Name: continuous measurement of biological noise in escherichia coli using time-lapse microscopy
Uploaded: 2021-04-27T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Continuous Measurement of Biological Noise in Escherichia Coli Using Time-lapse Microscopy at JoVE.com

Vi takker Mr. Gil Gelbert (Fakultet for elektroteknikk, Technion) for å bistå med MATLAB-koden. Vi takker Dr. Ximing Li (Fakultet for biomedisinsk ingeniørfag, Technion) for å bistå med å bevise denne artikkelen. Denne forskningen ble delvis støttet av Neubauer Family Foundation og Israel Ministry of Science, grant 2027345.

1. Medie- og kulturforberedelse
<ol><li>Forbered lagerløsning på 1000x Carbenicillin (50 mg / ml) eller relevant antibiotika.<ol>
<li>. Vei 0,5 g carbenicillin. Tilsett 10 ml steril H2O. Oppløs helt.</li>
		<li>Steriliser carbenicillin lager gjennom et 0,22 μm sprøytefilter. Aliquot antibiotikaoppløsningen og lagre ved -20 °C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>For å forberede lysogenibuljongplater (LB), bland 5 g trypton, 5 g NaCl, 2,5 g gjærekstrakt og 7,5 g Bacto agar med 0,5 L steril H...

<ol>
	<li>Daniel, R., Rubens, J. R., Sarpeshkar, R., Lu, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+analog+computation+in+living+cells.">Synthetic analog computation in living cells.</a> Nature. 497, 619-623 (2013).</li><li>Yang, X. S. Y., L, A. B., Harwood, C., Jensen, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Imaging Bacterial Molecules, Structures and Cells. , (2016).</li><li>Joyce, G., Robertson, B. D., Williams, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modified+agar+pad+method+for+mycobacterial+live-cell+imaging.">A modified agar pad method for mycobacterial live-cell imaging.</a> Biomedcentral Research Notes. , (2011).</li><li>Cotlet, M., Goodwin, P. M., Waldo, G. S., Werner, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+the+fluorescence+dynamics+of+single+molecules+of+a+green+fluorescent+protein:+One-+versus+two-photon+excitation.">A comparison of the fluorescence dynamics of single molecules of a green fluorescent protein: One- versus two-photon excitation.</a> ChemPhysChem. , (2006).</li><li>Andersen, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+unstable+variants+of+green+fluorescent+protein+for+studies+of+transient+gene+expression+in+bacteria.">New unstable variants of green fluorescent protein for studies of transient gene expression in bacteria.</a> Applied and Environmental Microbiology. 64, 2240-2246 (1998).</li><li>Barger, N., Litovco, P., Li, X., Habib, M., Daniel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+metabolic+computation+in+a+bioluminescence-sensing+system.">Synthetic metabolic computation in a bioluminescence-sensing system.</a> Nucleic Acids Research. , (2019).</li><li>Young, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+single-cell+gene+expression+dynamics+in+bacteria+using+fluorescence+time-lapse+microscopy.">Measuring single-cell gene expression dynamics in bacteria using fluorescence time-lapse microscopy.</a> Nature Protocols. , (2012).</li><li>Swain, P. S., Elowitz, M. B., Siggia, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+and+extrinsic+contributions+to+stochasticity+in+gene+expression.">Intrinsic and extrinsic contributions to stochasticity in gene expression.</a> Proceedings of the National Academy of Science United States. , (2002).</li><li>Elowitz, M. B., Levine, A. J., Siggia, E. D., Swain, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stochastic+gene+expression+in+a+single+cell.">Stochastic gene expression in a single cell.</a> Science. , (2002).</li><li>Baumgart, L., Mather, W., Hasty, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synchronized+DNA+cycling+across+a+bacterial+population.">Synchronized DNA cycling across a bacterial population.</a> Nature Genetics. , (2017).</li><li>Arriaga, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+biological+noise+via+single+cell+analysis.">Determining biological noise via single cell analysis.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. , (2009).</li><li>Nielsen, A. A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+circuit+design+automation.">Genetic circuit design automation.</a> Science. , (2016).</li><li>Ozbudak, E. M., Thattai, M., Kurtser, I., Grossman, A. D., van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+noise+in+the+expression+of+a+single+gene.">Regulation of noise in the expression of a single gene.</a> Nature Genetics. 31, 69-73 (2002).</li><li>Pedraza, J. H., Van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noise+propagations+in+gene+networks.">Noise propagations in gene networks.</a> Science. , (2005).</li><li>Jennifer, A. N. B., Christopher, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+genetic+circuit+design.">Principles of genetic circuit design.</a> Nature Methods. , (2014).</li><li>Aoki, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+universal+biomolecular+integral+feedback+controller+for+robust+perfect+adaptation.">A universal biomolecular integral feedback controller for robust perfect adaptation.</a> Nature. , (2019).</li><li>Hanna, H. A., Danial, L., Kvatinsky, S., Daniel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cytomorphic Electronics with Memristors for Modeling Fundamental Genetic Circuits. 4545, (2020).</li><li>de Jong, I. G., Beilharz, K., Kuipers, O. P., Veening, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+cell+imaging+of+Bacillus+subtilis+and+Streptococcus+pneumoniae+using+automated+time-lapse+microscopy.">Live cell imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using automated time-lapse microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2011).</li><li>Eling, N., Morgan, M. D., Marioni, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+in+measuring+and+understanding+biological+noise.">Challenges in measuring and understanding biological noise.</a> Nature Reviews Genetics. , (2019).</li><li>Thattai, M., Van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Attenuation+of+noise+in+ultrasensitive+signaling+cascades.">Attenuation of noise in ultrasensitive signaling cascades.</a> Biophysical Journal. , (2002).</li><li>Thattai, M., Van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+noise+in+gene+regulatory+networks.">Intrinsic noise in gene regulatory networks.</a> Proceedings of the National Academy of Science United States. , (2001).</li><li>Rosenfeld, N., Young, J. W., Alon, U., Swain, P. S., Elowitz, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+regulation+at+the+single-cell+level.">Gene regulation at the single-cell level.</a> Science. , (2005).</li><li>Van Der Ziel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Noise in Measurements. , (1976).</li><li>Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+cloning:+A+laboratory+manual.+2nd+Edition.">Molecular cloning: A laboratory manual. 2nd Edition.</a> Cold Spring Harbor Laboratory Press. , (1989).</li><li>Carpenter, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CellProfiler:+Image+analysis+software+for+identifying+and+quantifying+cell+phenotypes.">CellProfiler: Image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes.</a> Genome Biology. , (2006).</li><li>Paintdakhi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oufti:+An+integrated+software+package+for+high-accuracy,+high-throughput+quantitative+microscopy+analysis.">Oufti: An integrated software package for high-accuracy, high-throughput quantitative microscopy analysis.</a> Molecular Microbiology. , (2016).</li><li>Ducret, A., Quardokus, E. M., Brun, Y. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicrobeJ,+a+tool+for+high+throughput+bacterial+cell+detection+and+quantitative+analysis.">MicrobeJ, a tool for high throughput bacterial cell detection and quantitative analysis.</a> Nature Microbiology. , (2016).</li><li>Stylianidou, S., Brennan, C., Molecular, S. B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> SuperSegger: robust image segmentation, analysis and lineage tracking of bacterial cells - Stylianidou - 2016 - Molecular Microbiology. , (2016).</li><li>Balomenos, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image+analysis+driven+single-cell+analytics+for+systems+microbiology.">Image analysis driven single-cell analytics for systems microbiology.</a> Biomedcentral System Biology. , (2017).</li><li>Smit, J. H., Li, Y., Warszawik, E. M., Herrmann, A., Cordes, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colicoords:+A+Python+package+for+the+analysis+of+bacterial+fluorescence+microscopy+data.">Colicoords: A Python package for the analysis of bacterial fluorescence microscopy data.</a> PLoS One. , (2019).</li><li>Guido, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bottom-up+approach+to+gene+regulation.">A bottom-up approach to gene regulation.</a> Nature. , (2006).</li><li>Beal, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signal-to-noise+ratio+measures+efficacy+of+biological+computing+devices+and+circuits.">Signal-to-noise ratio measures efficacy of biological computing devices and circuits.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. , (2015).</li><li>Marr, D., Hildreth, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Theory+of+edge+detection.">Theory of edge detection.</a> Proceedings of the Royal Society - Biology Science. 207, 187-217 (1980).</li><li>Otsu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Threshold+selection+method+from+gray-level+histograms.">Threshold selection method from gray-level histograms.</a> IEEE Transactions Systems Man Cybernetics. , (1979).</li><li>Soille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Morphological Image Analysis: Principles and Applications, Second edition. , (2000).</li><li>Bradley, D., Roth, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptive+Thresholding+using+the+Integral+Image.">Adaptive Thresholding using the Integral Image.</a> Journal of Graphics Tools. , (2007).</li><li>Meyer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topographic+distance+and+watershed+lines.">Topographic distance and watershed lines.</a> Signal Processing. , (1994).</li><li>Maurer, C. R., Qi, R., Raghavan, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+linear+time+algorithm+for+computing+exact+Euclidean+distance+transforms+of+binary+images+in+arbitrary+dimensions.">A linear time algorithm for computing exact Euclidean distance transforms of binary images in arbitrary dimensions.</a> IEEE Transactions on Pattern Analysis and Machine. , (2003).</li><li>Millo, R., Phillips, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+is+the+maturation+time+for+fluorescent+proteins.">What is the maturation time for fluorescent proteins.</a> Cell Biology by Numbers. , (2015).</li></ol>

I dette arbeidet utviklet vi en protokoll som muliggjør datasporing av Escherichia coli levende celler, etter divisjon og fluorescerende nivåer over en periode på timer. Denne protokollen lar oss kvantifisere den stokastiske dynamikken i genetiske kretser i Escherichia coli ved å måle CV og SNR i sanntid. I denne protokollen sammenlignet vi den stokastiske oppførselen til to forskjellige kretser som vist i figur 10. Det har vist seg at plasmider med lave kopitall er mer utsatt for...

Syntetisk biologi er et tverrfaglig felt som har dukket opp det siste tiåret og tar sikte på å oversette ingeniørdesignprinsipper til rasjonell biologisk design1,2,3, i et forsøk på å oppnå multisignalintegrasjon og behandling i levende celler for å forstå grunnleggende vitenskap4,5, diagnostiske, terapeutiske og bioteknologiske applikasjoner6,7,8,9,10. Vår evne til å kvantifisere inngangseffekten av syntetiske genkretser har blitt revolusjonert av nylige fremskritt innen encelleteknologi, inkludert strømningsanalysatoren og levende celleavbildning ved hjelp av automatisert tidsforløpmikroskopi11. En strømningsanalysator brukes ofte til å måle responsen til disse kretsene ved steady state1,12, og invertert mikroskopi brukes til å måle den dynamiske responsen til syntetiske genkretser på nivået av en enkelt celle3. For eksempel involverte et av de tidlige verkene i syntetisk biologi bygging av genetiske oscillatornettverk i levende celler ved hjelp av negative tilbakemeldingssløyfer med en forsinkelse3. Senere ble de genetiske oscillatorkretsene brukt til å forstå metabolsk kontroll i det dynamiske miljøet til levende celler4. Automatisert tidsforløpmikroskopi er en metode for å karakterisere slike kretser. Vi hypoteser at vertscellene, Escherichia coli, synkroniserer når de danner mikrokolonier, slik at måling av signal og beregning av støy uten å spore eksakte mor-datter relasjoner.
Støy er et grunnleggende, iboende aspekt av biologiske systemer som ofte oppstår fra flere kilder. Vurder for eksempel biokjemiske reaksjoner som involverer signaler som stammer fra transport av diskrete tilfeldige bærere som diffusjon av proteiner13. Disse signalene forplanter seg med tilfeldigesvingninger 14. Andre støykilder er ressurstilgjengelighet, celledeling og variasjoner i miljøforhold som temperatur, fuktighet og trykk. Biologiske signaler som forplanter seg i syntetiske genkretser har ofte et svært lavt signal-til-støy-forhold (SNR), noe som forstyrrer ytelsen til slike kretser. Derfor er genetisk kretsdesign fortsatt en av de mest utfordrende aspektene ved genteknologi15. For eksempel, i motsetning til de fleste tilnærminger som bare beregner gjennomsnittlig genuttrykk (målt over hele cellepopulasjonen), vurderes variansen til det målte signalet for å konstruere forutsigbar oppførsel gjennom syntetiske gennettverk12. Som sådan spiller nivåene av variasjon eller støy i proteinuttrykket en dominerende rolle i design og ytelse av analoge og digitale genkretser1,16,17.
Mange tilnærminger er utviklet for å kvantifisere celle-til-celle variasjon, inkludert i Escherichia coli3,7,18. Disse metodene brukes ofte til å studere genaktivering og metabolske veier, men med mindre fokus på studiet av stokastisk støydynamikk, som måling og disentangling spesifikke støykilder, spesielt for genetiske kretser i levende celler der dette er en grunnleggende utfordring19,20,21. Flere faktorer, både arvet til selve kretsen (iboende) og avledet fra vertscellene (ekstrinsisk), kan forstyrre den kontinuerlige ytelsen til genetiske kretser. I dette dokumentet utviklet vi en protokoll som tar sikte på å kvantifisere den totale støyen i Escherichia coli-celler, inkludert de iboende og ekstrinsiske støykildene6,22. Ved å kvantifisere den totale støyen og deretter evaluere SNR23, kan utformingen av genkretser forbedres. Denne metoden kan modifiseres for å måle uavhengige støykilder separat, ved å overvåke flere fluorescerende proteiner6,20. For protokollen som er beskrevet her, holder vi miljøforholdene godt kontrollert og måler kontinuerlig aktiviteten til celler uten påvirkning av eksterne faktorer. Vi måler signalet fra fluorescerende proteiner i enkeltceller over tid og avbilder dem samtidig under et agarose substrat. De resulterende bildene analyseres ved hjelp av laboratoriets tilpassede MATLAB.
Ideelt sett vil kontinuerlig måling av sanntidsaktiviteten til fluorescerende proteiner inne i en celle produsere nøyaktige data gjennom veksten og delingen av cellene. Det er imidlertid utfordrende å innhente slike data. Dette skyldes nedbrytning av fluorescerende proteiner, kjent som fotobleking7, når de blir utsatt for stråling i eksitasjonsprosessen. Videre er Escherichia coli-celler også følsomme for eksitasjonen, noe som kan føre til fototoksisitet7. Begge problemene begrenser mengden fotorammer som kan anskaffes og tiden mellom oppkjøp. Substratet og mediumtypene (f.eks. lysogenybuljong) som brukes til å dyrke cellene under avbildning, har også en kritisk rolle. Vi anbefaler på det sterkeste å bruke minimalt medium, noe som minimerer ikke-fluorescerende bakgrunn og utvider celledelingstiden.
Videre må prøven utarbeides med tanke på følgende krav (1) Lav celledelingshastighet gir mindre hyppige eksponeringer for nøye avbildning av divisjonssyklusen og redusere sannsynligheten for fototoksisitet og fotobleaching. Vi setter oppkjøpstiden til omtrent halvparten av den anslåtte mitosetiden (2) Lav celletetthet i begynnelsen av eksperimentet gir bedre ensartethet og sporbarhet av divisjon. Celletetthet påvirkes av fortynningsforholdet til Escherichia coli-cellene, som er en betydelig parameter for suksessen til denne protokollen og må bestemmes for hvert laboratorium. For å etablere forholdet, bør hver nye Escherichia coli-stamme eller medier som brukes, utstyres med vekstrategrafer (Supplerende figur 1). Et passende forhold er oppnådd hvis celler kan vokse uten ekstra risting etter en kort inkubasjon fra en innledende tetthet på ca OD600nm = 0,1. Celler i denne fasen vil bare dividere i henhold til miljøtemperaturen (3) Begrensning av cellebevegelse: cellebevegelser avhenger sterkt av substrat (agarose pad) fasthet. Substratets fasthet avhenger av mengden total agarose og gel størkningstiden. Geler kan ikke overlates til å størkne over natten ved romtemperatur, da Escherichia coli vil gjennomgå mitose. Andre faktorer som påvirker substratstabiliteten inkluderer mengden vann i prøven og fuktigheten. Ytterligere problemer drøfter i detalj i representative resultater. Denne protokollen gir mange detaljer og beveger seg gradvis fra ett trinn til et annet. Protokollen gir lang stabilitet for bildebehandlingseksperimenter og gir et grunnleggende bildebehandlingsverktøy.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:748px;" width="747">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">35mm glass dish</td>
			<td style="width:216px;">mattek</td>
			<td style="width:137px;">P35G-0.170-14-C</td>
			<td style="width:172px;">thickness corresponding with microscope lense.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Agarose&#160;</td>
			<td style="width:216px;">Lonza</td>
			<td style="width:137px;">5004</td>
			<td>LB preperation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">AHL&#160;</td>
			<td style="width:216px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">K3007</td>
			<td>inducer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Bacto tryptone&#160;</td>
			<td style="width:216px;">BD - Becton, Dickinson and Company&#160;</td>
			<td style="width:137px;">211705</td>
			<td>LB preperation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Carb</td>
			<td style="width:216px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:137px;">10177-012</td>
			<td>antibiotic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Carb</td>
			<td style="width:216px;">Formedium</td>
			<td style="width:137px;">CAR0025</td>
			<td>antibiotic</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Casamino acids&#160;</td>
			<td style="width:216px;">BD - Becton, Dickinson and Company&#160;</td>
			<td style="width:137px;">223050</td>
			<td>minimal media solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">eclipse Ti</td>
			<td style="width:216px;">nikon</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td>inverted microscope</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Glucose</td>
			<td style="width:216px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">G5767</td>
			<td>minimal media solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Glyserol</td>
			<td style="width:216px;">Bio-Lab</td>
			<td style="width:137px;">000712050100</td>
			<td>minimal media substrate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Immersol 518F</td>
			<td style="width:216px;">zeiss</td>
			<td style="width:137px;">4449600000000</td>
			<td>immersion oil</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">M9 salt solution&#160;</td>
			<td style="width:216px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">M6030</td>
			<td>minimal media solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">NaCl</td>
			<td style="width:216px;">Bio-Lab</td>
			<td style="width:137px;">214010</td>
			<td>LB preperation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Noble agar</td>
			<td style="width:216px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">A5431</td>
			<td>minimal media substrate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">parafilm tape</td>
			<td style="width:216px;">Bemis</td>
			<td style="width:137px;">PM-996</td>
			<td>refered to as tape in text</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Seaplaque GTG Agarose</td>
			<td style="width:216px;">Lonza</td>
			<td style="width:137px;">50111</td>
			<td>minimal media substrate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">thaymine B1</td>
			<td style="width:216px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">T0376&#160;</td>
			<td>minimal media solution</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Yeast Extract</td>
			<td style="width:216px;">BD - Becton, Dickinson and Company&#160;</td>
			<td style="width:137px;">212750</td>
			<td>LB preperation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

continuous measurement of biological noise in escherichia coli using time-lapse microscopy

Protokollen utviklet her tilbyr et verktøy for å muliggjøre datasporing av Escherichia coli divisjon og fluorescerende nivåer over flere timer. Prosessen starter med å screene for kolonier som overlever på minimale medier, forutsatt at bare Escherichia coli som skjuler riktig plasmid, vil kunne trives under de spesifikke forholdene. Siden prosessen med å bygge store genetiske kretser, som krever montering av mange DNA-deler, er utfordrende, fordeles kretskomponenter ofte mellom flere plasmider ved forskjellige kopinumre som krever bruk av flere antibiotika. Mutasjoner i plasmidet kan ødelegge transkripsjon av antibiotikaresistensgenene og gripe inn med ressurshåndtering i cellen som fører til nekrose. Den valgte kolonien er satt på en glassbunn Petri-tallerken, og noen få fokusplan er valgt for mikroskopisporing i både lyse felt og fluorescerende domener. Protokollen opprettholder bildefokuset i mer enn 12 timer under innledende forhold som ikke kan reguleres, noe som skaper noen få vanskeligheter. For eksempel begynner døde celler å samle seg i linsenes fokusfelt etter noen timer med avbildning, noe som fører til at giftstoffer bygger seg opp og signalet blir uskarpt og forfaller. Uttømming av næringsstoffer introduserer nye metabolske prosesser og hindrer ønsket respons av kretsen. Eksperimentets temperatur senker effekten av indusere og antibiotika, noe som ytterligere kan skade signalets pålitelighet. Den minimale mediegelen krymper og tørker, og som et resultat endres det optiske fokuset over tid. Vi utviklet denne metoden for å overvinne disse utfordringene i Escherichia coli, ligner på tidligere arbeider som utvikler analoge metoder for andre mikroorganismer. I tillegg tilbyr denne metoden en algoritme for å kvantifisere den totale stokastiske støyen i uendrete og endrede celler, og finner at resultatene er i samsvar med strømningsanalysatorprediksjoner som vist av en lignende variasjonskoeffisient (CV).

Programvaren analyserer lyse feltdomenebilder som er off-white og svart. Escherichia coli vil se ut som svarte avlange former på en off-white bakgrunn og dynamisk lystetthetsområde bør vise en spike i midten (Figur 1). I fluorescerende bilder kan celler ha en liten glorie, men individuelle celler med avlange former kan fortsatt løses. En mitosehendelse bør først oppdages etter 30 minutter. Mikroskopfokus bør forbli stabilt over tid, og selv om cellene kan bevege seg sakte i l...

Watch this Scientific Journal Video about Continuous Measurement of Biological Noise in Escherichia Coli Using Time-lapse Microscopy at JoVE.com

Continuous Measurement of Biological Noise in Escherichia Coli Using Time-lapse Microscopy

Dette arbeidet presenterer en mikroskopimetode som tillater levende avbildning av en enkelt celle av Escherichia coli for analyse og kvantifisering av stokastisk oppførsel av syntetiske genkretser.

Kontinuerlig måling av biologisk støy i Escherichia Coli ved bruk av mikroskopi for tidsforløp

The protocol developed here offers a tool to enable computer tracking of Escherichia coli division and fluorescent levels over several hours. The process ...

Denne protokollen i urter kontinuerlig måling av genetiske kretser i E.coli og beregning av signalvariabilitet og signal-til-støy-forhold i individuell bakteriell celle for å vurdere kretsytelsen. De viktigste fordelene med denne teknikken er at den lett kan tilpasses forskjellige stammer og laboratorier, krever minimal trening og ikke noe spesialutstyr, og er relativt billig. Støy er en viktig rolle i å bestemme funksjonaliteten til biologiske systemer.For tiden er det interesse for å bygge store genkretser. Disse systemene kan hemmes av støy Sørg for å tørke prøvene godt, for å holde de chill pads på fire grader Celsius så lenge som mulig, og for å kutte og dele delene tålmodig og forsiktig. For å forberede bakteriene til analysen inokulerer en enkelt koloni fra en transfektert E.coli-kultur.For eksempel en krets med en GFP-reporter. I et glassrør som inneholder fem milliliter LB kjøttkraft supplerer det med relevante antibiotika. Vokse cellene ved 37 grader Celsius og 250 omdreininger per minutt i en rystende inkubator i to timer til buljongen er overskyet.På slutten av inkubasjonen, spinn ned en milliliter fortynningsløsning i en to milliliter mini mikro sentrifuge, og overfør 30 mikroliter bakterier og hele volumet av fortynningsløsning til et nytt to milliliterrør. Deretter inkuberer du kulturen i en time med risting før du sådde 40 til 60 mikroliter av denne suspensjonen på M9-kulturplater. For å forberede bakteriene til analysen, inokulere en enkelt koloni fra en transfektert E.Coli-kultur.For eksempel, en krets med en GFP reporter i et glassrør som inneholder fem milliliter LB kjøttkraft supplert med relevante antibiotika. Vokse cellene ved 37 grader Celsius og 250 omdreininger per minutt i en rystende inkubator i to timer til buljongen er overskyet. På slutten av inkubasjonen, spinn ned en milliliter fortynningsløsning i et to milliliter mini mikrosentrifugerør og overfør 30 mikroliter bakterier og hele volumet av fortynningsløsning til et nytt to milliliterrør.Inkuber deretter kulturen i en time med risting. For å forberede mikroskopplater, bland 112,5 milligram lav smeltende agar med 40 milligram agar, og en milliliter 2% casaminosyre i en 25 milliliter Erlenmeyer kolbe. Deretter legger du til 8,92 milliliter minimalt medium over de indre leppene til en 25 milliliter Erlenmeyer-kolbe og mikrobølgeovn den resulterende løsningen i korte, to til tre sekunders brister.Sett deretter vannbadet til 55 grader Celsius. Når løsningen er klar, plasser 25 milliliter Erlenmeyer-kolben i et 60 grader Celsius vannbad og la agarløsningen avkjøles til temperaturen faller til ca. 45 til 50 grader Celsius. Mens agarkjølingen, rengjør laboratoriebenken med 70% etanol og glatt et stykke labtape på den rensede benken.Sett en glassdekselslipp på tapen og sett en ekstra dekselslipp i nærheten. Tilsett avkjølt agarløsning til riktig antibiotika og løsning. Hell 1,5 milliliter nytilberedt geloppløsning på dekselslippet plassert over båndet og legg den andre dekselslipen på gelen, og pass på å unngå bobler.Sett Erlenmeyer tilbake til varmtvannsbadet og dekk til dekselet i 20 minutter. Vend dekselet i en times inkubasjon ved fire grader Celsius. På slutten av inkubasjonen, fjern dekselskliene fra den tørre gelen og kutt en liten pute fra agarose.Under inkubasjonen legger du til seks mikroliterdråper av den tilberedte bakterielle suspensjonen i en 35 millimeter tallerken og lar dråpene tørke i minst 15 til 30 minutter. Plasser deretter puten om gangen forsiktig på en dråpe bakterier og la prøvene stilles inn i 20 minutter ved romtemperatur. For å plassere agarsengen uten å smøre prøven, plasser forsiktig kjøleputen på dråpen med forsiktig tapping.For å avbilde prøvene, fjern kolben fra vannet og la gelløsningen avkjøles til kroppstemperatur. Hell tre millimeter gel på omkretsen av prøveplaten. Når agarose har størknet, forsegle platen med tape og bruk en 25 gauge nål til å stykke flere hull i båndet.Plasser deretter platen opp ned ved fire grader Celsius i minst 30 minutter for å la agarose fullt størkne, samtidig som du forhindrer cellemittose. Innen 24 timer, bruk et fluorescens konfokalt mikroskop for å finne prøven ved laveste forstørrelse og engasjere mikroskopets automatiske fokussystem. Påfør olje på riktig mål og bruk plattformkontrolleren til å flytte platen for å spre oljen forsiktig.Deretter engasjerer du det automatiske fokuset igjen og følger standardforslaget for Z-trinns tverrsnitt for å avbilde prøven. E.coli skal vises som svarte avlange former på en off white bakgrunn. Og det dynamiske spekteret av lysstyrken skal vise en spike i midten.Mitosehendelser kan først oppdages ved fluorescensmikroskopi etter 30 minutter. Selv om enkeltceller kan være vanskelige å oppdage ved lav forstørrelse. Bakterielle cellekulturer utarbeidet ved feil fortynningsforhold kan demonstrere uendret antall celler, og prøver utarbeidet uten plateforsegling kan vise overdreven krymping, noe som resulterer i tap av fokus.Celler kan også rykke inn gelen i søket etter næringsstoffer, noe som resulterer i stabling av bakteriecellene oppå hverandre og kompromittere cellemonolayeren, og forhindrer effektivt celledeteksjon og pålitelig fluorescerende signalmåling. Som antydet av disse dataene, påvirker ikke celletrinnet i divisjonssyklusen støynivået, da forskjellige områdeområder viser den samme trenden. Videre observeres ingen vesentlig endring i signal-til-støy-forholdet mellom GFP og superfold GFP, som illustrert av disse representative dataene.Når du utfører denne prosedyren, må du passe på å bestemme riktig fortynningsforhold for bakteriestammen som brukes til eksperimentet. Sammenligning av signal-til-støy-forholdet mellom hver regulerte kretser med denne baselinjen tillater valg av den beste ytelseskretsen og kan avsløre interessante fenomener

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Continuous Measurement of Biological Noise in Escherichia Coli Using Time-lapse Microscopy

Engineering Biological-Based Vascular Grafts Using a Pulsatile Bioreactor

Much effort has been devoted to develop and advance the methodology to regenerate functional small-diameter arterial bypasses. In the physiological ...

Three-dimensional Optical-resolution Photoacoustic Microscopy

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As ...

Fluorescent Nanoparticles for the Measurement of Ion Concentration in Biological Systems

Tightly regulated ion homeostasis throughout the body is necessary for the prevention of such debilitating states as dehydration.1 In contrast, rapid ion ...

Time-lapse Fluorescence Imaging of Arabidopsis Root Growth with Rapid Manipulation of The Root Environment Using The RootChip

Time-lapse Fluorescence Imaging of Arabidopsis rotvekst med Rapid manipulering av Root miljøet ved hjelp av RootChip

The root functions as the physical anchor of the plant and is the organ responsible for uptake of water and mineral nutrients such as nitrogen, ...

In situ TEM of Biological Assemblies in Liquid

In situ TEM of Biological Assemblies in Liquid

In situ TEM av biologiske forsamlinger i væske

Researchers regularly use Transmission Electron Microscopes (TEMs) to examine biological entities and to assess new materials. Here, we describe an ...

Sample Drift Correction Following 4D Confocal Time-lapse Imaging

Sample Drift Korreksjon Etter 4D Confocal Time-lapse Imaging

The generation of four-dimensional (4D) confocal datasets; consisting of 3D image sequences over time; provides an excellent methodology to capture ...

Surface Potential Measurement of Bacteria Using Kelvin Probe Force Microscopy

Overflaten Potential Måling av bakterier ved hjelp av Kelvin Probe Force Mikros

Surface potential is a commonly overlooked physical characteristic that plays a dominant role in the adhesion of microorganisms to substrate surfaces. ...

Design and Construction of Artificial Extracellular Matrix (aECM) Proteins from Escherichia coli for Skin Tissue Engineering

Design and Construction of Artificial Extracellular Matrix aECM Proteins from Escherichia coli for Skin Tissue Engineering

Design og bygging av kunstige Ekstracellulær Matrix (aECM) Proteiner fra<em&gt; Escherichia coli</em&gt; For Skin Tissue Engineering

Recombinant technology is a versatile platform to create novel artificial proteins with tunable properties. For the last decade, many artificial proteins ...

A Novel Technique for Generating and Observing Chemiluminescence in a Biological Setting

En ny teknikk for generering og Observing Chemiluminescence i en biologisk Setting

Intraoperative imaging techniques have the potential to make surgical interventions safer and more effective; for these reasons, such techniques are ...