Name: continuous measurement of biological noise in escherichia coli using time-lapse microscopy
Uploaded: 2021-04-27T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Continuous Measurement of Biological Noise in Escherichia Coli Using Time-lapse Microscopy at JoVE.com

Vi tackar Gil Gelbert (Fakulteten för elektroteknik, Technion) för att ha hjälpt till med MATLAB-koden. Vi tackar Dr. Ximing Li (Fakulteten för biomedicinsk teknik, Technion) för att ha hjälpt till med att bevisa den här artikeln. Denna forskning stöddes delvis av Neubauer Family Foundation och Israel Ministry of Science, grant 2027345.

1. Medie- och kulturförberedelser
<ol><li>Bered stamlösning av 1000x Carbenicillin (50 mg/mL) eller relevant antibiotika.<ol>
<li>. Väg 0,5 g karbinicillin. Tillsätt 10 ml steril H2O. Lös upp helt.</li>
		<li>Sterilisera karbinenicillinbuljongen genom ett sprutfilter på 0,22 μm. Aliquot antibiotikalösningen och lagra vid -20 °C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>För att förbereda lysogena buljongplattor (LB), blanda 5 g tryptone, 5 g NaCl, 2,5 g jästextrakt och 7,5 g Bacto-agar med 0,5 L st...

<ol>
	<li>Daniel, R., Rubens, J. R., Sarpeshkar, R., Lu, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+analog+computation+in+living+cells.">Synthetic analog computation in living cells.</a> Nature. 497, 619-623 (2013).</li><li>Yang, X. S. Y., L, A. B., Harwood, C., Jensen, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Imaging Bacterial Molecules, Structures and Cells. , (2016).</li><li>Joyce, G., Robertson, B. D., Williams, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modified+agar+pad+method+for+mycobacterial+live-cell+imaging.">A modified agar pad method for mycobacterial live-cell imaging.</a> Biomedcentral Research Notes. , (2011).</li><li>Cotlet, M., Goodwin, P. M., Waldo, G. S., Werner, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+the+fluorescence+dynamics+of+single+molecules+of+a+green+fluorescent+protein:+One-+versus+two-photon+excitation.">A comparison of the fluorescence dynamics of single molecules of a green fluorescent protein: One- versus two-photon excitation.</a> ChemPhysChem. , (2006).</li><li>Andersen, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+unstable+variants+of+green+fluorescent+protein+for+studies+of+transient+gene+expression+in+bacteria.">New unstable variants of green fluorescent protein for studies of transient gene expression in bacteria.</a> Applied and Environmental Microbiology. 64, 2240-2246 (1998).</li><li>Barger, N., Litovco, P., Li, X., Habib, M., Daniel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+metabolic+computation+in+a+bioluminescence-sensing+system.">Synthetic metabolic computation in a bioluminescence-sensing system.</a> Nucleic Acids Research. , (2019).</li><li>Young, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+single-cell+gene+expression+dynamics+in+bacteria+using+fluorescence+time-lapse+microscopy.">Measuring single-cell gene expression dynamics in bacteria using fluorescence time-lapse microscopy.</a> Nature Protocols. , (2012).</li><li>Swain, P. S., Elowitz, M. B., Siggia, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+and+extrinsic+contributions+to+stochasticity+in+gene+expression.">Intrinsic and extrinsic contributions to stochasticity in gene expression.</a> Proceedings of the National Academy of Science United States. , (2002).</li><li>Elowitz, M. B., Levine, A. J., Siggia, E. D., Swain, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stochastic+gene+expression+in+a+single+cell.">Stochastic gene expression in a single cell.</a> Science. , (2002).</li><li>Baumgart, L., Mather, W., Hasty, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synchronized+DNA+cycling+across+a+bacterial+population.">Synchronized DNA cycling across a bacterial population.</a> Nature Genetics. , (2017).</li><li>Arriaga, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+biological+noise+via+single+cell+analysis.">Determining biological noise via single cell analysis.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. , (2009).</li><li>Nielsen, A. A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+circuit+design+automation.">Genetic circuit design automation.</a> Science. , (2016).</li><li>Ozbudak, E. M., Thattai, M., Kurtser, I., Grossman, A. D., van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+noise+in+the+expression+of+a+single+gene.">Regulation of noise in the expression of a single gene.</a> Nature Genetics. 31, 69-73 (2002).</li><li>Pedraza, J. H., Van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noise+propagations+in+gene+networks.">Noise propagations in gene networks.</a> Science. , (2005).</li><li>Jennifer, A. N. B., Christopher, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+genetic+circuit+design.">Principles of genetic circuit design.</a> Nature Methods. , (2014).</li><li>Aoki, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+universal+biomolecular+integral+feedback+controller+for+robust+perfect+adaptation.">A universal biomolecular integral feedback controller for robust perfect adaptation.</a> Nature. , (2019).</li><li>Hanna, H. A., Danial, L., Kvatinsky, S., Daniel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cytomorphic Electronics with Memristors for Modeling Fundamental Genetic Circuits. 4545, (2020).</li><li>de Jong, I. G., Beilharz, K., Kuipers, O. P., Veening, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+cell+imaging+of+Bacillus+subtilis+and+Streptococcus+pneumoniae+using+automated+time-lapse+microscopy.">Live cell imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using automated time-lapse microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2011).</li><li>Eling, N., Morgan, M. D., Marioni, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+in+measuring+and+understanding+biological+noise.">Challenges in measuring and understanding biological noise.</a> Nature Reviews Genetics. , (2019).</li><li>Thattai, M., Van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Attenuation+of+noise+in+ultrasensitive+signaling+cascades.">Attenuation of noise in ultrasensitive signaling cascades.</a> Biophysical Journal. , (2002).</li><li>Thattai, M., Van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+noise+in+gene+regulatory+networks.">Intrinsic noise in gene regulatory networks.</a> Proceedings of the National Academy of Science United States. , (2001).</li><li>Rosenfeld, N., Young, J. W., Alon, U., Swain, P. S., Elowitz, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+regulation+at+the+single-cell+level.">Gene regulation at the single-cell level.</a> Science. , (2005).</li><li>Van Der Ziel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Noise in Measurements. , (1976).</li><li>Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+cloning:+A+laboratory+manual.+2nd+Edition.">Molecular cloning: A laboratory manual. 2nd Edition.</a> Cold Spring Harbor Laboratory Press. , (1989).</li><li>Carpenter, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CellProfiler:+Image+analysis+software+for+identifying+and+quantifying+cell+phenotypes.">CellProfiler: Image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes.</a> Genome Biology. , (2006).</li><li>Paintdakhi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oufti:+An+integrated+software+package+for+high-accuracy,+high-throughput+quantitative+microscopy+analysis.">Oufti: An integrated software package for high-accuracy, high-throughput quantitative microscopy analysis.</a> Molecular Microbiology. , (2016).</li><li>Ducret, A., Quardokus, E. M., Brun, Y. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicrobeJ,+a+tool+for+high+throughput+bacterial+cell+detection+and+quantitative+analysis.">MicrobeJ, a tool for high throughput bacterial cell detection and quantitative analysis.</a> Nature Microbiology. , (2016).</li><li>Stylianidou, S., Brennan, C., Molecular, S. B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> SuperSegger: robust image segmentation, analysis and lineage tracking of bacterial cells - Stylianidou - 2016 - Molecular Microbiology. , (2016).</li><li>Balomenos, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image+analysis+driven+single-cell+analytics+for+systems+microbiology.">Image analysis driven single-cell analytics for systems microbiology.</a> Biomedcentral System Biology. , (2017).</li><li>Smit, J. H., Li, Y., Warszawik, E. M., Herrmann, A., Cordes, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colicoords:+A+Python+package+for+the+analysis+of+bacterial+fluorescence+microscopy+data.">Colicoords: A Python package for the analysis of bacterial fluorescence microscopy data.</a> PLoS One. , (2019).</li><li>Guido, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bottom-up+approach+to+gene+regulation.">A bottom-up approach to gene regulation.</a> Nature. , (2006).</li><li>Beal, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signal-to-noise+ratio+measures+efficacy+of+biological+computing+devices+and+circuits.">Signal-to-noise ratio measures efficacy of biological computing devices and circuits.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. , (2015).</li><li>Marr, D., Hildreth, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Theory+of+edge+detection.">Theory of edge detection.</a> Proceedings of the Royal Society - Biology Science. 207, 187-217 (1980).</li><li>Otsu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Threshold+selection+method+from+gray-level+histograms.">Threshold selection method from gray-level histograms.</a> IEEE Transactions Systems Man Cybernetics. , (1979).</li><li>Soille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Morphological Image Analysis: Principles and Applications, Second edition. , (2000).</li><li>Bradley, D., Roth, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptive+Thresholding+using+the+Integral+Image.">Adaptive Thresholding using the Integral Image.</a> Journal of Graphics Tools. , (2007).</li><li>Meyer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topographic+distance+and+watershed+lines.">Topographic distance and watershed lines.</a> Signal Processing. , (1994).</li><li>Maurer, C. R., Qi, R., Raghavan, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+linear+time+algorithm+for+computing+exact+Euclidean+distance+transforms+of+binary+images+in+arbitrary+dimensions.">A linear time algorithm for computing exact Euclidean distance transforms of binary images in arbitrary dimensions.</a> IEEE Transactions on Pattern Analysis and Machine. , (2003).</li><li>Millo, R., Phillips, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+is+the+maturation+time+for+fluorescent+proteins.">What is the maturation time for fluorescent proteins.</a> Cell Biology by Numbers. , (2015).</li></ol>

I detta arbete utvecklade vi ett protokoll som möjliggör datorspårning av Escherichia coli levande celler, efter uppdelning och fluorescerande nivåer under en period av timmar. Detta protokoll gör det möjligt för oss att kvantifiera den stokastiska dynamiken hos genetiska kretsar i Escherichia coli genom att mäta CV och SNR i realtid. I det här protokollet jämförde vi stokastiska beteenden hos två olika kretsar som visas i figur 10. Det har visat sig att plasmider med låga ...

Syntetisk biologi är ett tvärvetenskapligt område som har dykt upp under det senaste decenniet och syftar till att översätta tekniska designprinciper till rationell biologisk design1,2,3, i ett försök att uppnå multi-signal integration och bearbetning i levande celler för att förstå grundvetenskapen4,5, diagnostiska, terapeutiska och bioteknologiskatillämpningar 6,7,8,9,10. Vår förmåga att kvantifiera inmatningsutgångssvaret hos syntetiska genkretsar har revolutionerats av de senaste framstegen inom encellsteknik, inklusive flödesanalysatorn och levande cellavbildning med hjälp av automatiserad tidsfördröjningsmikroskopi11. En flödesanalysator används ofta för att mäta svaret från dessa kretsar vid steady state1,12, och inverterad mikroskopi används för att mäta det dynamiska svaret hos syntetiska genkretsar på nivån för en enda cell3. Till exempel involverade ett av de tidiga verken inom syntetisk biologi byggandet av genetiska oscillatornätverk i levande celler med hjälp av negativa återkopplingsslingor med enfördröjning 3. Senare tillämpades de genetiska oscillatorkretsarna för att förstå metabolisk kontroll i den dynamiska miljön hos levande celler4. Automatiserad tidsfördröjningsmikroskopi är en metod för att karakterisera sådana kretsar. Vi antar att värdcellerna, Escherichia coli, synkroniserar när de bildar mikrokolonier, vilket möjliggör mätning av signal och beräkning av buller utan att spåra exakta mor-dotter-relationer.
Buller är en grundläggande, inneboende aspekt av biologiska system som ofta härrör från flera källor. Tänk till exempel på biokemiska reaktioner som involverar signaler som härrör från transport av diskreta slumpmässiga bärare som diffusion av proteiner13. Dessa signaler sprider sig med slumpmässiga fluktuationer14. Andra bullerkällor är resurstillgänglighet, celldelning och variationer i miljöförhållanden som temperatur, luftfuktighet och tryck. Biologiska signaler som sprids i syntetiska genkretsar har ofta ett mycket lågt signal-till-brusförhållande (SNR), vilket stör prestandan hos sådana kretsar. Därför är genkretsdesign fortfarande en av de mest utmanande aspekterna av genteknik15. Till exempel, i motsats till de flesta metoder som beräknar endast det genomsnittliga genuttrycket (mätt över hela cellpopulationen), beaktas variansen hos den uppmätta signalen för att konstruera förutsägbart beteende genom syntetiska gennätverk12. Som sådan spelar nivåerna av variabilitet eller buller i proteinuttrycket en dominerande roll i utformningen och prestandan hos analoga och digitala genkretsar1,16,17.
Många metoder har utvecklats för att kvantifiera cell-till-cell variabilitet, inklusive i Escherichia coli3,7,18. Dessa metoder används ofta för att studera genaktivering och metaboliska vägar, men med mindre fokus på studier av stokastisk bullerdynamik, som att mäta och lossa specifika bullerkällor, särskilt för genetiska kretsar i levande celler där detta är en grundläggande utmaning19,20,21. Flera faktorer, både ärvda till själva kretsen (inneboende) och härledda från värdcellerna (extrinsiska), kan störa den kontinuerliga prestandan hos genetiska kretsar. I detta dokument utvecklade vi ett protokoll som syftar till att kvantifiera det totala bullret i Escherichia coli-celler, inklusive de inneboende och extrinsiska bullerkällorna6,22. Genom att kvantifiera det totala bruset och sedan utvärdera SNR23kan utformningen av genkretsar förbättras. Denna metod kan modifieras för att mäta oberoende bullerkällor separat, genom att övervaka flera fluorescerandeproteiner 6,20. För protokollet som beskrivs här håller vi miljöförhållandena väl kontrollerade och mäter kontinuerligt cellernas aktivitet utan påverkan av yttre faktorer. Vi mäter signalen från fluorescerande proteiner i enstaka celler över tid och avbildar dem samtidigt under ett agarose substrat. De resulterande bilderna analyseras med hjälp av laboratoriets anpassade MATLAB.
Helst kommer kontinuerlig mätning av realtidsaktiviteten hos fluorescerande proteiner inuti en cell att producera exakta data genom cellernas tillväxt och delning. Det är dock utmanande att få sådana uppgifter. Detta beror på nedbrytning av fluorescerande proteiner, känd som fotoblekning7, när de utsätts för strålning i excitationsprocessen. Dessutom är Escherichia coli-celler också känsliga för excitationen, vilket kan leda till fototoxicitet7. Båda frågorna begränsar mängden fotoramar som kan förvärvas och tiden mellan förvärven. De substrat och medelstora typer (t.ex. lysogen buljong) som används för att odla cellerna under avbildning har också en kritisk roll. Vi rekommenderar starkt att du använder minimalt medium, vilket minimerar icke-fluorescerande bakgrund och förlänger celldelningstiden.
Dessutom måste provet förberedas med hänsyn till följande krav (1) Låg celldelningshastighet möjliggör mindre frekvent exponering för att noggrant avbilda delningscykeln och minska sannolikheten för fototoxicitet och fotoblekning. Vi ställer in förvärvstiden till ungefär hälften av den förväntade mitostiden (2) Låg celltäthet i början av experimentet möjliggör bättre enhetlighet och spårbarhet för uppdelningen. Celldensiteten påverkas av utspädningsförhållandet för Escherichia coli-cellerna, vilket är en viktig parameter för att detta protokoll ska lyckas och måste bestämmas för varje labb. För att fastställa förhållandet bör varje ny Escherichia coli-stam eller media som används förses med tillväxthastighetsdiagram(kompletterande figur 1). Ett lämpligt förhållande har uppnåtts om celler kan växa utan ytterligare skakningar efter en kort inkubation från en initial densitet på caOD 600nm = 0, 1. Celler i denna fas kommer endast att dividera enligt miljötemperaturen (3) Begränsning av cellrörelser: cellrörelser beror starkt på substrat (agarose pad) fasthet. Substratet fasthet beror på mängden total agarose och geléns stelningstid. Geler kan inte lämnas att stelna över natten vid rumstemperatur, eftersom Escherichia coli kommer att genomgå mitos. Andra faktorer som påverkar substratstabiliteten är mängden vatten i provet och luftfuktigheten. Ytterligare frågor diskuteras i detalj i de representativa resultaten. Det här protokollet innehåller många detaljer och flyttas gradvis från ett steg till ett annat. Protokollet ger lång stabilitet för bildexperiment och ger ett grundläggande bildbehandlingsverktyg.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:748px;" width="747">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">35mm glass dish</td>
			<td style="width:216px;">mattek</td>
			<td style="width:137px;">P35G-0.170-14-C</td>
			<td style="width:172px;">thickness corresponding with microscope lense.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Agarose&#160;</td>
			<td style="width:216px;">Lonza</td>
			<td style="width:137px;">5004</td>
			<td>LB preperation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">AHL&#160;</td>
			<td style="width:216px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">K3007</td>
			<td>inducer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Bacto tryptone&#160;</td>
			<td style="width:216px;">BD - Becton, Dickinson and Company&#160;</td>
			<td style="width:137px;">211705</td>
			<td>LB preperation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Carb</td>
			<td style="width:216px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:137px;">10177-012</td>
			<td>antibiotic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Carb</td>
			<td style="width:216px;">Formedium</td>
			<td style="width:137px;">CAR0025</td>
			<td>antibiotic</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Casamino acids&#160;</td>
			<td style="width:216px;">BD - Becton, Dickinson and Company&#160;</td>
			<td style="width:137px;">223050</td>
			<td>minimal media solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">eclipse Ti</td>
			<td style="width:216px;">nikon</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td>inverted microscope</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Glucose</td>
			<td style="width:216px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">G5767</td>
			<td>minimal media solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Glyserol</td>
			<td style="width:216px;">Bio-Lab</td>
			<td style="width:137px;">000712050100</td>
			<td>minimal media substrate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Immersol 518F</td>
			<td style="width:216px;">zeiss</td>
			<td style="width:137px;">4449600000000</td>
			<td>immersion oil</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">M9 salt solution&#160;</td>
			<td style="width:216px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">M6030</td>
			<td>minimal media solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">NaCl</td>
			<td style="width:216px;">Bio-Lab</td>
			<td style="width:137px;">214010</td>
			<td>LB preperation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Noble agar</td>
			<td style="width:216px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">A5431</td>
			<td>minimal media substrate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">parafilm tape</td>
			<td style="width:216px;">Bemis</td>
			<td style="width:137px;">PM-996</td>
			<td>refered to as tape in text</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Seaplaque GTG Agarose</td>
			<td style="width:216px;">Lonza</td>
			<td style="width:137px;">50111</td>
			<td>minimal media substrate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">thaymine B1</td>
			<td style="width:216px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">T0376&#160;</td>
			<td>minimal media solution</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Yeast Extract</td>
			<td style="width:216px;">BD - Becton, Dickinson and Company&#160;</td>
			<td style="width:137px;">212750</td>
			<td>LB preperation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

continuous measurement of biological noise in escherichia coli using time-lapse microscopy

Protokollet som utvecklats här erbjuder ett verktyg för att möjliggöra datorspårning av Escherichia coli-divisionen och fluorescerande nivåer under flera timmar. Processen börjar med screening för kolonier som överlever på minimala medier, förutsatt att endast Escherichia coli som hyser rätt plasmid kommer att kunna frodas under de specifika förhållandena. Eftersom processen att bygga stora genetiska kretsar, som kräver montering av många DNA-delar, är utmanande, distribueras kretskomponenter ofta mellan flera plasmider vid olika kopieringsnummer som kräver användning av flera antibiotika. Mutationer i plasmid kan förstöra transkription av antibiotikaresistensgenerna och interject med resurshantering i cellen som leder till nekros. Den valda kolonin är inställd på en petriskål med glasbotten och några fokusplan väljs ut för mikroskopispårning i både ljusa fält- och fluorescerande domäner. Protokollet bibehåller bildfokus i mer än 12 timmar under inledande förhållanden som inte kan regleras, vilket skapar några svårigheter. Till exempel börjar döda celler ackumuleras i linsernas fokusfält efter några timmars avbildning, vilket gör att toxiner byggs upp och signalen suddas ut och förfaller. Utarmning av näringsämnen introducerar nya metaboliska processer och hindrar det önskade svaret från kretsen. Experimentet temperatur sänker effektiviteten hos inducerare och antibiotika, vilket ytterligare kan skada signalens tillförlitlighet. Den minimala mediegelen krymper och torkar, och som ett resultat förändras det optiska fokuset med tiden. Vi utvecklade denna metod för att övervinna dessa utmaningar i Escherichia coli, liknande tidigare verk som utvecklar analoga metoder för andra mikroorganismer. Dessutom erbjuder denna metod en algoritm för att kvantifiera det totala stokastiska bruset i oförändrade och förändrade celler, och finner att resultaten överensstämmer med flödesanalysförutsägelser som visas av en liknande variationskoefficient (CV).

Programvaran analyserar ljusa fältdomänbilder som är off-white och svarta. Escherichia coli kommer att se ut som svarta avlånga former på en off-white bakgrund och dynamiskt intervall av luminans bör visa en spik i mitten (Bild 1). I fluorescerande bilder kan celler ha en liten halo men enskilda celler med avlånga former kan fortfarande lösas. En mitoshändelse bör först upptäckas efter 30 minuter. Mikroskopfokus bör förbli stabilt över tid och även om cellerna kan r?...

Watch this Scientific Journal Video about Continuous Measurement of Biological Noise in Escherichia Coli Using Time-lapse Microscopy at JoVE.com

Continuous Measurement of Biological Noise in Escherichia Coli Using Time-lapse Microscopy

Detta arbete presenterar en mikroskopimetod som möjliggör levande avbildning av en enda cell av Escherichia coli för analys och kvantifiering av stokastiskt beteende hos syntetiska genkretsar.

Kontinuerlig mätning av biologiskt buller i Escherichia Coli med tidsfördröjning mikroskopi

The protocol developed here offers a tool to enable computer tracking of Escherichia coli division and fluorescent levels over several hours. The process ...

Detta protokoll i växtbaserade kontinuerlig mätning av genetiska kretsar i E.coli och beräkningen av signalvariationen och signal-till-brusförhållandet i enskilda bakterieceller för att bedöma kretsens prestanda. De främsta fördelarna med denna teknik är att den lätt kan anpassas till olika stammar och laboratorier, kräver minimal träning och ingen speciell utrustning och är relativt billig. Buller är en viktig roll för att bestämma funktionaliteten hos biologiska system.För närvarande finns det ett intresse av att bygga storskaliga genkretsar. Dessa system kan hämmas av buller Var noga med att torka proverna väl, för att hålla kylkuddarna vid fyra grader Celsius så länge som möjligt och för att skära och dela delarna tålmodigt och försiktigt. För att förbereda bakterierna för analysen inokulera en enda koloni från en transfecterad E.coli-kultur.Till exempel en krets med en GFP-reporter. I ett glasrör som innehåller fem milliliter LB-buljong kompletterar det med relevanta antibiotika. Odla cellerna vid 37 grader Celsius och 250 varv per minut i en skakande inkubator i två timmar tills buljongen är grumlig.I slutet av inkubationen, snurra ner en milliliter utspädningslösning i en två milliliter minimikrocentrifug och överför 30 mikroliter bakterier och hela volymen utspädningslösning till ett nytt två milliliterrör. Inkubera sedan kulturen i en timme med skakningar innan du sår 40 till 60 mikroliter av denna suspension på M9-odlingsplattor. För att förbereda bakterierna för analysen, inokulera en enda koloni från en transfekterad E.Coli-kultur.Till exempel en krets med en GFP-reporter i ett glasrör som innehåller fem milliliter LB-buljong kompletterad med relevanta antibiotika. Odla cellerna vid 37 grader Celsius och 250 varv per minut i en skakande inkubator i två timmar tills buljongen är grumlig. I slutet av inkubationen, snurra ner en milliliter utspädningslösning i ett två milliliter minimikrocentrifugrör och överför 30 mikroliter bakterier och hela volymen utspädningslösning till ett nytt två milliliterrör.Inkubera sedan kulturen i en timme med skakningar. För att förbereda mikroskopplattor, blanda 112,5 milligram lågsmältning med 40 milligram agar och en milliliter 2%casaminosyra i en 25 milliliter Erlenmeyer kolv. Lägg sedan till 8,92 milliliter minimalt medium över de inre läpparna på en 25 milliliter Erlenmeyer-kolv och mikrovåg den resulterande lösningen i korthet, två till tre sekunders sprängningar.Ställ sedan vattenbadet på 55 grader Celsius. När lösningen är klar, placera 25 milliliter Erlenmeyerkolven i ett 60 grader Celsius vattenbad och låt agarlösningen svalna tills temperaturen sjunker till ca 45 till 50 grader Celsius. Medan agar kyler, rengör labbbänken med 70% etanol och släta en bit labbtejp på den rengjorda bänken.Placera ett glasskydd på tejpen och placera en andra täckspruta i närheten. Tillsätt kyld agarlösning till lämplig antibiotika och lösning. Häll 1,5 milliliter nyberedda för att gellösning på täckspingen som placeras över tejpen och placera det andra locket på gelén, var noga med att undvika bubblor.Sätt tillbaka Erlenmeyer till varmvattenbadet och täck täckslipsarna i 20 minuter. Vänd täcket glider i en timmes inkubation vid fyra grader Celsius. I slutet av inkubationen, ta bort täcket glider från den torra gelén och skär en liten kudde från agarosen.Under inkubationen, tillsätt sex mikroliterdroppar av den beredda bakteriesuspensionen i en 35 millimeters skål och låt dropparna torka i minst 15 till 30 minuter. Placera sedan försiktigt dynan i taget på en droppe bakterier och låt proverna ställas in i 20 minuter vid rumstemperatur. För att placera agarbädden utan att smutsa provet, placera försiktigt den svala dynan på droppen med mild gängning.För att avbilda proverna, ta bort kolven från vattnet och låt gellösningen svalna till kroppstemperatur. Häll tre millimeter gel på omkretsen av provplattan. När agarosen har stelnat, försegla plattan med tejp och använd en 25 gauge nål för att bita flera hål i tejpen.Placera sedan plattan upp och ner vid fyra grader Celsius i minst 30 minuter för att låta agarosen stelna helt, samtidigt som cellmidos förhindras. Inom 24 timmar, använd ett fluorescenskonfokalt mikroskop för att lokalisera provet vid den lägsta förstoringen och aktivera mikroskopets automatiska fokussystem. Applicera olja på lämpligt mål och använd plattformsregulatorn för att flytta plattan för att försiktigt sprida oljan.Aktivera sedan det automatiska fokuset igen och följ standardförslaget för Z-steg tvärsnitt för att avbilda exemplet. E.coli ska visas som svarta avlånga former på en off white bakgrund. Och luminansens dynamiska omfång bör visa en spik i mitten.Mitoshändelser kan först detekteras genom fluorescensmikroskopi efter 30 minuter. Även om enskilda celler kan vara svåra att upptäcka vid låg förstoring. Bakteriella cellkulturer som framställs vid ett felaktigt utspädningsförhållande kan visa oföränderligt antal celler, och prover som framställs utan platttätning kan uppvisa överdriven krympning, vilket resulterar i en förlust av fokus.Celler kan också dra in gelén i sitt sökande efter näringsämnen, vilket resulterar i stapling av bakteriecellerna ovanpå varandra och kompromissar med cellmonalayern, vilket effektivt förhindrar celldetektering och tillförlitlig fluorescerande signalmätning. Som föreslås av dessa data påverkar cellstadiet i delningscykeln inte ljudnivån, eftersom olika områdesintervall visar samma trend. Vidare observeras ingen väsentlig förändring av signal-till-brusförhållandet mellan GFP och superfold GFP, vilket illustreras av dessa representativa data.När du utför denna procedur, var noga med att bestämma rätt utspädningsförhållande för bakteriestammen som används för experimentet. Genom att jämföra signal-till-brus-förhållandet för varje reglerad krets med denna baslinje kan du välja den bästa prestandakretsen och kan avslöja intressanta fenomen

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Continuous Measurement of Biological Noise in Escherichia Coli Using Time-lapse Microscopy

Engineering Biological-Based Vascular Grafts Using a Pulsatile Bioreactor

Engineering Biologiska-Based Vascular Grafts Med en pulserande Bioreaktor

Much effort has been devoted to develop and advance the methodology to regenerate functional small-diameter arterial bypasses. In the physiological ...

Three-dimensional Optical-resolution Photoacoustic Microscopy

Tredimensionell optisk upplösning photoacoustic Mikroskopi

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As ...

Fluorescent Nanoparticles for the Measurement of Ion Concentration in Biological Systems

Lysrör Nanopartiklar för mätning av jonkoncentration i biologiska system

Tightly regulated ion homeostasis throughout the body is necessary for the prevention of such debilitating states as dehydration.1 In contrast, rapid ion ...

Time-lapse Fluorescence Imaging of Arabidopsis Root Growth with Rapid Manipulation of The Root Environment Using The RootChip

Time-lapse fluorescensavbildning av Arabidopsis rottillväxt med Rapid Manipulering av Root miljö med hjälp av RootChip

The root functions as the physical anchor of the plant and is the organ responsible for uptake of water and mineral nutrients such as nitrogen, ...

In situ TEM of Biological Assemblies in Liquid

In situ TEM of Biological Assemblies in Liquid

In situ TEM för biologiska sammansättningar i vätska

Researchers regularly use Transmission Electron Microscopes (TEMs) to examine biological entities and to assess new materials. Here, we describe an ...

Sample Drift Correction Following 4D Confocal Time-lapse Imaging

Prov Korrigering Drift Efter 4D Confocal Time-lapse avbildning

The generation of four-dimensional (4D) confocal datasets; consisting of 3D image sequences over time; provides an excellent methodology to capture ...

Surface Potential Measurement of Bacteria Using Kelvin Probe Force Microscopy

Ytpotential Mätning av bakterier Använda Kelvin Probe Force Microscopy

Surface potential is a commonly overlooked physical characteristic that plays a dominant role in the adhesion of microorganisms to substrate surfaces. ...

Design and Construction of Artificial Extracellular Matrix (aECM) Proteins from Escherichia coli for Skin Tissue Engineering

Design and Construction of Artificial Extracellular Matrix aECM Proteins from Escherichia coli for Skin Tissue Engineering

Design och konstruktion av artificiell Extracellular Matrix (AECM) Proteiner från<em&gt; Escherichia coli</em&gt; För hudvävnad Engineering

Recombinant technology is a versatile platform to create novel artificial proteins with tunable properties. For the last decade, many artificial proteins ...

A Novel Technique for Generating and Observing Chemiluminescence in a Biological Setting

En ny teknik för att generera och observera Chemiluminescence i en biologisk inställning

Intraoperative imaging techniques have the potential to make surgical interventions safer and more effective; for these reasons, such techniques are ...