Name: continuous measurement of biological noise in escherichia coli using time-lapse microscopy
Uploaded: 2021-04-27T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Continuous Measurement of Biological Noise in Escherichia Coli Using Time-lapse Microscopy at JoVE.com

אנו מודים למר גיל גלברט (הפקולטה להנדסת חשמל בטכניון) על הסיוע בקוד MATLAB. אנו מודים לד"ר שימינג לי (הפקולטה להנדסה ביו-רפואית בטכניון) על שסייע בהגהה של מאמר זה. מחקר זה נתמך בחלקו על ידי קרן משפחת נויבאואר ומשרד המדע הישראלי, מענק 2027345.

1. הכנת מדיה ותרבות
<ol><li>הכן פתרון מלאי של 1,000x קרבניצילין (50 מ"ג / מ"ל) או אנטיביוטיקה רלוונטית.<ol>
<li>. שוקל 0.5 גרם של קרבניצילין. הוסף 10 מ"ל של סטרילי H2O. להתמוסס לחלוטין.</li>
		<li>לעקר מניית קרבניצילין באמצעות מסנן מזרק 0.22 מיקרומטר. Aliquot פתרון אנטיביוטי ולאחסן ב -20 מעלות צלזיוס.</li>
	</o...

<ol>
	<li>Daniel, R., Rubens, J. R., Sarpeshkar, R., Lu, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+analog+computation+in+living+cells.">Synthetic analog computation in living cells.</a> Nature. 497, 619-623 (2013).</li><li>Yang, X. S. Y., L, A. B., Harwood, C., Jensen, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Imaging Bacterial Molecules, Structures and Cells. , (2016).</li><li>Joyce, G., Robertson, B. D., Williams, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modified+agar+pad+method+for+mycobacterial+live-cell+imaging.">A modified agar pad method for mycobacterial live-cell imaging.</a> Biomedcentral Research Notes. , (2011).</li><li>Cotlet, M., Goodwin, P. M., Waldo, G. S., Werner, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+the+fluorescence+dynamics+of+single+molecules+of+a+green+fluorescent+protein:+One-+versus+two-photon+excitation.">A comparison of the fluorescence dynamics of single molecules of a green fluorescent protein: One- versus two-photon excitation.</a> ChemPhysChem. , (2006).</li><li>Andersen, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+unstable+variants+of+green+fluorescent+protein+for+studies+of+transient+gene+expression+in+bacteria.">New unstable variants of green fluorescent protein for studies of transient gene expression in bacteria.</a> Applied and Environmental Microbiology. 64, 2240-2246 (1998).</li><li>Barger, N., Litovco, P., Li, X., Habib, M., Daniel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+metabolic+computation+in+a+bioluminescence-sensing+system.">Synthetic metabolic computation in a bioluminescence-sensing system.</a> Nucleic Acids Research. , (2019).</li><li>Young, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+single-cell+gene+expression+dynamics+in+bacteria+using+fluorescence+time-lapse+microscopy.">Measuring single-cell gene expression dynamics in bacteria using fluorescence time-lapse microscopy.</a> Nature Protocols. , (2012).</li><li>Swain, P. S., Elowitz, M. B., Siggia, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+and+extrinsic+contributions+to+stochasticity+in+gene+expression.">Intrinsic and extrinsic contributions to stochasticity in gene expression.</a> Proceedings of the National Academy of Science United States. , (2002).</li><li>Elowitz, M. B., Levine, A. J., Siggia, E. D., Swain, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stochastic+gene+expression+in+a+single+cell.">Stochastic gene expression in a single cell.</a> Science. , (2002).</li><li>Baumgart, L., Mather, W., Hasty, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synchronized+DNA+cycling+across+a+bacterial+population.">Synchronized DNA cycling across a bacterial population.</a> Nature Genetics. , (2017).</li><li>Arriaga, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+biological+noise+via+single+cell+analysis.">Determining biological noise via single cell analysis.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. , (2009).</li><li>Nielsen, A. A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+circuit+design+automation.">Genetic circuit design automation.</a> Science. , (2016).</li><li>Ozbudak, E. M., Thattai, M., Kurtser, I., Grossman, A. D., van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+noise+in+the+expression+of+a+single+gene.">Regulation of noise in the expression of a single gene.</a> Nature Genetics. 31, 69-73 (2002).</li><li>Pedraza, J. H., Van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noise+propagations+in+gene+networks.">Noise propagations in gene networks.</a> Science. , (2005).</li><li>Jennifer, A. N. B., Christopher, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+genetic+circuit+design.">Principles of genetic circuit design.</a> Nature Methods. , (2014).</li><li>Aoki, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+universal+biomolecular+integral+feedback+controller+for+robust+perfect+adaptation.">A universal biomolecular integral feedback controller for robust perfect adaptation.</a> Nature. , (2019).</li><li>Hanna, H. A., Danial, L., Kvatinsky, S., Daniel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cytomorphic Electronics with Memristors for Modeling Fundamental Genetic Circuits. 4545, (2020).</li><li>de Jong, I. G., Beilharz, K., Kuipers, O. P., Veening, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+cell+imaging+of+Bacillus+subtilis+and+Streptococcus+pneumoniae+using+automated+time-lapse+microscopy.">Live cell imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using automated time-lapse microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2011).</li><li>Eling, N., Morgan, M. D., Marioni, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+in+measuring+and+understanding+biological+noise.">Challenges in measuring and understanding biological noise.</a> Nature Reviews Genetics. , (2019).</li><li>Thattai, M., Van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Attenuation+of+noise+in+ultrasensitive+signaling+cascades.">Attenuation of noise in ultrasensitive signaling cascades.</a> Biophysical Journal. , (2002).</li><li>Thattai, M., Van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+noise+in+gene+regulatory+networks.">Intrinsic noise in gene regulatory networks.</a> Proceedings of the National Academy of Science United States. , (2001).</li><li>Rosenfeld, N., Young, J. W., Alon, U., Swain, P. S., Elowitz, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+regulation+at+the+single-cell+level.">Gene regulation at the single-cell level.</a> Science. , (2005).</li><li>Van Der Ziel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Noise in Measurements. , (1976).</li><li>Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+cloning:+A+laboratory+manual.+2nd+Edition.">Molecular cloning: A laboratory manual. 2nd Edition.</a> Cold Spring Harbor Laboratory Press. , (1989).</li><li>Carpenter, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CellProfiler:+Image+analysis+software+for+identifying+and+quantifying+cell+phenotypes.">CellProfiler: Image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes.</a> Genome Biology. , (2006).</li><li>Paintdakhi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oufti:+An+integrated+software+package+for+high-accuracy,+high-throughput+quantitative+microscopy+analysis.">Oufti: An integrated software package for high-accuracy, high-throughput quantitative microscopy analysis.</a> Molecular Microbiology. , (2016).</li><li>Ducret, A., Quardokus, E. M., Brun, Y. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicrobeJ,+a+tool+for+high+throughput+bacterial+cell+detection+and+quantitative+analysis.">MicrobeJ, a tool for high throughput bacterial cell detection and quantitative analysis.</a> Nature Microbiology. , (2016).</li><li>Stylianidou, S., Brennan, C., Molecular, S. B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> SuperSegger: robust image segmentation, analysis and lineage tracking of bacterial cells - Stylianidou - 2016 - Molecular Microbiology. , (2016).</li><li>Balomenos, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image+analysis+driven+single-cell+analytics+for+systems+microbiology.">Image analysis driven single-cell analytics for systems microbiology.</a> Biomedcentral System Biology. , (2017).</li><li>Smit, J. H., Li, Y., Warszawik, E. M., Herrmann, A., Cordes, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colicoords:+A+Python+package+for+the+analysis+of+bacterial+fluorescence+microscopy+data.">Colicoords: A Python package for the analysis of bacterial fluorescence microscopy data.</a> PLoS One. , (2019).</li><li>Guido, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bottom-up+approach+to+gene+regulation.">A bottom-up approach to gene regulation.</a> Nature. , (2006).</li><li>Beal, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signal-to-noise+ratio+measures+efficacy+of+biological+computing+devices+and+circuits.">Signal-to-noise ratio measures efficacy of biological computing devices and circuits.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. , (2015).</li><li>Marr, D., Hildreth, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Theory+of+edge+detection.">Theory of edge detection.</a> Proceedings of the Royal Society - Biology Science. 207, 187-217 (1980).</li><li>Otsu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Threshold+selection+method+from+gray-level+histograms.">Threshold selection method from gray-level histograms.</a> IEEE Transactions Systems Man Cybernetics. , (1979).</li><li>Soille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Morphological Image Analysis: Principles and Applications, Second edition. , (2000).</li><li>Bradley, D., Roth, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptive+Thresholding+using+the+Integral+Image.">Adaptive Thresholding using the Integral Image.</a> Journal of Graphics Tools. , (2007).</li><li>Meyer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topographic+distance+and+watershed+lines.">Topographic distance and watershed lines.</a> Signal Processing. , (1994).</li><li>Maurer, C. R., Qi, R., Raghavan, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+linear+time+algorithm+for+computing+exact+Euclidean+distance+transforms+of+binary+images+in+arbitrary+dimensions.">A linear time algorithm for computing exact Euclidean distance transforms of binary images in arbitrary dimensions.</a> IEEE Transactions on Pattern Analysis and Machine. , (2003).</li><li>Millo, R., Phillips, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+is+the+maturation+time+for+fluorescent+proteins.">What is the maturation time for fluorescent proteins.</a> Cell Biology by Numbers. , (2015).</li></ol>

בעבודה זו פיתחנו פרוטוקול המאפשר מעקב ממוחשב אחר תאים חיים של Escherichia coli, בעקבות חלוקה ורמות פלואורסצנטיות על פני תקופה של שעות. פרוטוקול זה מאפשר לנו לכמת את הדינמיקה הסטוצ'סטית של מעגלים גנטיים ב Escherichia coli על ידי מדידת CV ו SNR בזמן אמת. בפרוטוקול זה השווינו את ההתנהגויות הסטוצ'סטיו?...

ביולוגיה סינתטית היא תחום רב תחומי שהתגלה בעשור האחרון ומטרתו לתרגם עקרונות תכנון הנדסי לתכנון ביולוגי רציונלי1,2,3 , במאמץ להשיגאינטגרציהועיבוד רב-תחומי בתאים חיים להבנת המדע הבסיסי4,5, יישומים אבחון, טיפולי וביוטכנולוגי6,7,8,9,10. היכולת שלנו לכמת את תגובת פלט הקלט של מעגלי גנים סינתטיים עברה מהפכה על ידי ההתקדמות האחרונה בטכנולוגיה חד-תאית, כולל מנתח הזרימה והדמיה של תאים חיים באמצעות מיקרוסקופיה אוטומטית של זמן לשגות11. מנתח זרימה משמש לעתיםקרובותכדי למדוד את התגובה של מעגלים אלה במצב יציב 1,12, מיקרוסקופיה הפוכה משמשת למדידת התגובה הדינמית של מעגלי גנים סינתטיים ברמה של תא יחיד3. לדוגמה, אחת העבודות המוקדמות בביולוגיה סינתטית כללה בניית רשתות מתנד גנטיות בתאים חיים באמצעות לולאות משוב שליליות עם עיכוב3. מאוחר יותר, מעגלי המתנד הגנטי הוחלו כדי להבין שליטה מטבולית בסביבה הדינמית של תאיםחיים 4. מיקרוסקופיה אוטומטית של זמן לשגות היא שיטה אחת לאפיין מעגלים כאלה. אנו משערים כי התאים המארחים, Escherichia coli, לסנכרן בעת יצירת מושבות מיקרו, המאפשר מדידה של אות וחישוב של רעש מבלי לעקוב אחר יחסי אם ובת מדויקים.
רעש הוא היבט בסיסי, אינהרנטי של מערכות ביולוגיות הנובעות לעתים קרובות ממקורות מרובים. קחו לדוגמה, תגובות ביוכימיות המערבות אותות שמקורם בהובלת נשאים אקראיים נפרדים כגון דיפוזיה של חלבונים13. אותות אלה מתפשטים עם תנודות אקראיות14. מקורות רעש אחרים הם זמינות משאבים, חלוקת תאים ושינויים בתנאים סביבתיים כגון טמפרטורה, לחות ולחץ. אותות ביולוגיים המתפשטים במעגלי גנים סינתטיים לעיתים קרובות יש אות נמוך מאוד יחס רעש (SNR), אשר מפריע לביצועים של מעגלים כאלה. לכן, תכנון מעגל גנטי נשאר אחד ההיבטים המאתגרים ביותר שלהנדסה גנטית 15. לדוגמה, בניגוד לרוב הגישות המחשבות רק את ביטוי הגנים הממוצע (הנמדד על פני אוכלוסיית התאים כולה), השונות של האות הנמדד נחשבת על מנת להנדס התנהגות צפויה באמצעות רשתות גנים סינתטיות12. ככזה, רמות השונות או הרעש בביטוי החלבון ממלאות תפקיד דומיננטי בעיצוב וביצועים של מעגלי גנים אנלוגיים ודיגיטליים1,16,17.
גישות רבות פותחו כדי לכמת את השונות בין תא לתא, כולל ב Escherichia coli3,7,18. שיטות אלה משמשות לעתים קרובות לחקר הפעלת גנים ומסלולים מטבוליים, אולם עם פחות התמקדות בחקר דינמיקת רעש סטוכסטי, כמו מדידה והתנתקות של מקורות רעש ספציפיים, במיוחד עבור מעגלים גנטיים בתאים חיים שבהם זהו אתגר בסיסי19,20,21. מספר גורמים, שניהם תורשתיים למעגל עצמו (מהותי) ונגזרים מהתאים המארחים (חיצוניים), יכולים להפריע לביצועים המתמשכים של מעגלים גנטיים. במאמר זה, פיתחנו פרוטוקול שמטרתו לכמת את הרעש הכולל בתאי קולי Escherichia, כולל מקורות רעש מהותיים ו extrinsic6,22. על ידי כימות הרעש הכולל ולאחר מכן הערכת SNR23, העיצוב של מעגלי גנים ניתן לשפר. שיטה זו ניתנת לשינוי כדי למדוד מקורות רעש עצמאיים בנפרד, על ידי ניטור מספר חלבונים פלואורסצנטיים6,20. עבור הפרוטוקול המתואר כאן, אנו שומרים על התנאים הסביבתיים מבוקרים היטב ומודדים ללא הרף את פעילות התאים ללא השפעה של גורמים חיצוניים. אנו מודדים את האות מחלבונים פלואורסצנטיים בתאים בודדים לאורך זמן ובו זמנית מדימויים אותם תחת מצע אגרוז. התמונות המתקבלות מנותחות באמצעות MATLAB המותאם אישית של המעבדה.
באופן אידיאלי, מדידה רציפה של הפעילות בזמן אמת של חלבונים פלואורסצנטיים בתוך התא תייצר נתונים מדויקים באמצעות הצמיחה והחלוקה של התאים. עם זאת, זה מאתגר לרכוש נתונים כאלה. זאת בשל השפלה של חלבונים פלואורסצנטיים, המכונה הלבנת תמונות7, כאשר הם נחשפים לקרינה בתהליך העירור. יתר על כן, תאי קולי Escherichia רגישים גם עבור עירור, אשר עלול להוביל phototoxicity7. שתי הבעיות מגבילות את כמות מסגרות התמונות שניתן להשיג ואת הזמן בין רכישות. מצע וסוגים בינוניים (למשל, מרק lysogeny) המשמש לגידול התאים במהלך ההדמיה יש גם תפקיד קריטי. מומלץ מאוד להשתמש במדיום מינימלי, הממזער רקע שאינו פלואורסצנטי ומאריך את זמן חלוקת התאים.
יתר על כן, המדגם צריך להיות מוכן בהתחשב בדרישות הבאות (1) שיעור חלוקת תאים נמוך מאפשר חשיפות תכופות פחות עבור הדמיה צמודה מחזור החלוקה והפחתת ההסתברות של phototoxicity ו photobleaching. הגדרנו את זמן הרכישה לכמחצית מזמן המיטוזיס החזוי (2) צפיפות תאים נמוכה בתחילת הניסוי מאפשרת אחידות ויכולת מעקב טובות יותר של החלוקה. צפיפות התאים מושפעת מיחס הדילול של תאי קולי Escherichia, המהווה פרמטר משמעותי להצלחת פרוטוקול זה ויש לקבוע אותו עבור כל מעבדה. על מנת לקבוע את היחס, כל זן קולי חדש של Escherichia או מדיה בשימוש צריך להיות מצויד גרפים קצב הצמיחה (איור משלים 1). יחס מתאים הושג אם תאים יכולים לגדול ללא רעידות נוספות לאחר דגירה קצרה מתוך צפיפות ראשונית של כ OD600nm = 0.1. תאים בשלב זה יתחלקו בהתאם לטמפרטורת הסביבה בלבד (3) הגבלת תנועת התאים: תנועת התאים תלויה מאוד בתקיפות המצע (כרית agarose). מוצקות המצע תלויה בכמות ההתעוררות הכוללת ובזמן התמצקות הג'ל. ג'לים לא ניתן להשאיר כדי לחזק את הלילה בטמפרטורת החדר, כמו קולי Escherichia יעבור מיטוזה. גורמים אחרים המשפיעים על יציבות המצע כוללים את כמות המים במדגם והלחות. נושאים נוספים נידונים בפירוט בתוצאות הנציגות. פרוטוקול זה מספק פרטים רבים ועובר בהדרגה משלב אחד למשנהו. הפרוטוקול מציע יציבות ארוכה לניסויי הדמיה ומספק כלי בסיסי לעיבוד תמונה.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:748px;" width="747">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">35mm glass dish</td>
			<td style="width:216px;">mattek</td>
			<td style="width:137px;">P35G-0.170-14-C</td>
			<td style="width:172px;">thickness corresponding with microscope lense.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Agarose&#160;</td>
			<td style="width:216px;">Lonza</td>
			<td style="width:137px;">5004</td>
			<td>LB preperation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">AHL&#160;</td>
			<td style="width:216px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">K3007</td>
			<td>inducer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Bacto tryptone&#160;</td>
			<td style="width:216px;">BD - Becton, Dickinson and Company&#160;</td>
			<td style="width:137px;">211705</td>
			<td>LB preperation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Carb</td>
			<td style="width:216px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:137px;">10177-012</td>
			<td>antibiotic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Carb</td>
			<td style="width:216px;">Formedium</td>
			<td style="width:137px;">CAR0025</td>
			<td>antibiotic</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Casamino acids&#160;</td>
			<td style="width:216px;">BD - Becton, Dickinson and Company&#160;</td>
			<td style="width:137px;">223050</td>
			<td>minimal media solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">eclipse Ti</td>
			<td style="width:216px;">nikon</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td>inverted microscope</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Glucose</td>
			<td style="width:216px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">G5767</td>
			<td>minimal media solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Glyserol</td>
			<td style="width:216px;">Bio-Lab</td>
			<td style="width:137px;">000712050100</td>
			<td>minimal media substrate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Immersol 518F</td>
			<td style="width:216px;">zeiss</td>
			<td style="width:137px;">4449600000000</td>
			<td>immersion oil</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">M9 salt solution&#160;</td>
			<td style="width:216px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">M6030</td>
			<td>minimal media solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">NaCl</td>
			<td style="width:216px;">Bio-Lab</td>
			<td style="width:137px;">214010</td>
			<td>LB preperation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Noble agar</td>
			<td style="width:216px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">A5431</td>
			<td>minimal media substrate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">parafilm tape</td>
			<td style="width:216px;">Bemis</td>
			<td style="width:137px;">PM-996</td>
			<td>refered to as tape in text</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Seaplaque GTG Agarose</td>
			<td style="width:216px;">Lonza</td>
			<td style="width:137px;">50111</td>
			<td>minimal media substrate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">thaymine B1</td>
			<td style="width:216px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">T0376&#160;</td>
			<td>minimal media solution</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Yeast Extract</td>
			<td style="width:216px;">BD - Becton, Dickinson and Company&#160;</td>
			<td style="width:137px;">212750</td>
			<td>LB preperation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

continuous measurement of biological noise in escherichia coli using time-lapse microscopy

הפרוטוקול שפותח כאן מציע כלי המאפשר מעקב ממוחשב אחר חטיבת קולי Escherichia ורמות פלואורסצנט על פני מספר שעות. התהליך מתחיל בסינון מושבות ששורדות על מדיה מינימלית, בהנחה שרק Escherichia coli מחסה פלסמיד הנכון יוכל לשגשג בתנאים הספציפיים. מכיוון שתהליך בניית מעגלים גנטיים גדולים, הדורש הרכבה של חלקי דנ"א רבים, הוא מאתגר, רכיבי מעגלים מופצים לעתים קרובות בין פלסמידים מרובים במספרי העתק שונים הדורשים שימוש במספר אנטיביוטיקה. מוטציות בפלסמיד יכולות להרוס את שעתוק הגנים של עמידות לאנטיביוטיקה ולהצטלב עם ניהול משאבים בתא המוביל לנמק. המושבה שנבחרה ממוקמת על צלחת פטרי עם תחתית זכוכית וכמה מישורי מיקוד נבחרים למעקב אחר מיקרוסקופיה הן בתחומים בהירים והן בתחומים פלואורסצנטיים. הפרוטוקול שומר על מוקד התמונה במשך יותר מ -12 שעות בתנאים ראשוניים שלא ניתן לווסת, ויוצר כמה קשיים. לדוגמה, תאים מתים מתחילים להצטבר בשדה המיקוד של העדשות לאחר כמה שעות של הדמיה, מה שגורם לרעלים להצטבר והאות לטשטש ולהתנוון. דלדול של חומרים מזינים מציג תהליכים מטבוליים חדשים לעכב את התגובה הרצויה של המעגל. טמפרטורת הניסוי מורידה את ההשפעה של גורם ואנטיביוטיקה, אשר יכול לפגוע עוד יותר את האמינות של האות. ג'ל המדיה המינימלי מתכווץ ומתייבש, וכתוצאה מכך המיקוד האופטי משתנה עם הזמן. פיתחנו שיטה זו כדי להתגבר על אתגרים אלה Escherichia coli, בדומה לעבודות קודמות פיתוח שיטות אנלוגיות עבור מיקרו אורגניזמים אחרים. בנוסף, שיטה זו מציעה אלגוריתם לכימות הרעש הסטוצ'סטי הכולל בתאים ללא שינוי ושינוי, ומוצאת כי התוצאות עולות בקנה אחד עם תחזיות מנתח זרימה כפי שמוצג על ידי מקדם דומה של וריאציה (CV).

התוכנה מנתחת תמונות תחום שדה בהיר כי הם מחוץ לבן ושחור. קולי Escherichia ייראה כמו צורות מלבניות שחורות על רקע לבן מחוץ למגוון דינמי של זוהר צריך להראות ספייק במרכזו (איור 1). בתמונות פלואורסצנטיות תאים עשויים להיות הילה קטנה, אך עדיין ניתן לפתור תאים בודדים עם צורות מלבניות....

Watch this Scientific Journal Video about Continuous Measurement of Biological Noise in Escherichia Coli Using Time-lapse Microscopy at JoVE.com

Continuous Measurement of Biological Noise in Escherichia Coli Using Time-lapse Microscopy

עבודה זו מציגה שיטת מיקרוסקופיה המאפשרת הדמיה חיה של תא יחיד של Escherichia coli לניתוח וכימות של ההתנהגות הסטוקסטית של מעגלי גנים סינתטיים.

מדידה רציפה של רעש ביולוגי ב Escherichia קולי באמצעות מיקרוסקופיה לשגות זמן

The protocol developed here offers a tool to enable computer tracking of Escherichia coli division and fluorescent levels over several hours. The process ...

פרוטוקול זה במדידה רציפה של מעגלים גנטיים ב- E.coli וחישוב שונות האות ויחס אות לרעש בתא חיידקי בודד כדי להעריך את ביצועי המעגל. היתרונות העיקריים של טכניקה זו הם שהיא ניתנת להתאמה בקלות לזנים ומעבדות שונות, דורשת הכשרה מינימלית וללא ציוד מיוחד, והיא זולה יחסית. רעש הוא תפקיד משמעותי בקביעת הפונקציונליות של מערכות ביולוגיות.נכון לעכשיו, יש עניין בבניית מעגלי גנים בקנה מידה גדול. מערכות אלה יכולות להיות מעוכבות על ידי רעש הקפד לייבש את הדגימות היטב, כדי לשמור על רפידות צמרמורת ב 4 מעלות צלזיוס במשך זמן רב ככל האפשר, לחתוך ולחלק את החלקים בסבלנות ובעדינות. כדי להכין את החיידקים לניתוח לחסן מושבה אחת מתרבות E.coli חוצה.לדוגמה, מעגל עם כתב GFP. בצינור זכוכית המכיל חמישה מיליליטר של מרק LB להשלים אותו עם אנטיביוטיקה רלוונטי. לגדל את התאים ב 37 מעלות צלזיוס ו 250 מהפכות לדקה באינקובטור רועד במשך שעתיים עד המרק מעונן.בסוף הדגירה, לסובב למטה מיליליטר אחד של פתרון דילול במיני צנטריפוגה מיני מיליליטר שני מיליליטר, ולהעביר 30 microliters של חיידקים ואת כל נפח פתרון דילול לתוך צינור חדש שני מיליליטר. לאחר מכן, דגירה את התרבות במשך שעה אחת עם רועד לפני זריעת 40 עד 60 microliters של השעיה זו על צלחות תרבות M9. כדי להכין את החיידקים לניתוח, לחסן מושבה אחת מתרבות E.Coli חוצה.לדוגמה, מעגל עם כתב GFP בצינור זכוכית המכיל חמישה מיליליטר של מרק LB בתוספת אנטיביוטיקה רלוונטית. לגדל את התאים ב 37 מעלות צלזיוס ו 250 מהפכות לדקה באינקובטור רועד במשך שעתיים עד המרק מעונן. בסוף הדגירה, לסובב למטה מיליליטר אחד של פתרון דילול בצינור מיני מיקרו צנטריפוגה שני מיליליטר ולהעביר 30 microliters של חיידקים ואת כל נפח פתרון דילול לתוך צינור חדש שני מיליליטר.ואז להדגיר את התרבות במשך שעה אחת עם רעידות. להכנת לוחות מיקרוסקופ, מערבבים 112.5 מיליגרם של אגר נמס נמוך עם 40 מיליגרם אגר, ומיליליטר אחד של 2% חומצת קאסאמינו בבקבוק ארלנמייר 25 מיליליטר. לאחר מכן, להוסיף 8.92 מיליליטר של מדיום מינימלי על השפתיים הפנימיות של בקבוק ארלנמאייר 25 מיליליטר ומיקרוגל הפתרון וכתוצאה מכך קצר, שניים עד שלושה התפרצויות שניות.ואז להגדיר את אמבט המים ל 55 מעלות צלזיוס. כאשר הפתרון ברור, מניחים את בקבוק ארלנמאייר 25 מיליליטר באמבט מים 60 מעלות צלזיוס ולאפשר את הפתרון אגר להתקרר עד הטמפרטורה שלה יורדת על 45 עד 50 מעלות צלזיוס. בזמן שהאגר מתקרר, נקו את ספסל המעבדה עם 70% אתנול והחליקו חתיכת סרט מעבדה על הספסל הנקי.מניחים כיסוי זכוכית אחד להחליק על הקלטת ומניחים תלוש כיסוי שני בקרבת מקום. הוסיפו תמיסת אגר מקוררת לאנטיביוטיקה ולתמיסה המתאימה. יוצקים 1.5 מיליליטר של פתרון ג'ל טרי מוכן על פתק הכיסוי ממוקם מעל הקלטת ומניחים את החלקת הכיסוי השנייה על הג'ל, מקפידים להימנע בועות.החזירו את ארלנמייר לאמבט המים החמים וכסו את תלושי הכיסוי במשך 20 דקות. הופכים את פתקי הכיסוי במשך שעה דגירה בארבע מעלות צלזיוס. בסוף הדגירה, להסיר את הכיסוי מחליק מן הג'ל היבש לחתוך כרית קטנה מן agarose.במהלך הדגירה, מוסיפים שש טיפות מיקרוליטר של ההשעיה החיידקית המוכנה לצלחת של 35 מילימטר ומאפשרים לטיפות להתייבש לפחות 15 עד 30 דקות. לאחר מכן בזהירות למקם את כרית בכל פעם על טיפה אחת של חיידקים ולאפשר את הדגימות להגדיר במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר. כדי למקם את מיטת אגר מבלי למרוח את המדגם, למקם בזהירות את כרית מגניב על הטרופה עם הקשה עדינה.כדי לדמיין את הדגימות, להסיר את הבקבוק מהמים ולאפשר את פתרון הג'ל להתקרר לטמפרטורת הגוף. יוצקים שלושה מילימטרים של הג'ל על ההיקף של צלחת המדגם. כאשר agarose יש התגבש, לאטום את הצלחת עם קלטת ולהשתמש מחט 25 מד לחתוך כמה חורים לתוך הקלטת.לאחר מכן מניחים את הצלחת במהופך ב 4 מעלות צלזיוס לפחות 30 דקות כדי לאפשר את agarose להתמצק באופן מלא, תוך מניעת מיטוזה התא. בתוך 24 שעות, השתמש במיקרוסקופ קונפוקל פלואורסצנטי כדי לאתר את הדגימה בהגדלה הנמוכה ביותר ולעסוק במערכת המיקוד האוטומטית של המיקרוסקופ. החל שמן על המטרה המתאימה ולהשתמש בקר הפלטפורמה כדי להזיז את הצלחת כדי להפיץ בזהירות את השמן.לאחר מכן הפעל שוב את המוקד האוטומטי ופעל לפי הצעת ברירת המחדל עבור חתכי רוחב של שלב Z כדי לדמות את הדוגמה. ה- E.coli אמור להופיע כצורות מלבניות שחורות על רקע לבן כבוי. והטווח הדינמי של הזוהר אמור להראות עלייה חדה במרכזו.אירועי מיטוזה יכולים להיות מזוהים תחילה על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי לאחר 30 דקות. למרות שתאים בודדים עשויים להיות קשים לזיהוי בהגדלה נמוכה. תרביות תאים חיידקיים שהוכנו ביחס דילול שגוי יכולות להדגים מספרים בלתי משתנים של תאים, ודגימות שהוכנו ללא איטום צלחת יכולות להפגין התכווצות מוגזמת, וכתוצאה מכך אובדן מיקוד.תאים יכולים גם לדחוק פנימה את הג'ל בחיפוש אחר חומרים מזינים, וכתוצאה מכך לערום את תאי החיידקים זה על גבי זה ולהתפשר על המונולאייר של התא, ובכך למנוע ביעילות זיהוי תאים ומדידת אותות פלואורסצנטית אמינה. כפי שהוצע על ידי נתונים אלה, שלב התא במחזור החלוקה אינו משפיע על רמת הרעש, שכן טווחי שטח שונים מדגימים את אותה מגמה. כמו כן, לא נצפה שינוי מהותי ביחס האות לרעש בין GFP לבין GFP סופר-גדול, כפי שמודגם על-ידי נתונים מייצגים אלה.בעת ביצוע הליך זה, יש להקפיד לקבוע את יחס הדילול הנכון עבור זן החיידקים המשמש לניסוי. השוואת יחס האות לרעש של כל מעגל מוסדר לקו בסיס זה מאפשרת בחירה של מעגל הביצועים הטוב ביותר ויכולה לחשוף תופעות מעניינות

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Continuous Measurement of Biological Noise in Escherichia Coli Using Time-lapse Microscopy

Engineering Biological-Based Vascular Grafts Using a Pulsatile Bioreactor

הנדסה ביולוגית המבוססת דם שתלי שימוש bioreactor pulsatile

Much effort has been devoted to develop and advance the methodology to regenerate functional small-diameter arterial bypasses. In the physiological ...

Three-dimensional Optical-resolution Photoacoustic Microscopy

תלת ממדית ברזולוציה אופטית photoacoustic מיקרוסקופית

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As ...

Fluorescent Nanoparticles for the Measurement of Ion Concentration in Biological Systems

חלקיקים ניאון למדידה של ריכוז יון במערכות ביולוגיות

Tightly regulated ion homeostasis throughout the body is necessary for the prevention of such debilitating states as dehydration.1 In contrast, rapid ion ...

Time-lapse Fluorescence Imaging of Arabidopsis Root Growth with Rapid Manipulation of The Root Environment Using The RootChip

זמן לשגות דימות פלואורסצנטי של צמיחה רוט ארבידופסיס עם מניפולציה מהירה של הסביבה רוט שימוש RootChip

The root functions as the physical anchor of the plant and is the organ responsible for uptake of water and mineral nutrients such as nitrogen, ...

In situ TEM of Biological Assemblies in Liquid

In situ TEM of Biological Assemblies in Liquid

במקום TEM של מכלולים ביולוגיים בנוזל

Researchers regularly use Transmission Electron Microscopes (TEMs) to examine biological entities and to assess new materials. Here, we describe an ...

Sample Drift Correction Following 4D Confocal Time-lapse Imaging

תיקון להיסחף לדוגמא בעקבות הזמן לשגות הדמיה 4D Confocal

The generation of four-dimensional (4D) confocal datasets; consisting of 3D image sequences over time; provides an excellent methodology to capture ...

Surface Potential Measurement of Bacteria Using Kelvin Probe Force Microscopy

משטח מדידת פוטנציאל של חיידקים באמצעות קלווין Probe מיקרוסקופית כוח

Surface potential is a commonly overlooked physical characteristic that plays a dominant role in the adhesion of microorganisms to substrate surfaces. ...

Design and Construction of Artificial Extracellular Matrix (aECM) Proteins from Escherichia coli for Skin Tissue Engineering

Design and Construction of Artificial Extracellular Matrix aECM Proteins from Escherichia coli for Skin Tissue Engineering

עיצוב ובנייה של תאי מטריקס המלאכותי (aECM) חלבונים מ<em&gt; Coli Escherichia</em&gt; להנדסת רקמות עור

Recombinant technology is a versatile platform to create novel artificial proteins with tunable properties. For the last decade, many artificial proteins ...

A Novel Technique for Generating and Observing Chemiluminescence in a Biological Setting

שיטה חדשנית עבור chemiluminescence יצירה וההתבוננות בסביבה ביולוגית

Intraoperative imaging techniques have the potential to make surgical interventions safer and more effective; for these reasons, such techniques are ...