Name: continuous measurement of biological noise in escherichia coli using time-lapse microscopy
Uploaded: 2021-04-27T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Continuous Measurement of Biological Noise in Escherichia Coli Using Time-lapse Microscopy at JoVE.com

Мы благодарим г-на Гила Гелберта (факультет электротехники, Technion) за помощь в разработке кода MATLAB. Мы благодарим д-ра Симин Ли (факультет био-медицинской инженерии, Technion) за помощь в проверке этой статьи. Это исследование было частично поддержано Фондом семьи Нойбауэр и Министерством науки Израиля, грант 2027345.

1. Подготовка средств массовой информации и культуры
<ol><li>Подготовка запасов раствор 1000x карбенициллин (50 мг/мл) или соответствующие антибиотики.<ol>
<li>. Вес 0,5 г карбенициллина. Добавьте 10 мл стерильного H2O. Полностью растворите.</li>
		<li>Стерилизовать запас карбенициллина че...

<ol>
	<li>Daniel, R., Rubens, J. R., Sarpeshkar, R., Lu, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+analog+computation+in+living+cells.">Synthetic analog computation in living cells.</a> Nature. 497, 619-623 (2013).</li><li>Yang, X. S. Y., L, A. B., Harwood, C., Jensen, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Imaging Bacterial Molecules, Structures and Cells. , (2016).</li><li>Joyce, G., Robertson, B. D., Williams, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modified+agar+pad+method+for+mycobacterial+live-cell+imaging.">A modified agar pad method for mycobacterial live-cell imaging.</a> Biomedcentral Research Notes. , (2011).</li><li>Cotlet, M., Goodwin, P. M., Waldo, G. S., Werner, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+the+fluorescence+dynamics+of+single+molecules+of+a+green+fluorescent+protein:+One-+versus+two-photon+excitation.">A comparison of the fluorescence dynamics of single molecules of a green fluorescent protein: One- versus two-photon excitation.</a> ChemPhysChem. , (2006).</li><li>Andersen, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+unstable+variants+of+green+fluorescent+protein+for+studies+of+transient+gene+expression+in+bacteria.">New unstable variants of green fluorescent protein for studies of transient gene expression in bacteria.</a> Applied and Environmental Microbiology. 64, 2240-2246 (1998).</li><li>Barger, N., Litovco, P., Li, X., Habib, M., Daniel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+metabolic+computation+in+a+bioluminescence-sensing+system.">Synthetic metabolic computation in a bioluminescence-sensing system.</a> Nucleic Acids Research. , (2019).</li><li>Young, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+single-cell+gene+expression+dynamics+in+bacteria+using+fluorescence+time-lapse+microscopy.">Measuring single-cell gene expression dynamics in bacteria using fluorescence time-lapse microscopy.</a> Nature Protocols. , (2012).</li><li>Swain, P. S., Elowitz, M. B., Siggia, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+and+extrinsic+contributions+to+stochasticity+in+gene+expression.">Intrinsic and extrinsic contributions to stochasticity in gene expression.</a> Proceedings of the National Academy of Science United States. , (2002).</li><li>Elowitz, M. B., Levine, A. J., Siggia, E. D., Swain, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stochastic+gene+expression+in+a+single+cell.">Stochastic gene expression in a single cell.</a> Science. , (2002).</li><li>Baumgart, L., Mather, W., Hasty, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synchronized+DNA+cycling+across+a+bacterial+population.">Synchronized DNA cycling across a bacterial population.</a> Nature Genetics. , (2017).</li><li>Arriaga, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+biological+noise+via+single+cell+analysis.">Determining biological noise via single cell analysis.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. , (2009).</li><li>Nielsen, A. A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+circuit+design+automation.">Genetic circuit design automation.</a> Science. , (2016).</li><li>Ozbudak, E. M., Thattai, M., Kurtser, I., Grossman, A. D., van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+noise+in+the+expression+of+a+single+gene.">Regulation of noise in the expression of a single gene.</a> Nature Genetics. 31, 69-73 (2002).</li><li>Pedraza, J. H., Van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noise+propagations+in+gene+networks.">Noise propagations in gene networks.</a> Science. , (2005).</li><li>Jennifer, A. N. B., Christopher, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+genetic+circuit+design.">Principles of genetic circuit design.</a> Nature Methods. , (2014).</li><li>Aoki, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+universal+biomolecular+integral+feedback+controller+for+robust+perfect+adaptation.">A universal biomolecular integral feedback controller for robust perfect adaptation.</a> Nature. , (2019).</li><li>Hanna, H. A., Danial, L., Kvatinsky, S., Daniel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cytomorphic Electronics with Memristors for Modeling Fundamental Genetic Circuits. 4545, (2020).</li><li>de Jong, I. G., Beilharz, K., Kuipers, O. P., Veening, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+cell+imaging+of+Bacillus+subtilis+and+Streptococcus+pneumoniae+using+automated+time-lapse+microscopy.">Live cell imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using automated time-lapse microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2011).</li><li>Eling, N., Morgan, M. D., Marioni, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+in+measuring+and+understanding+biological+noise.">Challenges in measuring and understanding biological noise.</a> Nature Reviews Genetics. , (2019).</li><li>Thattai, M., Van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Attenuation+of+noise+in+ultrasensitive+signaling+cascades.">Attenuation of noise in ultrasensitive signaling cascades.</a> Biophysical Journal. , (2002).</li><li>Thattai, M., Van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+noise+in+gene+regulatory+networks.">Intrinsic noise in gene regulatory networks.</a> Proceedings of the National Academy of Science United States. , (2001).</li><li>Rosenfeld, N., Young, J. W., Alon, U., Swain, P. S., Elowitz, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+regulation+at+the+single-cell+level.">Gene regulation at the single-cell level.</a> Science. , (2005).</li><li>Van Der Ziel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Noise in Measurements. , (1976).</li><li>Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+cloning:+A+laboratory+manual.+2nd+Edition.">Molecular cloning: A laboratory manual. 2nd Edition.</a> Cold Spring Harbor Laboratory Press. , (1989).</li><li>Carpenter, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CellProfiler:+Image+analysis+software+for+identifying+and+quantifying+cell+phenotypes.">CellProfiler: Image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes.</a> Genome Biology. , (2006).</li><li>Paintdakhi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oufti:+An+integrated+software+package+for+high-accuracy,+high-throughput+quantitative+microscopy+analysis.">Oufti: An integrated software package for high-accuracy, high-throughput quantitative microscopy analysis.</a> Molecular Microbiology. , (2016).</li><li>Ducret, A., Quardokus, E. M., Brun, Y. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicrobeJ,+a+tool+for+high+throughput+bacterial+cell+detection+and+quantitative+analysis.">MicrobeJ, a tool for high throughput bacterial cell detection and quantitative analysis.</a> Nature Microbiology. , (2016).</li><li>Stylianidou, S., Brennan, C., Molecular, S. B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> SuperSegger: robust image segmentation, analysis and lineage tracking of bacterial cells - Stylianidou - 2016 - Molecular Microbiology. , (2016).</li><li>Balomenos, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image+analysis+driven+single-cell+analytics+for+systems+microbiology.">Image analysis driven single-cell analytics for systems microbiology.</a> Biomedcentral System Biology. , (2017).</li><li>Smit, J. H., Li, Y., Warszawik, E. M., Herrmann, A., Cordes, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colicoords:+A+Python+package+for+the+analysis+of+bacterial+fluorescence+microscopy+data.">Colicoords: A Python package for the analysis of bacterial fluorescence microscopy data.</a> PLoS One. , (2019).</li><li>Guido, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bottom-up+approach+to+gene+regulation.">A bottom-up approach to gene regulation.</a> Nature. , (2006).</li><li>Beal, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signal-to-noise+ratio+measures+efficacy+of+biological+computing+devices+and+circuits.">Signal-to-noise ratio measures efficacy of biological computing devices and circuits.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. , (2015).</li><li>Marr, D., Hildreth, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Theory+of+edge+detection.">Theory of edge detection.</a> Proceedings of the Royal Society - Biology Science. 207, 187-217 (1980).</li><li>Otsu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Threshold+selection+method+from+gray-level+histograms.">Threshold selection method from gray-level histograms.</a> IEEE Transactions Systems Man Cybernetics. , (1979).</li><li>Soille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Morphological Image Analysis: Principles and Applications, Second edition. , (2000).</li><li>Bradley, D., Roth, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptive+Thresholding+using+the+Integral+Image.">Adaptive Thresholding using the Integral Image.</a> Journal of Graphics Tools. , (2007).</li><li>Meyer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topographic+distance+and+watershed+lines.">Topographic distance and watershed lines.</a> Signal Processing. , (1994).</li><li>Maurer, C. R., Qi, R., Raghavan, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+linear+time+algorithm+for+computing+exact+Euclidean+distance+transforms+of+binary+images+in+arbitrary+dimensions.">A linear time algorithm for computing exact Euclidean distance transforms of binary images in arbitrary dimensions.</a> IEEE Transactions on Pattern Analysis and Machine. , (2003).</li><li>Millo, R., Phillips, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+is+the+maturation+time+for+fluorescent+proteins.">What is the maturation time for fluorescent proteins.</a> Cell Biology by Numbers. , (2015).</li></ol>

В этой работе мы разработали протокол, который позволяет компьютерной трассировки Escherichia coli живых клеток, после деления и флуоресцентных уровней в течение нескольких часов. Этот протокол позволяет количественно оценить стохастичную динамику генетических схем в кишечной пал...

Синтетическая биология является междисциплинарной области, которая возникла в последнее десятилетие и направлена на перевод инженерных принциповпроектирования в рациональном биологическом дизайне 1,2,3, в попытке достичь мульти-сигнал интеграции и обработки в живыхклетках для понимания фундаментальных наук 4,5 ,диагностических,терапевтических и биотехнологических приложений 6,7,8,9,10. Наша способность количественно ввода-выходной реакции синтетических генных цепей была революционизирована в результате недавних достижений в одноклеточной технологии, включая анализатор потока и живую визуализацию клеток с помощью автоматизированной микроскопиизамедленного действия 11. Анализатор потока часто используется для измерения реакции этих цепей вустойчивом состоянии 1,12, и перевернутая микроскопия используется для измерения динамической реакции синтетических цепей генов на уровне одной клетки3. Например, одна из ранних работ в синтетической биологии включала строительство генетических осцилляторных сетей в живых клетках с использованием циклов отрицательной обратной связи сзадержкой 3. Позже, генетические схемы осциллятора были применены, чтобы понять метаболический контроль в динамической среде живыхклеток 4. Автоматизированная микроскопия замедленного действия является одним из методов характеристики таких схем. Мы предполагаем, что клетки-хозяина, Escherichia coli, синхронизируют при формировании микро колоний, позволяя измерять сигнал и расчет шума без отслеживания точных отношений матери и дочери.
Шум является фундаментальным, неотъемлемым аспектом биологических систем, часто вытекающих из нескольких источников. Рассмотрим, например, биохимические реакции, связанные с сигналами, которые возникают от транспортировки дискретных случайных носителей, таких какдиффузия белков 13. Эти сигналы распространяются со случайными колебаниями14. Другими источниками шума являются наличие ресурсов, деление клеток и изменения в условиях окружающей среды, таких как температура, влажность и давление. Биологические сигналы, которые распространяются в синтетических генных схемах, часто имеют очень низкий коэффициент сигнала к шуму (SNR), что нарушает производительность таких схем. Таким образом, генетическая схема дизайна остается одним из самых сложных аспектов геннойинженерии 15. Например, в отличие от большинства подходов, которые вычисляют только среднее выражение гена (измеряется по всей популяции клеток), разница измеренного сигнала считается для того, чтобы инженер предсказуемого поведения через синтетическиесети генов 12. Таким образом, уровни изменчивости или шума в экспрессии белка играют доминирующую роль в проектировании и производительности аналоговых и цифровыхгенных схем 1,16,17.
Многие подходы были разработаны для количественной оценки изменчивости клеток к клетке, в том числе в Escherichia coli3,7,18. Эти методы часто используются для изучения активации генов и метаболических путей, однако с меньшим акцентом на изучение стохастичной динамики шума, как измерение и разобщание конкретных источников шума, особенно для генетических схем в живых клетках, где это фундаментальная проблема19,20,21. Несколько факторов, оба унаследованных к самой цепи (внутренне) и выведенных от клеток хозяина (внешних), могут нарушить непрерывную работу генетических цепей. В этой статье мы разработали протокол, который направлен на количественную оценку общего шума в клетках кишечной палочки, включая внутренние и внешниеисточники шума 6,22. Путем количественной оценки общего шума, а затем оценки SNR23, дизайн генных схем может быть улучшена. Этот метод может быть изменен для измерения независимых источников шума отдельно, путем мониторинга нескольких флуоресцентныхбелков 6,20. Для протокола, описанного здесь, мы держим условия окружающей среды хорошо контролируемыми и постоянно измеряем активность клеток без влияния внешних факторов. Мы измеряем сигнал от флуоресцентных белков в одиночных клетках с течением времени и одновременно изымаем их под подложку агарозы. Полученные изображения анализируются с помощью пользовательского MATLAB лаборатории.
В идеале, непрерывное измерение активности флуоресцентных белков в клетке в режиме реального времени будет производить точные данные через рост и деление клеток. Однако получение таких данных является сложной задачей. Это связано с деградацией флуоресцентных белков, известных какфотоотбеление 7, когда они подвергаются воздействию радиации в процессе возбуждения. Кроме того, клетки кишечной палочки Escherichia также чувствительны для возбуждения, что может привести к фототоксичности7. Оба вопроса ограничивают количество фоторамок, которые могут быть приобретены, и время между приобретениями. Субстрат и средние типы (например, лизегенный бульон), который используется для выращивания клеток во время визуализации, также играют решающую роль. Мы настоятельно рекомендуем использовать минимальную среду, которая сводит к минимуму нефлуоресцентный фон и расширяет время деления клеток.
Кроме того, образец должен быть подготовлен с учетом следующих требований (1) Низкий уровень деления клеток позволяет менее частые воздействия для тщательного изображения цикла деления и снижения вероятности фототоксичности и фотоотчивания. Мы установили время приобретения примерно на половину прогнозируемого времени митоза (2) Низкая плотность клеток в начале эксперимента позволяет лучше единообразие и отслеживаемость деления. Плотность клеток зависит от коэффициента разбавления клеток кишечной палочки, что является важным параметром успеха этого протокола и должно быть определено для каждой лаборатории. Для того, чтобы установить соотношение, каждый новый штамм кишечной палочки или используемых средств массовой информации должны быть оснащены графиками темповроста (Дополнительный рисунок 1). Соответствующее соотношение было достигнуто, если клетки могут расти без дополнительной тряски после короткой инкубации от первоначальнойплотности около OD 600nm и 0,1. Клетки на этом этапе будут делиться в зависимости от температуры окружающей среды только (3) Ограничение движения клеток: движение клеток сильно зависит от упрямости субстрата (агарозной площадки). Твердость субстрата зависит от количества общей агарозы и времени затвердевания геля. Гели не могут быть оставлены для затвердеть на ночь при комнатной температуре, так как кишечная палочка Escherichia будет проходить митоз. Другие факторы, влияющие на стабильность субстрата, включают количество воды в образце и влажность. Дополнительные вопросы подробно обсуждаются в результатах представительов. Этот протокол содержит множество деталей и постепенно переходит от одного шага к другому. Протокол обеспечивает долгосрочную стабильность для экспериментов с изображениями и обеспечивает базовый инструмент обработки изображений.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:748px;" width="747">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">35mm glass dish</td>
			<td style="width:216px;">mattek</td>
			<td style="width:137px;">P35G-0.170-14-C</td>
			<td style="width:172px;">thickness corresponding with microscope lense.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Agarose&#160;</td>
			<td style="width:216px;">Lonza</td>
			<td style="width:137px;">5004</td>
			<td>LB preperation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">AHL&#160;</td>
			<td style="width:216px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">K3007</td>
			<td>inducer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Bacto tryptone&#160;</td>
			<td style="width:216px;">BD - Becton, Dickinson and Company&#160;</td>
			<td style="width:137px;">211705</td>
			<td>LB preperation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Carb</td>
			<td style="width:216px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:137px;">10177-012</td>
			<td>antibiotic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Carb</td>
			<td style="width:216px;">Formedium</td>
			<td style="width:137px;">CAR0025</td>
			<td>antibiotic</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Casamino acids&#160;</td>
			<td style="width:216px;">BD - Becton, Dickinson and Company&#160;</td>
			<td style="width:137px;">223050</td>
			<td>minimal media solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">eclipse Ti</td>
			<td style="width:216px;">nikon</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td>inverted microscope</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Glucose</td>
			<td style="width:216px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">G5767</td>
			<td>minimal media solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Glyserol</td>
			<td style="width:216px;">Bio-Lab</td>
			<td style="width:137px;">000712050100</td>
			<td>minimal media substrate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Immersol 518F</td>
			<td style="width:216px;">zeiss</td>
			<td style="width:137px;">4449600000000</td>
			<td>immersion oil</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">M9 salt solution&#160;</td>
			<td style="width:216px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">M6030</td>
			<td>minimal media solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">NaCl</td>
			<td style="width:216px;">Bio-Lab</td>
			<td style="width:137px;">214010</td>
			<td>LB preperation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Noble agar</td>
			<td style="width:216px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">A5431</td>
			<td>minimal media substrate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">parafilm tape</td>
			<td style="width:216px;">Bemis</td>
			<td style="width:137px;">PM-996</td>
			<td>refered to as tape in text</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Seaplaque GTG Agarose</td>
			<td style="width:216px;">Lonza</td>
			<td style="width:137px;">50111</td>
			<td>minimal media substrate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">thaymine B1</td>
			<td style="width:216px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">T0376&#160;</td>
			<td>minimal media solution</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Yeast Extract</td>
			<td style="width:216px;">BD - Becton, Dickinson and Company&#160;</td>
			<td style="width:137px;">212750</td>
			<td>LB preperation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

continuous measurement of biological noise in escherichia coli using time-lapse microscopy

Разработанный здесь протокол предлагает инструмент, позволяющий компьютерному слежению за делением кишечной палочки и флуоресцентными уровнями в течение нескольких часов. Процесс начинается с скрининга для колоний, которые выживают на минимальных средств массовой информации, предполагая, что только Escherichia coli укрывательство правильной плазмиды сможет процветать в конкретных условиях. Поскольку процесс построения больших генетических схем, требующих сборки многих частей ДНК, является сложной задачей, компоненты цепи часто распределяются между несколькими плазмидами на разных числах копий, требующих использования нескольких антибиотиков. Мутации в плазмиде могут разрушить транскрипцию генов устойчивости к антибиотикам и вставить с ресурсами управления в клетке, что приводит к некрозу. Выбранная колония установлена на стеклянном дне чашки Петри и несколько плоскостей фокусировки выбраны для отслеживания микроскопии как в ярком поле, так и в флуоресцентных областях. Протокол сохраняет фокус изображения в течение более 12 часов при первоначальных условиях, которые не могут регулироваться, создавая некоторые трудности. Например, мертвые клетки начинают накапливаться в поле фокусировки линз после нескольких часов визуализации, что приводит к накоплению токсинов и сигналу к размытию и распаду. Истощение питательных веществ вводит новые метаболические процессы и препятствует желаемой реакции цепи. Температура эксперимента снижает эффективность индукторов и антибиотиков, что может еще больше повредить надежность сигнала. Минимальный медиа гель сжимается и высыхает, и в результате оптический фокус меняется с течением времени. Мы разработали этот метод для преодоления этих проблем в Escherichia coli, по аналогии с предыдущими работами разработки аналогичных методов для других микроорганизмов. Кроме того, этот метод предлагает алгоритм количественной оценки общего стохастичного шума в неизмененные и измененные клетки, вывод о том, что результаты согласуются с прогнозами анализатора потока, как показано на аналогичном коэффициенте изменения (CV).

Программное обеспечение анализирует яркие изображения домена поля, которые являются небелые и черные. Escherichia coli будет выглядеть как черные продолговатые формы на белом фоне и динамический диапазон яркости должны показать всплеск в его центре (Рисунок 1). В флуоресц...

Watch this Scientific Journal Video about Continuous Measurement of Biological Noise in Escherichia Coli Using Time-lapse Microscopy at JoVE.com

Continuous Measurement of Biological Noise in Escherichia Coli Using Time-lapse Microscopy

Эта работа представляет собой метод микроскопии, который позволяет живую визуализацию одной клетки кишечной палочки для анализа и количественной оценки стохастичного поведения синтетических цепей генов.

Непрерывное измерение биологического шума в Escherichia Coli с использованием замедленной микроскопии

The protocol developed here offers a tool to enable computer tracking of Escherichia coli division and fluorescent levels over several hours. The process ...

Этот протокол в травах непрерывное измерение генетических цепей в E.coli и расчет изменчивости сигнала и соотношения сигнала к шуму в отдельных бактериальных клетках для оценки производительности цепи. Основными преимуществами этой техники являются то, что она легко адаптируется к различным штаммам и лабораториям, требует минимальной подготовки и не имеет специального оборудования, и является относительно недорогой. Шум играет важную роль в определении функциональности биологических систем.В настоящее время существует интерес к созданию крупномасштабных генных цепей. Эти системы могут быть ингибированы шумом Не забудьте высушить образцы хорошо, чтобы сохранить, что холод колодки на четыре градуса по Цельсию как можно дольше, и сократить и разделить части терпеливо и осторожно. Для подготовки бактерий к анализу прививают одну колонию от трансфицированной культуры E.coli.Например, схема с репортером GFP. В стеклянной трубке, содержащей пять миллилитров бульона LB, его дополняют соответствующими антибиотиками. Выращиваем клетки при 37 градусах Цельсия и 250 оборотов в минуту в трясущимся инкубаторе в течение двух часов, пока бульон не будет облачным.В конце инкубации, спина вниз один миллилитр раствора разбавления в двух миллилитров мини микро центрифуги, и передачи 30 микролитров бактерий и весь объем раствора разбавления в новую двухми миллилитровую трубку. Затем инкубировать культуру в течение одного часа с встряхивания до посева от 40 до 60 микролитров этой подвески на M9 культуры пластин. Чтобы подготовить бактерии к анализу, привить одну колонию от трансфицированной культуры E.Coli.Например, схема с репортером GFP в стеклянной трубке, содержащей пять миллилитров бульона LB, дополненная соответствующими антибиотиками. Выращиваем клетки при 37 градусах Цельсия и 250 оборотов в минуту в трясущимся инкубаторе в течение двух часов, пока бульон не будет облачным. В конце инкубации, спина вниз один миллилитр раствора разбавления в двух миллилитров мини микро центрифуги трубки и передачи 30 микролитров бактерий и весь объем раствора разбавления в новую двухми миллилитровую трубку.Затем инкубировать культуру в течение одного часа с тряской. Для подготовки микроскопа пластины, смешать 112,5 миллиграммов низкоплавильного агара с 40 миллиграммов агара, и один миллилитр 2%casamino кислоты в 25 миллилитров Erlenmeyer колбу. Далее добавьте 8,92 миллилитров минимальной среды над внутренними губами 25 миллилитров колбы Erlenmeyer и микроволновой печи в результате решения в короткие, два-три секунды очередей.Затем установите водяную баню до 55 градусов по Цельсию. Когда раствор будет ясным, поместите 25 миллилитровую колбу Erlenmeyer в водяную баню 60 градусов по Цельсию и дайте агару остыть до тех пор, пока его температура не упадет примерно до 45-50 градусов по Цельсию. В то время как агар охлаждения, очистить лаборатории скамейке с 70% этанола и гладкой кусок лабораторной ленты на очищенной скамейке.Поместите одну стеклянную крышку скольжения на ленту и поместите вторую крышку скольжения рядом. Добавьте охлажденный агарный раствор к соответствующим антибиотикам и раствору. Налейте 1,5 миллилитров свежеприготовленного для геля раствора на крышку скольжения размещены над лентой и место второй крышкой скольжения на гель, заботясь, чтобы избежать пузырьков.Верните Эрленмейера в ванну с горячей водой и накройте крышку квитанциями на 20 минут. Переверните крышку скользит в течение одного часа инкубации при четырех градусах по Цельсию. В конце инкубации снимите крышку со сухого геля и вырежьте небольшую площадку из агарозы.Во время инкубации добавьте шесть капель микролитров подготовленной бактериальной суспензии в 35-миллиметровую тарелку и дайте каплям высохнуть не менее 15-30 минут. Затем аккуратно поместите площадку за один раз на одну каплю бактерий и позвольте образцам установить в течение 20 минут при комнатной температуре. Чтобы поместить агар кровать без размазывания образца, тщательно располагайте прохладную площадку на капельку с нежным постукиванием.Чтобы изобразить образцы, удалите колбу из воды и дайте гель-раствору остыть до температуры тела. Налейте три миллиметра геля на периметр образца пластины. Когда агароза затвердевла, запечатать пластину с лентой и использовать 25 калибровочных иглы кусок несколько отверстий в ленту.Затем поместите пластину вверх дном при четырех градусах по Цельсию, по крайней мере 30 минут, чтобы агароза полностью затвердеть, предотвращая при этом митоз клеток. В течение 24 часов используйте флуоресцентный конфокальный микроскоп, чтобы найти образец при самом низком увеличении и включить автоматическую фокусную систему микроскопа. Нанесите масло на соответствующую цель и используйте контроллер платформы для перемещения пластины, чтобы тщательно распределить масло.Затем снова ввешите автоматический фокус и следуйте предложению по умолчанию для поперечных сечений шага для изображения образца. E.coli должен выглядеть как черные продолговатые формы на белом фоне. И динамический диапазон яркости должен показать всплеск в его центре.Митозные события могут быть впервые обнаружены с помощью микроскопии флуоресценции через 30 минут. Хотя отдельные клетки может быть трудно обнаружить при низком увеличении. Бактериальные клеточные культуры, подготовленные при неправильном соотношении разбавления, могут демонстрировать неизменное количество клеток, а образцы, подготовленные без уплотнения пластин, могут проявлять чрезмерную усадку, что приводит к потере фокуса.Клетки могут также indent гель в их поисках питательных веществ, в результате чего укладка бактериальных клеток друг на друга и ущерба для монослой клетки, эффективно предотвращая обнаружение клеток и надежное измерение флуоресцентного сигнала. Как показывают эти данные, этап деления ячейки не влияет на уровень шума, так как различные диапазоны области демонстрируют одинаковую тенденцию. Кроме того, никаких существенных изменений в соотношении сигнала к шуму между GFP и сверхкратным GFP не наблюдается, о чем свидетельствуют эти репрезентативные данные.При выполнении этой процедуры, заботиться, чтобы определить правильное соотношение разбавления для бактериального штамма, используемого для эксперимента. Сравнение соотношения сигнала к шуму каждой регулируемой схемы с этой базовой линией позволяет получить лучшую схему производительности и может выявить интересные явления

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Continuous Measurement of Biological Noise in Escherichia Coli Using Time-lapse Microscopy

Engineering Biological-Based Vascular Grafts Using a Pulsatile Bioreactor

Инженерно-биологической основе сосудистых трансплантатов использовании пульсирующего биореактора

Much effort has been devoted to develop and advance the methodology to regenerate functional small-diameter arterial bypasses. In the physiological ...

Three-dimensional Optical-resolution Photoacoustic Microscopy

Трехмерная оптическая разрешением Фотоакустическая микроскопии

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As ...

Fluorescent Nanoparticles for the Measurement of Ion Concentration in Biological Systems

Флуоресцентные наночастицы для измерения концентрации ионов в биологических системах

Tightly regulated ion homeostasis throughout the body is necessary for the prevention of such debilitating states as dehydration.1 In contrast, rapid ion ...

Time-lapse Fluorescence Imaging of Arabidopsis Root Growth with Rapid Manipulation of The Root Environment Using The RootChip

Замедленной флуоресценции от роста корней арабидопсиса с быстрой манипуляции Корень окружающей среды Использование RootChip

The root functions as the physical anchor of the plant and is the organ responsible for uptake of water and mineral nutrients such as nitrogen, ...

In situ TEM of Biological Assemblies in Liquid

In situ TEM of Biological Assemblies in Liquid

На месте TEM биологических ассамблей в жидкости

Researchers regularly use Transmission Electron Microscopes (TEMs) to examine biological entities and to assess new materials. Here, we describe an ...

Sample Drift Correction Following 4D Confocal Time-lapse Imaging

Образец коррекция дрейфа После 4D конфокальной Покадровый Визуализация

The generation of four-dimensional (4D) confocal datasets; consisting of 3D image sequences over time; provides an excellent methodology to capture ...

Surface Potential Measurement of Bacteria Using Kelvin Probe Force Microscopy

Поверхностный потенциал Измерение бактерий с помощью зонда Кельвина силовой микроскопии

Surface potential is a commonly overlooked physical characteristic that plays a dominant role in the adhesion of microorganisms to substrate surfaces. ...

Design and Construction of Artificial Extracellular Matrix (aECM) Proteins from Escherichia coli for Skin Tissue Engineering

Design and Construction of Artificial Extracellular Matrix aECM Proteins from Escherichia coli for Skin Tissue Engineering

Проектирование и строительство искусственного внеклеточного матрикса (aECM) Белки<em&gt; Кишечная палочка</em&gt; Для кожи тканевой инженерии

Recombinant technology is a versatile platform to create novel artificial proteins with tunable properties. For the last decade, many artificial proteins ...

A Novel Technique for Generating and Observing Chemiluminescence in a Biological Setting

Новый метод для генерации и наблюдения хемилюминесценции в биологическом Окружение

Intraoperative imaging techniques have the potential to make surgical interventions safer and more effective; for these reasons, such techniques are ...