpertemperatur abkühlen. Gießen Sie drei Millimeter des Gels auf den Umfang der Probenplatte. Wenn die Agarose verfestigt ist, versiegeln Sie die Platte mit Klebeband und verwenden Sie eine 25-Spur-Nadel, um mehrere Löcher in das Band zu stecken.Dann stellen Sie die Platte auf vier Grad Celsius für mindestens 30 Minuten, damit die Agarose vollständig erstarrt, während Zellmitose zu verhindern. Verwenden Sie innerhalb von 24 Stunden ein fluoreszenzkonfokales Mikroskop, um die Probe bei der niedrigsten Vergrößerung zu lokalisieren und das automatische Fokussystem des Mikroskops einzubinden. Tragen Sie Öl auf das entsprechende Ziel auf und verwenden Sie die Plattformsteuerung, um die Platte zu bewegen, um das Öl vorsichtig zu verteilen.Setzen Sie dann den automatischen Fokus erneut ein und folgen Sie dem Standardvorschlag für Z-Schrittquerschnitte, um das Beispiel abzubilden. Der E.coli sollte als schwarze länschliche Formen auf einem weißen Hintergrund erscheinen. Und der Dynamikbereich der Leuchtdichte sollte eine Spitze in der Mitte zeigen.Mitoseereignisse können zunächst durch Fluoreszenzmikroskopie nach 30 Minuten nachgewiesen werden. Obwohl einzelne Zellen bei geringer Vergrößerung schwer zu erkennen sind. Bakterielle Zellkulturen, die mit einem falschen Verdünnungsverhältnis hergestellt werden, können eine unveränderliche Anzahl von Zellen aufweisen, und Proben, die ohne Plattenversiegelung hergestellt werden, können eine übermäßige Schrumpfung aufweisen, was zu einem Verlust des Fokus führt.Zellen können das Gel auch bei der Suche nach Nährstoffen einrücken, was zu einer Stapelung der Bakterienzellen übereinander führt und die Zellmonoschicht kompromittiert, wodurch die Zelldetektion effektiv verhindert und zuverlässige fluoreszierende Signalmessungen durchgeführt werden. Wie aus diesen Daten vorgeschlagen, wirkt sich die Zellstufe im Teilungszyklus nicht auf den Geräuschpegel aus, da verschiedene Flächenbereiche den gleichen Trend aufweisen. Darüber hinaus wird keine wesentliche Änderung des Signal-Rausch-Verhältnisses zwischen GFP und Superfold GFP beobachtet, wie diese repräsentativen Daten zeigen.Achten Sie bei der Durchführung dieses Verfahrens darauf, das richtige Verdünnungsverhältnis für den für das Experiment verwendeten Bakterienstamm zu bestimmen. Der Vergleich des Signal-Rausch-Verhältnisses jeder geregelten Schaltung mit dieser Basislinie ermöglicht die Auswahl der besten Leistungsschaltung und kann interessante Phänomene aufdecken

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Continuous Measurement of Biological Noise in Escherichia Coli Using Time-lapse Microscopy

Engineering Biological-Based Vascular Grafts Using a Pulsatile Bioreactor

Engineering Biological-Based Gefäßprothesen Mit einem Pulsatile Bioreaktor

Much effort has been devoted to develop and advance the methodology to regenerate functional small-diameter arterial bypasses. In the physiological ...

Forschung

Biotechnik

Three-dimensional Optical-resolution Photoacoustic Microscopy

Dreidimensionale Optische Auflösung photoakustische Mikroskopie

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As ...

Fluorescent Nanoparticles for the Measurement of Ion Concentration in Biological Systems

Fluoreszierende Nanopartikel für die Messung von Ionen-Konzentration in biologischen Systemen

Tightly regulated ion homeostasis throughout the body is necessary for the prevention of such debilitating states as dehydration.1 In contrast, rapid ion ...

Time-lapse Fluorescence Imaging of Arabidopsis Root Growth with Rapid Manipulation of The Root Environment Using The RootChip

Zeitraffer-Fluoreszenz-Imaging von Arabidopsis Wurzelwachstum mit Rapid Manipulation der Root-Umgebung mit dem RootChip

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In situ TEM of Biological Assemblies in Liquid

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Beispiel Drift Korrektur Nach 4D Konfokale Zeitraffer-Imaging

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Surface potential is a commonly overlooked physical characteristic that plays a dominant role in the adhesion of microorganisms to substrate surfaces. ...

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