Name: continuous measurement of biological noise in escherichia coli using time-lapse microscopy
Uploaded: 2021-04-27T12:30:00
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Agradecemos al Sr. Gil Gelbert (Facultad de Ingeniería Eléctrica, Technion) por ayudar con el código MATLAB. Agradecemos al Dr. Ximing Li (Facultad de Ingeniería Bio-médica, Technion) por ayudar con la prueba de este artículo. Esta investigación fue parcialmente apoyada por la Fundación de la Familia Neubauer y el Ministerio de Ciencia de Israel, subvención 2027345.

1. Preparación de los medios de comunicación y la cultura
<ol><li>Preparar solución de stock de 1.000x carbenicilina (50 mg/ml) o antibiótico relevante.<ol>
<li>. Pesar 0,5 g de carbenicilina. Añadir 10 ml de estéril H2O. Disolver por completo.</li>
		<li>Esterilizar el stock de carbenicilina a través de un filtro de jeringa de 0,22 μm. Aliquot la solución antibiótica y almacenar a -20 °C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Para preparar placas de caldo de lisógena (LB), mezcle 5 g de tripto...

<ol>
	<li>Daniel, R., Rubens, J. R., Sarpeshkar, R., Lu, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+analog+computation+in+living+cells.">Synthetic analog computation in living cells.</a> Nature. 497, 619-623 (2013).</li><li>Yang, X. S. Y., L, A. B., Harwood, C., Jensen, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Imaging Bacterial Molecules, Structures and Cells. , (2016).</li><li>Joyce, G., Robertson, B. D., Williams, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modified+agar+pad+method+for+mycobacterial+live-cell+imaging.">A modified agar pad method for mycobacterial live-cell imaging.</a> Biomedcentral Research Notes. , (2011).</li><li>Cotlet, M., Goodwin, P. M., Waldo, G. S., Werner, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+the+fluorescence+dynamics+of+single+molecules+of+a+green+fluorescent+protein:+One-+versus+two-photon+excitation.">A comparison of the fluorescence dynamics of single molecules of a green fluorescent protein: One- versus two-photon excitation.</a> ChemPhysChem. , (2006).</li><li>Andersen, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+unstable+variants+of+green+fluorescent+protein+for+studies+of+transient+gene+expression+in+bacteria.">New unstable variants of green fluorescent protein for studies of transient gene expression in bacteria.</a> Applied and Environmental Microbiology. 64, 2240-2246 (1998).</li><li>Barger, N., Litovco, P., Li, X., Habib, M., Daniel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+metabolic+computation+in+a+bioluminescence-sensing+system.">Synthetic metabolic computation in a bioluminescence-sensing system.</a> Nucleic Acids Research. , (2019).</li><li>Young, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+single-cell+gene+expression+dynamics+in+bacteria+using+fluorescence+time-lapse+microscopy.">Measuring single-cell gene expression dynamics in bacteria using fluorescence time-lapse microscopy.</a> Nature Protocols. , (2012).</li><li>Swain, P. S., Elowitz, M. B., Siggia, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+and+extrinsic+contributions+to+stochasticity+in+gene+expression.">Intrinsic and extrinsic contributions to stochasticity in gene expression.</a> Proceedings of the National Academy of Science United States. , (2002).</li><li>Elowitz, M. B., Levine, A. J., Siggia, E. D., Swain, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stochastic+gene+expression+in+a+single+cell.">Stochastic gene expression in a single cell.</a> Science. , (2002).</li><li>Baumgart, L., Mather, W., Hasty, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synchronized+DNA+cycling+across+a+bacterial+population.">Synchronized DNA cycling across a bacterial population.</a> Nature Genetics. , (2017).</li><li>Arriaga, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+biological+noise+via+single+cell+analysis.">Determining biological noise via single cell analysis.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. , (2009).</li><li>Nielsen, A. A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+circuit+design+automation.">Genetic circuit design automation.</a> Science. , (2016).</li><li>Ozbudak, E. M., Thattai, M., Kurtser, I., Grossman, A. D., van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+noise+in+the+expression+of+a+single+gene.">Regulation of noise in the expression of a single gene.</a> Nature Genetics. 31, 69-73 (2002).</li><li>Pedraza, J. H., Van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noise+propagations+in+gene+networks.">Noise propagations in gene networks.</a> Science. , (2005).</li><li>Jennifer, A. N. B., Christopher, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+genetic+circuit+design.">Principles of genetic circuit design.</a> Nature Methods. , (2014).</li><li>Aoki, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+universal+biomolecular+integral+feedback+controller+for+robust+perfect+adaptation.">A universal biomolecular integral feedback controller for robust perfect adaptation.</a> Nature. , (2019).</li><li>Hanna, H. A., Danial, L., Kvatinsky, S., Daniel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cytomorphic Electronics with Memristors for Modeling Fundamental Genetic Circuits. 4545, (2020).</li><li>de Jong, I. G., Beilharz, K., Kuipers, O. P., Veening, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+cell+imaging+of+Bacillus+subtilis+and+Streptococcus+pneumoniae+using+automated+time-lapse+microscopy.">Live cell imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using automated time-lapse microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2011).</li><li>Eling, N., Morgan, M. D., Marioni, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+in+measuring+and+understanding+biological+noise.">Challenges in measuring and understanding biological noise.</a> Nature Reviews Genetics. , (2019).</li><li>Thattai, M., Van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Attenuation+of+noise+in+ultrasensitive+signaling+cascades.">Attenuation of noise in ultrasensitive signaling cascades.</a> Biophysical Journal. , (2002).</li><li>Thattai, M., Van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+noise+in+gene+regulatory+networks.">Intrinsic noise in gene regulatory networks.</a> Proceedings of the National Academy of Science United States. , (2001).</li><li>Rosenfeld, N., Young, J. W., Alon, U., Swain, P. S., Elowitz, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+regulation+at+the+single-cell+level.">Gene regulation at the single-cell level.</a> Science. , (2005).</li><li>Van Der Ziel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Noise in Measurements. , (1976).</li><li>Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+cloning:+A+laboratory+manual.+2nd+Edition.">Molecular cloning: A laboratory manual. 2nd Edition.</a> Cold Spring Harbor Laboratory Press. , (1989).</li><li>Carpenter, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CellProfiler:+Image+analysis+software+for+identifying+and+quantifying+cell+phenotypes.">CellProfiler: Image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes.</a> Genome Biology. , (2006).</li><li>Paintdakhi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oufti:+An+integrated+software+package+for+high-accuracy,+high-throughput+quantitative+microscopy+analysis.">Oufti: An integrated software package for high-accuracy, high-throughput quantitative microscopy analysis.</a> Molecular Microbiology. , (2016).</li><li>Ducret, A., Quardokus, E. M., Brun, Y. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicrobeJ,+a+tool+for+high+throughput+bacterial+cell+detection+and+quantitative+analysis.">MicrobeJ, a tool for high throughput bacterial cell detection and quantitative analysis.</a> Nature Microbiology. , (2016).</li><li>Stylianidou, S., Brennan, C., Molecular, S. B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> SuperSegger: robust image segmentation, analysis and lineage tracking of bacterial cells - Stylianidou - 2016 - Molecular Microbiology. , (2016).</li><li>Balomenos, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image+analysis+driven+single-cell+analytics+for+systems+microbiology.">Image analysis driven single-cell analytics for systems microbiology.</a> Biomedcentral System Biology. , (2017).</li><li>Smit, J. H., Li, Y., Warszawik, E. M., Herrmann, A., Cordes, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colicoords:+A+Python+package+for+the+analysis+of+bacterial+fluorescence+microscopy+data.">Colicoords: A Python package for the analysis of bacterial fluorescence microscopy data.</a> PLoS One. , (2019).</li><li>Guido, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bottom-up+approach+to+gene+regulation.">A bottom-up approach to gene regulation.</a> Nature. , (2006).</li><li>Beal, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signal-to-noise+ratio+measures+efficacy+of+biological+computing+devices+and+circuits.">Signal-to-noise ratio measures efficacy of biological computing devices and circuits.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. , (2015).</li><li>Marr, D., Hildreth, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Theory+of+edge+detection.">Theory of edge detection.</a> Proceedings of the Royal Society - Biology Science. 207, 187-217 (1980).</li><li>Otsu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Threshold+selection+method+from+gray-level+histograms.">Threshold selection method from gray-level histograms.</a> IEEE Transactions Systems Man Cybernetics. , (1979).</li><li>Soille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Morphological Image Analysis: Principles and Applications, Second edition. , (2000).</li><li>Bradley, D., Roth, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptive+Thresholding+using+the+Integral+Image.">Adaptive Thresholding using the Integral Image.</a> Journal of Graphics Tools. , (2007).</li><li>Meyer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topographic+distance+and+watershed+lines.">Topographic distance and watershed lines.</a> Signal Processing. , (1994).</li><li>Maurer, C. R., Qi, R., Raghavan, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+linear+time+algorithm+for+computing+exact+Euclidean+distance+transforms+of+binary+images+in+arbitrary+dimensions.">A linear time algorithm for computing exact Euclidean distance transforms of binary images in arbitrary dimensions.</a> IEEE Transactions on Pattern Analysis and Machine. , (2003).</li><li>Millo, R., Phillips, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+is+the+maturation+time+for+fluorescent+proteins.">What is the maturation time for fluorescent proteins.</a> Cell Biology by Numbers. , (2015).</li></ol>

En este trabajo, desarrollamos un protocolo que permite el rastreo por ordenador de células vivas de Escherichia coli, siguiendo niveles de división y fluorescentes durante un período de horas. Este protocolo nos permite cuantificar la dinámica estocástica de los circuitos genéticos en Escherichia coli midiendo el CV y el SNR en tiempo real. En este protocolo, comparamos los comportamientos estocásticos de dos circuitos diferentes como se muestra en la Figura 10. Se ha demostrado...

La biología sintética es un campo multidisciplinar que ha surgido en la última década y tiene como objetivo traducir los principios de diseño de ingeniería en diseño biológico racional1,2,3,en un esfuerzo por lograr la integración y procesamiento multi-señal en células vivas para entender la ciencia básica4,5,aplicaciones diagnósticas, terapéuticas y biotecnológicas6,7,8,9,10. Nuestra capacidad para cuantificar la respuesta de entrada y salida de los circuitos genéticos sintéticos se ha visto revolucionada por los recientes avances en la tecnología unicelular, incluido el analizador de flujo y las imágenes de células vivas mediante microscopía automatizada de lapso de tiempo11. A menudo se utiliza un analizador de flujo para medir la respuesta de estos circuitos en el estado estacionaria1,12,y la microscopía invertida se utiliza para medir la respuesta dinámica de los circuitos genéticos sintéticos a nivel de una sola célula3. Por ejemplo, uno de los primeros trabajos en biología sintética implicó la construcción de redes de osciladores genéticos en células vivas utilizando bucles de retroalimentación negativos con un retrasode 3. Más tarde, los circuitos osciladores genéticos se aplicaron para entender el control metabólico en el entorno dinámico de las células vivas4. La microscopía automatizada de lapso de tiempo es un método para caracterizar estos circuitos. Suponemos que las células huésped, Escherichia coli,se sincronizan al formar micro colonias, permitiendo la medición de la señal y el cálculo del ruido sin rastrear las relaciones exactas madre-hija.
El ruido es un aspecto fundamental e inherente de los sistemas biológicos que a menudo surgen de múltiples fuentes. Consideremos, por ejemplo, las reacciones bioquímicas que implican señales que se originan en el transporte de portadores aleatorios discretos, como la difusión de proteínas13. Estas señales se propagan con fluctuaciones aleatorias14. Otras fuentes de ruido son la disponibilidad de recursos, la división celular y las variaciones en condiciones ambientales como la temperatura, la humedad y la presión. Las señales biológicas que se propagan en circuitos genéticos sintéticos a menudo tienen una relación señal-ruido (SNR) muy baja, lo que perturba el rendimiento de dichos circuitos. Por lo tanto, el diseño de circuitos genéticos sigue siendo uno de los aspectos más desafiantes de la ingeniería genética15. Por ejemplo, a diferencia de la mayoría de los enfoques que calculan sólo la expresión génica media (medida sobre toda la población celular), la varianza de la señal medida se considera con el fin de diseñar un comportamiento predecible a través de redes genéticas sintéticas12. Como tal, los niveles de variabilidad o ruido en la expresión proteica desempeñan un papel dominante en el diseño y el rendimiento de los circuitos genéticos analógicos y digitales1,16,17.
Se han desarrollado muchos enfoques para cuantificar la variabilidad de célula a célula, incluso en Escherichia coli3,7,18. Estos métodos se utilizan a menudo para estudiar la activación genética y las vías metabólicas, sin embargo, con menos enfoque en el estudio de la dinámica del ruido estocástico, como medir y desenredar fuentes de ruido específicas, especialmente para los circuitos genéticos en las células vivas donde este es un desafío fundamental19,20,21. Varios factores, tanto heredados al propio circuito (intrínsecos) como derivados de las células huésped (extrínsecos), pueden perturbar el rendimiento continuo de los circuitos genéticos. En este documento, desarrollamos un protocolo que tiene como objetivo cuantificar el ruido total en las células de Escherichia coli, incluidas las fuentes de ruido intrínsecas y extrínsecas6,22. Al cuantificar el ruido total y luego evaluar el SNR23,se puede mejorar el diseño de los circuitos genéticos. Este método se puede modificar para medir fuentes de ruido independientes por separado, mediante la monitorización de varias proteínas fluorescentes6,20. Para el protocolo descrito aquí, mantenemos las condiciones ambientales bien controladas y medimos continuamente la actividad de las células sin la influencia de factores externos. Medimos la señal de las proteínas fluorescentes en células individuales con el tiempo y las imagen simultáneamente bajo un sustrato de agarose. Las imágenes resultantes se analizan utilizando el MATLAB personalizado del laboratorio.
Idealmente, la medición continua de la actividad en tiempo real de las proteínas fluorescentes dentro de una célula producirá datos precisos a través del crecimiento y la división de las células. Sin embargo, es difícil adquirir esos datos. Esto se debe a la degradación de las proteínas fluorescentes, conocidas como foto-blanqueamiento7,cuando están expuestas a la radiación en el proceso de excitación. Además, las células de Escherichia coli también son sensibles para la excitación, lo que podría conducir a la fototoxicidad7. Ambas emisiones limitan la cantidad de marcos de fotos que se pueden adquirir y el tiempo entre adquisiciones. El sustrato y los tipos medios (por ejemplo, caldo de lisógena) que se utiliza para cultivar las células durante la toma de imágenes también tienen un papel crítico. Recomendamos encarecidamente el uso de un medio mínimo, que minimice el fondo no fluorescente y amplíe el tiempo de división celular.
Además, la muestra debe prepararse teniendo en cuenta los siguientes requisitos (1) La baja tasa de división celular permite exposiciones menos frecuentes para realizar imágenes cercanas del ciclo de división y reducir la probabilidad de fototoxicidad y fotobleaching. Establecemos el tiempo de adquisición en aproximadamente la mitad del tiempo de mitosis pronosticado (2) La baja densidad celular al comienzo del experimento permite una mejor uniformidad y seguimiento de la división. La densidad celular se ve afectada por la relación de dilución de las células de Escherichia coli, que es un parámetro significativo para el éxito de este protocolo y debe determinarse para cada laboratorio. Para establecer la relación, cada nueva cepa o medio de Escherichia coli utilizado debe estar equipado con gráficos de tasa de crecimiento(Figura Suplementaria 1). Se ha logrado una relación adecuada si las células pueden crecer sin agitación adicional después de una breve incubación de una densidad inicial de aproximadamente600nm OD = 0.1. Las células en esta fase se dividirán de acuerdo con la temperatura ambiente solamente (3) Restricción del movimiento celular: el movimiento celular depende fuertemente de la firmeza del sustrato (almohadilla de agarose). La firmeza del sustrato depende de la cantidad de agarose total y el tiempo de solidificación del gel. Los geles no se pueden dejar solidificar durante la noche a temperatura ambiente, ya que la Escherichia coli se someterá a mitosis. Otros factores que afectan la estabilidad del sustrato incluyen la cantidad de agua en la muestra y la humedad. Las cuestiones adicionales se examinan en detalle en los Resultados del Representante. Este protocolo proporciona muchos detalles y se mueve gradualmente de un paso a otro. El protocolo ofrece una larga estabilidad para experimentos de imágenes y proporciona una herramienta básica de procesamiento de imágenes.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:748px;" width="747">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">35mm glass dish</td>
			<td style="width:216px;">mattek</td>
			<td style="width:137px;">P35G-0.170-14-C</td>
			<td style="width:172px;">thickness corresponding with microscope lense.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Agarose&#160;</td>
			<td style="width:216px;">Lonza</td>
			<td style="width:137px;">5004</td>
			<td>LB preperation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">AHL&#160;</td>
			<td style="width:216px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">K3007</td>
			<td>inducer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Bacto tryptone&#160;</td>
			<td style="width:216px;">BD - Becton, Dickinson and Company&#160;</td>
			<td style="width:137px;">211705</td>
			<td>LB preperation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Carb</td>
			<td style="width:216px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:137px;">10177-012</td>
			<td>antibiotic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Carb</td>
			<td style="width:216px;">Formedium</td>
			<td style="width:137px;">CAR0025</td>
			<td>antibiotic</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Casamino acids&#160;</td>
			<td style="width:216px;">BD - Becton, Dickinson and Company&#160;</td>
			<td style="width:137px;">223050</td>
			<td>minimal media solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">eclipse Ti</td>
			<td style="width:216px;">nikon</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td>inverted microscope</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Glucose</td>
			<td style="width:216px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">G5767</td>
			<td>minimal media solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Glyserol</td>
			<td style="width:216px;">Bio-Lab</td>
			<td style="width:137px;">000712050100</td>
			<td>minimal media substrate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Immersol 518F</td>
			<td style="width:216px;">zeiss</td>
			<td style="width:137px;">4449600000000</td>
			<td>immersion oil</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">M9 salt solution&#160;</td>
			<td style="width:216px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">M6030</td>
			<td>minimal media solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">NaCl</td>
			<td style="width:216px;">Bio-Lab</td>
			<td style="width:137px;">214010</td>
			<td>LB preperation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Noble agar</td>
			<td style="width:216px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">A5431</td>
			<td>minimal media substrate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">parafilm tape</td>
			<td style="width:216px;">Bemis</td>
			<td style="width:137px;">PM-996</td>
			<td>refered to as tape in text</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Seaplaque GTG Agarose</td>
			<td style="width:216px;">Lonza</td>
			<td style="width:137px;">50111</td>
			<td>minimal media substrate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">thaymine B1</td>
			<td style="width:216px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">T0376&#160;</td>
			<td>minimal media solution</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Yeast Extract</td>
			<td style="width:216px;">BD - Becton, Dickinson and Company&#160;</td>
			<td style="width:137px;">212750</td>
			<td>LB preperation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

continuous measurement of biological noise in escherichia coli using time-lapse microscopy

El protocolo desarrollado aquí ofrece una herramienta para permitir el seguimiento por computadora de la división Escherichia coli y los niveles fluorescentes durante varias horas. El proceso comienza por la detección de colonias que sobreviven en medios mínimos, suponiendo que sólo Escherichia coli que alberga el plásmido correcto será capaz de prosperar en las condiciones específicas. Dado que el proceso de construcción de grandes circuitos genéticos, que requieren el montaje de muchas partes del ADN, es un desafío, los componentes del circuito a menudo se distribuyen entre plásmidos múltiples en diferentes números de copia que requieren el uso de varios antibióticos. Las mutaciones en el plásmido pueden destruir la transcripción de los genes de resistencia a los antibióticos e interpelar con el manejo de los recursos en la célula que conduce a la necrosis. La colonia seleccionada está situada en una placa Petri con fondo de cristal y algunos planos de enfoque se seleccionan para el seguimiento de microscopía tanto en campos brillantes como en dominios fluorescentes. El protocolo mantiene el enfoque de imagen durante más de 12 horas en condiciones iniciales que no se pueden regular, creando algunas dificultades. Por ejemplo, las células muertas comienzan a acumularse en el campo de enfoque de las lentes después de unas horas de imágenes, lo que hace que las toxinas se acumulen y la señal se desenfoque y decaiga. El agotamiento de nutrientes introduce nuevos procesos metabólicos y dificulta la respuesta deseada del circuito. La temperatura del experimento reduce la efectividad de los inductores y los antibióticos, lo que puede dañar aún más la fiabilidad de la señal. El gel de medios mínimo se encoge y se seca, y como resultado el enfoque óptico cambia con el tiempo. Desarrollamos este método para superar estos desafíos en Escherichia coli,similar a trabajos anteriores que desarrollan métodos análogos para otros microorganismos. Además, este método ofrece un algoritmo para cuantificar el ruido estocástico total en celdas sin modificar y alteradas, encontrando que los resultados son consistentes con las predicciones del analizador de flujo como se muestra en un coeficiente similar de variación (CV).

El software analiza imágenes de dominio de campo brillante que son fuera de blanco y negro. La Escherichia coli se verá como formas oblongas negras sobre un fondo blanquecino y el rango dinámico de luminancia debe mostrar un pico en su centro(Figura 1). En las imágenes fluorescentes las células pueden tener un halo pequeño, pero las células individuales con formas oblongas todavía se pueden resolver. Primero se debe detectar un evento de mitosis después de 30 minutos. El en...

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Continuous Measurement of Biological Noise in Escherichia Coli Using Time-lapse Microscopy

Este trabajo presenta un método de microscopía que permite la toma de imágenes en vivo de una sola célula de Escherichia coli para el análisis y cuantificación del comportamiento estocástico de los circuitos genéticos sintéticos.

Medición continua del ruido biológico en Escherichia Coli mediante microscopía de lapso de tiempo

The protocol developed here offers a tool to enable computer tracking of Escherichia coli division and fluorescent levels over several hours. The process ...

Este protocolo en hierbas medición continua de circuitos genéticos en E.coli y el cálculo de la variabilidad de la señal y la relación señal-ruido en células bacterianas individuales para evaluar el rendimiento del circuito. Las principales ventajas de esta técnica son que es fácilmente adaptable a diferentes cepas y laboratorios, requiere un entrenamiento mínimo y sin equipo especial, y es relativamente barato. El ruido es un papel importante en la determinación de la funcionalidad de los sistemas biológicos.Actualmente, existe interés en construir circuitos genéticos a gran escala. Estos sistemas pueden ser inhibidos por el ruido Asegúrese de secar bien las muestras, para mantener esas almohadillas frías a cuatro grados Celsius durante el mayor tiempo posible, y para cortar y dividir las partes paciente y suavemente. Para preparar la bacteria para el análisis inocular una sola colonia de un cultivo de E.coli transfectado.Por ejemplo, un circuito con un reportero GFP. En un tubo de vidrio que contiene cinco mililitros de caldo LB complementarlo con los antibióticos relevantes. Cultivar las células a 37 grados Centígrados y 250 revoluciones por minuto en una incubadora temblorosa durante dos horas hasta que el caldo esté nublado.Al final de la incubación, gire hacia abajo un mililitro de solución de dilución en una mini micro centrífuga de dos mililitros, y transfiera 30 microlitros de bacterias y todo el volumen de solución de dilución en un nuevo tubo de dos mililitros. Luego, incubar la cultura durante una hora con temblores antes de sembrar de 40 a 60 microlitros de esta suspensión en placas de cultivo M9. Para preparar la bacteria para el análisis, inocular una sola colonia de un cultivo de E.Coli transfectado.Por ejemplo, un circuito con un reportero de GFP en un tubo de vidrio que contiene cinco mililitros de caldo LB complementado con los antibióticos pertinentes. Cultivar las células a 37 grados Centígrados y 250 revoluciones por minuto en una incubadora temblorosa durante dos horas hasta que el caldo esté nublado. Al final de la incubación, gire un mililitro de solución de dilución en un mini tubo de micro centrífuga de dos mililitros y transfiera 30 microlitros de bacterias y todo el volumen de solución de dilución a un nuevo tubo de dos mililitros.Luego incubar la cultura durante una hora con temblores. Para preparar placas de microscopio, mezcle 112,5 miligramos de agar de baja fusión con 40 miligramos de agar y un mililitro de 2% de ácido casamino en un matraz Erlenmeyer de 25 mililitros. A continuación, añadir 8,92 mililitros de medio mínimo sobre los labios internos de un matraz Erlenmeyer de 25 mililitros y microondas la solución resultante en ráfagas cortas de dos a tres segundos.A continuación, ajuste el baño de agua a 55 grados Celsius. Cuando la solución esté clara, coloque el matraz Erlenmeyer de 25 mililitros en un baño de agua de 60 grados Celsius y deje que la solución del agar se enfríe hasta que su temperatura baje a unos 45 a 50 grados centígrados. Mientras el agar se enfría, limpie el banco de laboratorio con un 70% de etanol y sume un trozo de cinta de laboratorio en el banco limpiado.Coloque un resbalón de cubierta de vidrio en la cinta y coloque un segundo resbalón de cubierta cerca. Agregue la solución de agar refrigerado a los antibióticos y la solución adecuados. Vierta 1,5 mililitros de solución recién preparada para gelear la solución en el resbalón de la cubierta colocado sobre la cinta y coloque el segundo resbalón de la cubierta en el gel, teniendo cuidado de evitar burbujas.Devuelva el Erlenmeyer al baño de agua caliente y cubra los resbalones de la cubierta durante 20 minutos. Voltea los resbalones de la cubierta durante una hora de incubación a cuatro grados centígrados. Al final de la incubación, retire los resbalones de la cubierta del gel seco y corte una pequeña almohadilla de la agarose.Durante la incubación, agregue seis gotas de microlitro de la suspensión bacteriana preparada en un plato de 35 milímetros y deje que las gotas se sequen durante al menos 15 a 30 minutos. A continuación, coloque cuidadosamente la almohadilla a la vez en una gota de bacterias y deje que las muestras se ajusten durante 20 minutos a temperatura ambiente. Para colocar la cama de agar sin manchar la muestra, coloque cuidadosamente la almohadilla fría en la gota con suave roscado.Para tomar imágenes de las muestras, retire el matraz del agua y deje que la solución de gel se enfríe a temperatura corporal. Vierta tres milímetros del gel sobre el perímetro de la placa de muestra. Cuando la agarose se haya solidificado, selle la placa con cinta adhesiva y utilice una aguja del calibre 25 para meter varios agujeros en la cinta.Luego coloque la placa boca abajo a cuatro grados Celsius durante al menos 30 minutos para permitir que la agarose se solidifique completamente, evitando la mitosis celular. Dentro de las 24 horas, utilice un microscopio confocal de fluorescencia para localizar la muestra en el aumento más bajo e activar el sistema de enfoque automático del microscopio. Aplique aceite al objetivo adecuado y utilice el controlador de plataforma para mover la placa para extender cuidadosamente el aceite.A continuación, vuelva a activar el enfoque automático y siga la sugerencia predeterminada de secciones transversales de paso Z para tomar imágenes del ejemplo. La E.coli debe aparecer como formas oblongas negras sobre un fondo blanco apagado. Y el rango dinámico de la luminancia debe mostrar un pico en su centro.Los eventos de mitosis se pueden detectar primero mediante microscopía de fluorescencia después de 30 minutos. Aunque las células individuales pueden ser difíciles de detectar con baja magnificación. Los cultivos celulares bacterianos preparados con una relación de dilución incorrecta pueden demostrar un número inmutable de células, y las muestras preparadas sin sellado de placas pueden presentar una contracción excesiva, lo que resulta en una pérdida de enfoque.Las células también pueden indentar el gel en su búsqueda de nutrientes, lo que resulta en el apilamiento de las células bacterianas uno encima del otro y comprometer la monocapa celular, evitando eficazmente la detección celular y la medición confiable de la señal fluorescente. Como sugieren estos datos, la etapa de celda en el ciclo de división no afecta al nivel de ruido, ya que diferentes rangos de área muestran la misma tendencia. Además, no se observa ningún cambio sustancial en la relación señal-ruido entre GFP y GFP superfoplicado, como ilustran estos datos representativos.Al realizar este procedimiento, tenga cuidado de determinar la relación de dilución correcta para la cepa bacteriana utilizada para el experimento. La comparación de la relación señal-ruido de cada circuito regulado con esta línea base permite seleccionar el mejor circuito de rendimiento y puede revelar fenómenos interesantes

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Continuous Measurement of Biological Noise in Escherichia Coli Using Time-lapse Microscopy

Engineering Biological-Based Vascular Grafts Using a Pulsatile Bioreactor

La ingeniería biológica basada en los injertos vasculares El uso de un biorreactor pulsátil

Much effort has been devoted to develop and advance the methodology to regenerate functional small-diameter arterial bypasses. In the physiological ...

Investigación

Bioingeniería

Three-dimensional Optical-resolution Photoacoustic Microscopy

Tridimensional óptico resolución microscopía fotoacústica

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As ...

Fluorescent Nanoparticles for the Measurement of Ion Concentration in Biological Systems

Las nanopartículas fluorescentes para la Medición de la concentración de iones en sistemas biológicos

Tightly regulated ion homeostasis throughout the body is necessary for the prevention of such debilitating states as dehydration.1 In contrast, rapid ion ...

Time-lapse Fluorescence Imaging of Arabidopsis Root Growth with Rapid Manipulation of The Root Environment Using The RootChip

Time-lapse de imágenes de fluorescencia del crecimiento de raíces de Arabidopsis con la manipulación del ambiente rápido y raíz mediante la RootChip

The root functions as the physical anchor of the plant and is the organ responsible for uptake of water and mineral nutrients such as nitrogen, ...

In situ TEM of Biological Assemblies in Liquid

In situ TEM of Biological Assemblies in Liquid

In situ TEM de Ensamblajes Biológicos en Líquido

Researchers regularly use Transmission Electron Microscopes (TEMs) to examine biological entities and to assess new materials. Here, we describe an ...

Sample Drift Correction Following 4D Confocal Time-lapse Imaging

Muestra de Corrección de la sincronización Tras 4D Confocal Time-lapse de imágenes

The generation of four-dimensional (4D) confocal datasets; consisting of 3D image sequences over time; provides an excellent methodology to capture ...

Surface Potential Measurement of Bacteria Using Kelvin Probe Force Microscopy

Superficie de medición de potencial de bacterias usando Kelvin Sonda de Microscopía de Fuerza

Surface potential is a commonly overlooked physical characteristic that plays a dominant role in the adhesion of microorganisms to substrate surfaces. ...

Design and Construction of Artificial Extracellular Matrix (aECM) Proteins from Escherichia coli for Skin Tissue Engineering

Design and Construction of Artificial Extracellular Matrix aECM Proteins from Escherichia coli for Skin Tissue Engineering

Diseño y Construcción de Artificial matriz extracelular (AECM) Las proteínas de<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Para la piel Ingeniería de Tejidos

Recombinant technology is a versatile platform to create novel artificial proteins with tunable properties. For the last decade, many artificial proteins ...

A Novel Technique for Generating and Observing Chemiluminescence in a Biological Setting

Una nueva técnica para generar y Observación de quimioluminiscencia en un Contexto biológico

Intraoperative imaging techniques have the potential to make surgical interventions safer and more effective; for these reasons, such techniques are ...