Name: continuous measurement of biological noise in escherichia coli using time-lapse microscopy
Uploaded: 2021-04-27T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Continuous Measurement of Biological Noise in Escherichia Coli Using Time-lapse Microscopy at JoVE.com

Ringraziamo il Sig. Gil Gelbert (Facoltà di Ingegneria Elettrica, Technion) per aver assistervi con il codice MATLAB. Ringraziamo il Dr. Ximing Li (Facoltà di Ingegneria bio-medica, Technion) per aver assistenza nella correzione di questo articolo. Questa ricerca è stata parzialmente supportata dalla Neubauer Family Foundation e dal Ministero della Scienza israeliano, sovvenzione 2027345.

1. Preparazione dei media e della cultura
<ol><li>Preparare una soluzione stock di 1.000x carbenicillina (50 mg/mL) o antibiotico pertinente.<ol>
<li>. Pesare 0,5 g di carbenicillina. Aggiungere 10 mL di sterile H2O. Sciogliere completamente.</li>
		<li>Sterilizzare lo stock di carbenicillina attraverso un filtro siringa da 0,22 μm. Aliquota la soluzione antibiotica e conservare a -20 °C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Per preparare piatti di brodo di lisogenia (LB), mescolare 5 g di triptone, 5 g...

<ol>
	<li>Daniel, R., Rubens, J. R., Sarpeshkar, R., Lu, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+analog+computation+in+living+cells.">Synthetic analog computation in living cells.</a> Nature. 497, 619-623 (2013).</li><li>Yang, X. S. Y., L, A. B., Harwood, C., Jensen, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Imaging Bacterial Molecules, Structures and Cells. , (2016).</li><li>Joyce, G., Robertson, B. D., Williams, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modified+agar+pad+method+for+mycobacterial+live-cell+imaging.">A modified agar pad method for mycobacterial live-cell imaging.</a> Biomedcentral Research Notes. , (2011).</li><li>Cotlet, M., Goodwin, P. M., Waldo, G. S., Werner, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+the+fluorescence+dynamics+of+single+molecules+of+a+green+fluorescent+protein:+One-+versus+two-photon+excitation.">A comparison of the fluorescence dynamics of single molecules of a green fluorescent protein: One- versus two-photon excitation.</a> ChemPhysChem. , (2006).</li><li>Andersen, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+unstable+variants+of+green+fluorescent+protein+for+studies+of+transient+gene+expression+in+bacteria.">New unstable variants of green fluorescent protein for studies of transient gene expression in bacteria.</a> Applied and Environmental Microbiology. 64, 2240-2246 (1998).</li><li>Barger, N., Litovco, P., Li, X., Habib, M., Daniel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+metabolic+computation+in+a+bioluminescence-sensing+system.">Synthetic metabolic computation in a bioluminescence-sensing system.</a> Nucleic Acids Research. , (2019).</li><li>Young, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+single-cell+gene+expression+dynamics+in+bacteria+using+fluorescence+time-lapse+microscopy.">Measuring single-cell gene expression dynamics in bacteria using fluorescence time-lapse microscopy.</a> Nature Protocols. , (2012).</li><li>Swain, P. S., Elowitz, M. B., Siggia, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+and+extrinsic+contributions+to+stochasticity+in+gene+expression.">Intrinsic and extrinsic contributions to stochasticity in gene expression.</a> Proceedings of the National Academy of Science United States. , (2002).</li><li>Elowitz, M. B., Levine, A. J., Siggia, E. D., Swain, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stochastic+gene+expression+in+a+single+cell.">Stochastic gene expression in a single cell.</a> Science. , (2002).</li><li>Baumgart, L., Mather, W., Hasty, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synchronized+DNA+cycling+across+a+bacterial+population.">Synchronized DNA cycling across a bacterial population.</a> Nature Genetics. , (2017).</li><li>Arriaga, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+biological+noise+via+single+cell+analysis.">Determining biological noise via single cell analysis.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. , (2009).</li><li>Nielsen, A. A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+circuit+design+automation.">Genetic circuit design automation.</a> Science. , (2016).</li><li>Ozbudak, E. M., Thattai, M., Kurtser, I., Grossman, A. D., van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+noise+in+the+expression+of+a+single+gene.">Regulation of noise in the expression of a single gene.</a> Nature Genetics. 31, 69-73 (2002).</li><li>Pedraza, J. H., Van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noise+propagations+in+gene+networks.">Noise propagations in gene networks.</a> Science. , (2005).</li><li>Jennifer, A. N. B., Christopher, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+genetic+circuit+design.">Principles of genetic circuit design.</a> Nature Methods. , (2014).</li><li>Aoki, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+universal+biomolecular+integral+feedback+controller+for+robust+perfect+adaptation.">A universal biomolecular integral feedback controller for robust perfect adaptation.</a> Nature. , (2019).</li><li>Hanna, H. A., Danial, L., Kvatinsky, S., Daniel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cytomorphic Electronics with Memristors for Modeling Fundamental Genetic Circuits. 4545, (2020).</li><li>de Jong, I. G., Beilharz, K., Kuipers, O. P., Veening, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+cell+imaging+of+Bacillus+subtilis+and+Streptococcus+pneumoniae+using+automated+time-lapse+microscopy.">Live cell imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using automated time-lapse microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2011).</li><li>Eling, N., Morgan, M. D., Marioni, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+in+measuring+and+understanding+biological+noise.">Challenges in measuring and understanding biological noise.</a> Nature Reviews Genetics. , (2019).</li><li>Thattai, M., Van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Attenuation+of+noise+in+ultrasensitive+signaling+cascades.">Attenuation of noise in ultrasensitive signaling cascades.</a> Biophysical Journal. , (2002).</li><li>Thattai, M., Van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+noise+in+gene+regulatory+networks.">Intrinsic noise in gene regulatory networks.</a> Proceedings of the National Academy of Science United States. , (2001).</li><li>Rosenfeld, N., Young, J. W., Alon, U., Swain, P. S., Elowitz, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+regulation+at+the+single-cell+level.">Gene regulation at the single-cell level.</a> Science. , (2005).</li><li>Van Der Ziel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Noise in Measurements. , (1976).</li><li>Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+cloning:+A+laboratory+manual.+2nd+Edition.">Molecular cloning: A laboratory manual. 2nd Edition.</a> Cold Spring Harbor Laboratory Press. , (1989).</li><li>Carpenter, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CellProfiler:+Image+analysis+software+for+identifying+and+quantifying+cell+phenotypes.">CellProfiler: Image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes.</a> Genome Biology. , (2006).</li><li>Paintdakhi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oufti:+An+integrated+software+package+for+high-accuracy,+high-throughput+quantitative+microscopy+analysis.">Oufti: An integrated software package for high-accuracy, high-throughput quantitative microscopy analysis.</a> Molecular Microbiology. , (2016).</li><li>Ducret, A., Quardokus, E. M., Brun, Y. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicrobeJ,+a+tool+for+high+throughput+bacterial+cell+detection+and+quantitative+analysis.">MicrobeJ, a tool for high throughput bacterial cell detection and quantitative analysis.</a> Nature Microbiology. , (2016).</li><li>Stylianidou, S., Brennan, C., Molecular, S. B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> SuperSegger: robust image segmentation, analysis and lineage tracking of bacterial cells - Stylianidou - 2016 - Molecular Microbiology. , (2016).</li><li>Balomenos, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image+analysis+driven+single-cell+analytics+for+systems+microbiology.">Image analysis driven single-cell analytics for systems microbiology.</a> Biomedcentral System Biology. , (2017).</li><li>Smit, J. H., Li, Y., Warszawik, E. M., Herrmann, A., Cordes, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colicoords:+A+Python+package+for+the+analysis+of+bacterial+fluorescence+microscopy+data.">Colicoords: A Python package for the analysis of bacterial fluorescence microscopy data.</a> PLoS One. , (2019).</li><li>Guido, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bottom-up+approach+to+gene+regulation.">A bottom-up approach to gene regulation.</a> Nature. , (2006).</li><li>Beal, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signal-to-noise+ratio+measures+efficacy+of+biological+computing+devices+and+circuits.">Signal-to-noise ratio measures efficacy of biological computing devices and circuits.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. , (2015).</li><li>Marr, D., Hildreth, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Theory+of+edge+detection.">Theory of edge detection.</a> Proceedings of the Royal Society - Biology Science. 207, 187-217 (1980).</li><li>Otsu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Threshold+selection+method+from+gray-level+histograms.">Threshold selection method from gray-level histograms.</a> IEEE Transactions Systems Man Cybernetics. , (1979).</li><li>Soille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Morphological Image Analysis: Principles and Applications, Second edition. , (2000).</li><li>Bradley, D., Roth, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptive+Thresholding+using+the+Integral+Image.">Adaptive Thresholding using the Integral Image.</a> Journal of Graphics Tools. , (2007).</li><li>Meyer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topographic+distance+and+watershed+lines.">Topographic distance and watershed lines.</a> Signal Processing. , (1994).</li><li>Maurer, C. R., Qi, R., Raghavan, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+linear+time+algorithm+for+computing+exact+Euclidean+distance+transforms+of+binary+images+in+arbitrary+dimensions.">A linear time algorithm for computing exact Euclidean distance transforms of binary images in arbitrary dimensions.</a> IEEE Transactions on Pattern Analysis and Machine. , (2003).</li><li>Millo, R., Phillips, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+is+the+maturation+time+for+fluorescent+proteins.">What is the maturation time for fluorescent proteins.</a> Cell Biology by Numbers. , (2015).</li></ol>

In questo lavoro, abbiamo sviluppato un protocollo che consente il tracciamento computerico delle cellule vive di Escherichia coli, seguendo livelli di divisione e fluorescenti per un periodo di ore. Questo protocollo ci permette di quantificare le dinamiche stocastiche dei circuiti genetici in Escherichia coli misurando il CV e l'SNR in tempo reale. In questo protocollo, abbiamo confrontato i comportamenti stocastica di due circuiti diversi come mostrato nella Figura 10. È stato dimos...

La biologia sintetica è un campo multidisciplinare emerso nell'ultimo decennio e mira a tradurre i principi di progettazione ingegneristica in progettazione biologicarazionale 1,2,3,nel tentativo di raggiungere l'integrazione e l'elaborazione multi-segnale nelle cellule viventi per comprendere la scienza dibase 4,5,applicazioni diagnostiche, terapeutiche ebiotecnologiche 6,7,8,9,10. La nostra capacità di quantificare la risposta input-output dei circuiti genetici sintetici è stata rivoluzionata dai recenti progressi nella tecnologia a cella singola, tra cui l'analizzatore di flusso e l'imaging di cellule vive utilizzando la microscopia automatica time-lapse11. Un analizzatore di flusso viene spesso utilizzato per misurare la risposta di questi circuiti allo statostazionario 1,12e la microscopia invertita viene utilizzata per misurare la risposta dinamica dei circuiti genetici sintetici a livello di una singola cella3. Ad esempio, uno dei primi lavori in biologia sintetica ha comportato la costruzione di reti di oscillatori genetici in cellule viventi utilizzando cicli di feedback negativi con un ritardodi 3. Successivamente, i circuiti genetici dell'oscillatore sono stati applicati per comprendere il controllo metabolico nell'ambiente dinamico delle celluleviventi 4. La microscopia automatica time-lapse è un metodo per caratterizzare tali circuiti. Ipotizziamo che le cellule ospiti, Escherichia coli, si sincronizzino quando formano micro colonie, consentendo la misurazione del segnale e il calcolo del rumore senza tracciare relazioni esatte madre-figlia.
Il rumore è un aspetto fondamentale e intrinseco dei sistemi biologici spesso derivanti da più fonti. Si consideri, ad esempio, le reazioni biochimiche che coinvolgono segnali che provengono dal trasporto di vettori casuali discreti come la diffusione delle proteine13. Questi segnali si propagano con fluttuazioni casuali14. Altre fonti di rumore sono la disponibilità di risorse, la divisione cellulare e le variazioni delle condizioni ambientali come temperatura, umidità e pressione. I segnali biologici che si propagano nei circuiti genetici sintetici hanno spesso un rapporto segnale/rumore molto basso (SNR), che disturba le prestazioni di tali circuiti. Pertanto, la progettazione di circuiti genetici rimane uno degli aspetti più impegnativi dell'ingegneriagenetica 15. Ad esempio, a differenza della maggior parte degli approcci che calcolano solo l'espressione genica media (misurata sull'intera popolazione cellulare), la varianza del segnale misurato è considerata al fine di progettare un comportamento prevedibile attraverso reti genichesintetiche 12. Come tale, i livelli di variabilità o rumore nell'espressione proteica svolgono un ruolo dominante nella progettazione e nelle prestazioni dei circuiti genetici analogici e digitali1,16,17.
Sono stati sviluppati molti approcci per quantificare la variabilità da cellula a cellula, tra cui in Escherichia coli3,7,18. Questi metodi sono spesso utilizzati per studiare l'attivazione genica e le vie metaboliche, tuttavia con minore attenzione allo studio della dinamica del rumore stocastico, come la misurazione e la districazione di specifiche fonti di rumore, in particolare per i circuiti genetici nelle cellule viventi dove questa è unasfida fondamentale 19,20,21. Diversi fattori, entrambi ereditati dal circuito stesso (intrinseco) e derivati dalle cellule ospiti (estrinsece), possono disturbare le prestazioni continue dei circuiti genetici. In questo documento, abbiamo sviluppato un protocollo che mira a quantificare il rumore totale nelle cellule di Escherichia coli, comprese le fonti di rumore intrinseche ed estrinsece6,22. Quantificando il rumore totale e quindi valutando l'SNR23, è possibile migliorare la progettazione dei circuiti genetici. Questo metodo può essere modificato per misurare separatamente le fonti di rumore indipendenti, monitorando diverse proteinefluorescenti 6,20. Per il protocollo qui descritto, manteniamo le condizioni ambientali ben controllate e misuriamo continuamente l'attività delle cellule senza l'influenza di fattori esterni. Misuriamo il segnale dalle proteine fluorescenti in singole cellule nel tempo e contemporaneamente le immaginiamo sotto un substrato di agarosio. Le immagini risultanti vengono analizzate utilizzando il MATLAB personalizzato del laboratorio.
Idealmente, la misurazione continua dell'attività in tempo reale delle proteine fluorescenti all'interno di una cellula produrrà dati accurati attraverso la crescita e la divisione delle cellule. Tuttavia, è difficile acquisire tali dati. Ciò è dovuto alla degradazione delle proteine fluorescenti, note come foto-sbiancamento7, quando sono esposte a radiazioni nel processo di eccitazione. Inoltre, le cellule di Escherichia coli sono sensibili anche per l'eccitazione, che potrebbe portare alla fototossicità7. Entrambi i problemi limitano la quantità di cornici che possono essere acquisite e il tempo tra le acquisizioni. Anche il substrato e i tipi medi (ad esempio il brodo di licogenia) che viene utilizzato per far crescere le cellule durante l'imaging hanno un ruolo critico. Si consiglia vivamente di utilizzare un mezzo minimo, che riduce al minimo lo sfondo non fluorescente ed estende il tempo di divisione cellulare.
Inoltre, il campione deve essere preparato considerando i seguenti requisiti (1) Il basso tasso di divisione cellulare consente esposizioni meno frequenti per l'imaging da vicino del ciclo di divisione e la riduzione della probabilità di fototossicità e fotoblesaching. Abbiamo impostato il tempo di acquisizione su circa la metà del tempo di mitosi previsto (2) La bassa densità cellulare all'inizio dell'esperimento consente una migliore uniformità e tracciabilità della divisione. La densità cellulare è influenzata dal rapporto di diluizione delle cellule di Escherichia coli, che è un parametro significativo per il successo di questo protocollo e deve essere determinato per ogni laboratorio. Per stabilire il rapporto, ogni nuovo ceppo o supporto di Escherichia coli utilizzato dovrebbe essere dotato di grafici del tasso di crescita(figura complementare 1). Un rapporto appropriato è stato raggiunto se le cellule possono crescere senza ulteriori scosse dopo una breve incubazione da una densità iniziale di circa600nm di OD = 0,1. Le cellule in questa fase si divideranno solo in base alla temperatura dell'ambiente (3) Restrizione del movimento cellulare: il movimento cellulare dipende fortemente dalla compattezza del substrato (tampone di agarosio). La compattezza del substrato dipende dalla quantità di agarosio totale e dal tempo di solidificazione del gel. I gel non possono essere lasciati solidificare durante la notte a temperatura ambiente, poiché l'Escherichia coli subirà la mitosi. Altri fattori che influenzano la stabilità del substrato includono la quantità di acqua nel campione e l'umidità. Ulteriori questioni sono discusse in dettaglio nei risultati rappresentativi. Questo protocollo fornisce molti dettagli e si sposta gradualmente da un passo all'altro. Il protocollo offre una lunga stabilità per gli esperimenti di imaging e fornisce uno strumento di elaborazione delle immagini di base.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:748px;" width="747">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">35mm glass dish</td>
			<td style="width:216px;">mattek</td>
			<td style="width:137px;">P35G-0.170-14-C</td>
			<td style="width:172px;">thickness corresponding with microscope lense.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Agarose&#160;</td>
			<td style="width:216px;">Lonza</td>
			<td style="width:137px;">5004</td>
			<td>LB preperation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">AHL&#160;</td>
			<td style="width:216px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">K3007</td>
			<td>inducer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Bacto tryptone&#160;</td>
			<td style="width:216px;">BD - Becton, Dickinson and Company&#160;</td>
			<td style="width:137px;">211705</td>
			<td>LB preperation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Carb</td>
			<td style="width:216px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:137px;">10177-012</td>
			<td>antibiotic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Carb</td>
			<td style="width:216px;">Formedium</td>
			<td style="width:137px;">CAR0025</td>
			<td>antibiotic</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Casamino acids&#160;</td>
			<td style="width:216px;">BD - Becton, Dickinson and Company&#160;</td>
			<td style="width:137px;">223050</td>
			<td>minimal media solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">eclipse Ti</td>
			<td style="width:216px;">nikon</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td>inverted microscope</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Glucose</td>
			<td style="width:216px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">G5767</td>
			<td>minimal media solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Glyserol</td>
			<td style="width:216px;">Bio-Lab</td>
			<td style="width:137px;">000712050100</td>
			<td>minimal media substrate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Immersol 518F</td>
			<td style="width:216px;">zeiss</td>
			<td style="width:137px;">4449600000000</td>
			<td>immersion oil</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">M9 salt solution&#160;</td>
			<td style="width:216px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">M6030</td>
			<td>minimal media solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">NaCl</td>
			<td style="width:216px;">Bio-Lab</td>
			<td style="width:137px;">214010</td>
			<td>LB preperation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Noble agar</td>
			<td style="width:216px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">A5431</td>
			<td>minimal media substrate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">parafilm tape</td>
			<td style="width:216px;">Bemis</td>
			<td style="width:137px;">PM-996</td>
			<td>refered to as tape in text</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Seaplaque GTG Agarose</td>
			<td style="width:216px;">Lonza</td>
			<td style="width:137px;">50111</td>
			<td>minimal media substrate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">thaymine B1</td>
			<td style="width:216px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">T0376&#160;</td>
			<td>minimal media solution</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Yeast Extract</td>
			<td style="width:216px;">BD - Becton, Dickinson and Company&#160;</td>
			<td style="width:137px;">212750</td>
			<td>LB preperation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

continuous measurement of biological noise in escherichia coli using time-lapse microscopy

Il protocollo qui sviluppato offre uno strumento per consentire il tracciamento informatico della divisione Escherichia coli e dei livelli fluorescenti per diverse ore. Il processo inizia attraverso lo screening per le colonie che sopravvivono su supporti minimi, supponendo che solo Escherichia coli che ospita il plasmide corretto sarà in grado di prosperare nelle condizioni specifiche. Poiché il processo di costruzione di grandi circuiti genetici, che richiedono l'assemblaggio di molte parti del DNA, è impegnativo, i componenti del circuito sono spesso distribuiti tra più plasmidi a diversi numeri di copia che richiedono l'uso di diversi antibiotici. Le mutazioni nel plasmide possono distruggere la trascrizione dei geni di resistenza agli antibiotici e interiettare con la gestione delle risorse nella cellula che porta alla necrosi. La colonia selezionata è impostata su una piastra di Petri con fondo di vetro e alcuni piani di messa a fuoco sono selezionati per il tracciamento della microscopia sia in campo luminoso che in domini fluorescenti. Il protocollo mantiene lo stato attivo dell'immagine per più di 12 ore in condizioni iniziali che non possono essere regolamentate, creando alcune difficoltà. Ad esempio, le cellule morte iniziano ad accumularsi nel campo di messa a fuoco delle lenti dopo alcune ore di imaging, il che causa l'accumulo di tossine e la sfocatura e il decadimento del segnale. L'esaurimento dei nutrienti introduce nuovi processi metabolici e ostacola la risposta desiderata del circuito. La temperatura dell'esperimento abbassa l'effettività di induttori e antibiotici, il che può danneggiare ulteriormente l'affidabilità del segnale. Il gel multimediale minimo si restringe e si asciuga e, di conseguenza, la messa a fuoco ottica cambia nel tempo. Abbiamo sviluppato questo metodo per superare queste sfide in Escherichia coli, simile ai lavori precedenti che sviluppano metodi analoghi per altri microrganismi. Inoltre, questo metodo offre un algoritmo per quantificare il rumore stocastico totale nelle celle inaltere e alterate, scoprendo che i risultati sono coerenti con le previsioni dell'analizzatore di flusso come mostrato da un coefficiente di variazione simile (CV).

Il software analizza le immagini del dominio di campo luminoso che sono bianche e nere. L'Escherichia coli sarà simile a forme oblunghe nere su uno sfondo bianco troppo bianco e la gamma dinamica di luminanza dovrebbe mostrare un picco al centro (Figura 1). Nelle immagini fluorescenti le cellule possono avere un piccolo alone, ma le singole cellule con forme oblunghe possono ancora essere risolte. Un evento di mitosi deve essere rilevato per la prima volta dopo 30 minuti. La messa ...

Watch this Scientific Journal Video about Continuous Measurement of Biological Noise in Escherichia Coli Using Time-lapse Microscopy at JoVE.com

Continuous Measurement of Biological Noise in Escherichia Coli Using Time-lapse Microscopy

Questo lavoro presenta un metodo di microscopia che consente l'imaging vivo di una singola cellula di Escherichia coli per l'analisi e la quantificazione del comportamento stocastico dei circuiti genetici sintetici.

Misurazione continua del rumore biologico in Escherichia Coli utilizzando la microscopia time-lapse

The protocol developed here offers a tool to enable computer tracking of Escherichia coli division and fluorescent levels over several hours. The process ...

Questo protocollo nelle erbe misura continua dei circuiti genetici in E.coli e il calcolo della variabilità del segnale e del rapporto segnale-rumore nelle singole cellule batteriche per valutare le prestazioni del circuito. I principali vantaggi di questa tecnica sono che è facilmente adattabile a diversi ceppi e laboratori, richiede un allenamento minimo e nessuna attrezzatura speciale ed è relativamente economico. Il rumore è un ruolo significativo nel determinare la funzionalità dei sistemi biologici.Attualmente, c'è interesse a costruire circuiti genetici su larga scala. Questi sistemi possono essere inibiti dal rumore Assicurarsi di asciugare bene i campioni, di mantenere i tamponi a freddo a quattro gradi Celsius il più a lungo possibile e di tagliare e dividere le parti con pazienza e delicatezza. Per preparare i batteri per l'analisi inoculare una singola colonia da una coltura E.coli trasfettata.Ad esempio, un circuito con un reporter GFP. In un tubo di vetro contenente cinque millilitri di brodo LB completarlo con gli antibiotici pertinenti. Far crescere le cellule a 37 gradi Celsius e 250 giri al minuto in un'incubatrice di scuotimento per due ore fino a quando il brodo non è torbido.Al termine dell'incubazione, spingi un millilitro di soluzione di diluizione in una mini micro centrifuga da due millilitri e trasferisci 30 microlitri di batteri e l'intero volume della soluzione di diluizione in un nuovo tubo da due millilitri. Quindi, incubare la coltura per un'ora con tremori prima di seminare da 40 a 60 microlitri di questa sospensione su piastre di coltura M9. Per preparare i batteri per l'analisi, inoculare una singola colonia da una coltura E.Coli trasfettata.Ad esempio, un circuito con un reporter GFP in un tubo di vetro contenente cinque millilitri di brodo LB integrati con gli antibiotici pertinenti. Far crescere le cellule a 37 gradi Celsius e 250 giri al minuto in un'incubatrice di scuotimento per due ore fino a quando il brodo non è torbido. Al termine dell'incubazione, far scendere un millilitro di soluzione di diluizione in un mini tubo di micro centrifuga a due millilitri e trasferire 30 microlitri di batteri e l'intero volume della soluzione di diluizione in un nuovo tubo da due millilitri.Quindi incubare la coltura per un'ora con tremori. Per preparare lastre al microscopio, mescolare 112,5 milligrammi di agar a bassa fusione con 40 milligrammi di agar e un millilitro di 2%casaminoacido in un pallone Erlenmeyer da 25 millilitri. Successivamente, aggiungere 8,92 millilitri di mezzo minimo sulle labbra interne di un pallone Erlenmeyer da 25 millilitri e microonde la soluzione risultante in brevi raffiche da due a tre secondi.Quindi impostare il bagno d'acqua a 55 gradi Celsius. Quando la soluzione è chiara, posizionare il pallone Erlenmeyer da 25 millilitri in un bagno d'acqua di 60 gradi Celsius e lasciare raffreddare la soluzione di agar fino a quando la sua temperatura scende a circa 45-50 gradi Celsius. Durante il raffreddamento dell'agar, pulire il banco da laboratorio con il 70% di etanolo e lisciare un pezzo di nastro da laboratorio sulla panca pulita.Posizionare una copertura di vetro scivolare sul nastro e posizionare un secondo coperchio scivolare nelle vicinanze. Aggiungere la soluzione di agar raffreddata agli antibiotici e alla soluzione appropriati. Versare 1,5 millilitri di soluzione di gel appena preparata sul coperchio del nastro e posizionare il secondo coperchio scivolare sul gel, facendo attenzione ad evitare bolle.Riportare l'Erlenmeyer al bagno di acqua calda e coprire le copertine per 20 minuti. Capovolgere la copertura scivola per un'incubazione di un'ora a quattro gradi Celsius. Alla fine dell'incubazione, rimuovere i coperchi dal gel secco e tagliare un piccolo tampone dall'agarosio.Durante l'incubazione, aggiungere sei goccioline di microlitri della sospensione batterica preparata in un piatto da 35 millimetri e lasciare asciugare le gocce per almeno 15-30 minuti. Quindi posizionare con cura il pad alla volta su una goccia di batteri e consentire ai campioni di impostare per 20 minuti a temperatura ambiente. Per posizionare il letto di agar senza spalmare il campione, posizionare con cura il cuscinetto fresco sulla goccia con una delicata maschiatura.Per immaginire i campioni, rimuovere il pallone dall'acqua e lasciare raffreddare la soluzione di gel alla temperatura corporea. Versare tre millimetri del gel sul perimetro della piastra del campione. Quando l'agarosio si è solidificato, sigillare la piastra con nastro adesivo e utilizzare un ago calibro 25 per infilare diversi fori nel nastro.Quindi posizionare la piastra capovolta a quattro gradi Celsius per almeno 30 minuti per consentire all'agarosio di solidificarsi completamente, prevenendo al contempo la mitosi cellulare. Entro 24 ore, utilizzare un microscopio confocale a fluorescenza per localizzare il campione all'ingrandimento più basso e attivare il sistema di messa a fuoco automatica del microscopio. Applicare l'olio sull'obiettivo appropriato e utilizzare il controller della piattaforma per spostare la piastra per stendere con cura l'olio.Quindi attivare nuovamente lo stato attivo automatico e seguire il suggerimento predefinito per le sezioni trasversali del passaggio Z per l'immagine dell'esempio. L'E.coli dovrebbe apparire come forme oblunghe nere su uno sfondo bianco nevroico. E la gamma dinamica della luminanza dovrebbe mostrare un picco al centro.Gli eventi di mitosi possono essere rilevati per la prima volta dalla microscopia a fluorescenza dopo 30 minuti. Sebbene le singole celle possano essere difficili da rilevare a basso ingrandimento. Le colture cellulari batteriche preparate con un rapporto di diluizione errato possono dimostrare un numero immutabile di cellule e i campioni preparati senza tenuta delle lastre possono presentare un eccessivo restringimento, con conseguente perdita di messa a fuoco.Le cellule possono anche indentare il gel nella loro ricerca di nutrienti, con conseguente impilamento delle cellule batteriche l'una sopra l'altra e compromettendo il monostrato cellulare, prevenendo efficacemente il rilevamento cellulare e la misurazione affidabile del segnale fluorescente. Come suggerito da questi dati, lo stadio della cella nel ciclo di divisione non influisce sul livello di rumore, poiché diversi intervalli di area dimostrano la stessa tendenza. Inoltre, non si osserva alcuna modifica sostanziale del rapporto segnale/rumore tra GFP e FPG superfold, come illustrato da questi dati rappresentativi.Quando si esegue questa procedura, fare attenzione a determinare il corretto rapporto di diluizione per il ceppo batterico utilizzato per l'esperimento. Il confronto tra il rapporto segnale/rumore di ogni circuito regolato con questa linea di base consente di scegliere il miglior circuito di prestazioni e può rivelare fenomeni interessanti

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Continuous Measurement of Biological Noise in Escherichia Coli Using Time-lapse Microscopy

Engineering Biological-Based Vascular Grafts Using a Pulsatile Bioreactor

Ingegneria biologica basata innesti vascolari Utilizzando un bioreattore pulsatile

Much effort has been devoted to develop and advance the methodology to regenerate functional small-diameter arterial bypasses. In the physiological ...

Ricerca

Bioingegneria

Three-dimensional Optical-resolution Photoacoustic Microscopy

Tridimensionale con risoluzione ottica Microscopia fotoacustico

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As ...

Fluorescent Nanoparticles for the Measurement of Ion Concentration in Biological Systems

Le nanoparticelle fluorescenti per la misurazione della concentrazione di ioni in sistemi biologici

Tightly regulated ion homeostasis throughout the body is necessary for the prevention of such debilitating states as dehydration.1 In contrast, rapid ion ...

Time-lapse Fluorescence Imaging of Arabidopsis Root Growth with Rapid Manipulation of The Root Environment Using The RootChip

Time-lapse imaging di fluorescenza della crescita Root Arabidopsis con manipolazione accelerato dell&#39;ambiente root usando il RootChip

The root functions as the physical anchor of the plant and is the organ responsible for uptake of water and mineral nutrients such as nitrogen, ...

In situ TEM of Biological Assemblies in Liquid

In situ TEM of Biological Assemblies in Liquid

In situ TEM di assemblee biologiche in liquido

Researchers regularly use Transmission Electron Microscopes (TEMs) to examine biological entities and to assess new materials. Here, we describe an ...

Sample Drift Correction Following 4D Confocal Time-lapse Imaging

Correzione Drift seguente esempio 4D confocale Time-lapse imaging

The generation of four-dimensional (4D) confocal datasets; consisting of 3D image sequences over time; provides an excellent methodology to capture ...

Surface Potential Measurement of Bacteria Using Kelvin Probe Force Microscopy

Superficie di misurazione potenziale di batteri Utilizzando Kelvin Probe microscopia a forza

Surface potential is a commonly overlooked physical characteristic that plays a dominant role in the adhesion of microorganisms to substrate surfaces. ...

Design and Construction of Artificial Extracellular Matrix (aECM) Proteins from Escherichia coli for Skin Tissue Engineering

Design and Construction of Artificial Extracellular Matrix aECM Proteins from Escherichia coli for Skin Tissue Engineering

Progettazione e Costruzione di Artificiale matrice extracellulare (AECM) Proteine ​​da<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Per la pelle Ingegneria dei Tessuti

Recombinant technology is a versatile platform to create novel artificial proteins with tunable properties. For the last decade, many artificial proteins ...

A Novel Technique for Generating and Observing Chemiluminescence in a Biological Setting

Una tecnica innovativa per la generazione e Observing Chemiluminescenza in un ambiente biologico

Intraoperative imaging techniques have the potential to make surgical interventions safer and more effective; for these reasons, such techniques are ...