Name: continuous measurement of biological noise in escherichia coli using time-lapse microscopy
Uploaded: 2021-04-27T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Continuous Measurement of Biological Noise in Escherichia Coli Using Time-lapse Microscopy at JoVE.com

Matlab koduna yardımcı olduğu için Bay Gil Gelbert'e (Elektrik Mühendisliği Fakültesi, Technion) teşekkür ederiz. Dr. Ximing Li'ye (Technion Biyo-Tıp Mühendisliği Fakültesi) bu makalenin kanıtlanmasına yardımcı olduğu için teşekkür ederiz. Bu araştırma, Neubauer Aile Vakfı ve İsrail Bilim Bakanlığı tarafından kısmen desteklendi, grant 2027345.

1. Medya ve kültür hazırlığı
<ol><li>1.000x Karbenisilin (50 mg/mL) veya ilgili antibiyotik stok çözeltisi hazırlayın.<ol>
<li>. 0,5 g karbenisilin ağırlığında. 10 mL steril H2O ekleyin.</li>
		<li>Karbenisilin stoğunu 0,22 μm şırınna filtresi ile sterilize edin. Antibiyotik çözeltisini aliquot ve -20 ° C'de saklayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Lysogeny et suyu (LB) plakaları hazırlamak için, 5 g tripto, 5 g NaCl, 2,5 g maya özü ve 7,5 g Bacto agar'ı 0,5 L steril H<...

<ol>
	<li>Daniel, R., Rubens, J. R., Sarpeshkar, R., Lu, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+analog+computation+in+living+cells.">Synthetic analog computation in living cells.</a> Nature. 497, 619-623 (2013).</li><li>Yang, X. S. Y., L, A. B., Harwood, C., Jensen, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Imaging Bacterial Molecules, Structures and Cells. , (2016).</li><li>Joyce, G., Robertson, B. D., Williams, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modified+agar+pad+method+for+mycobacterial+live-cell+imaging.">A modified agar pad method for mycobacterial live-cell imaging.</a> Biomedcentral Research Notes. , (2011).</li><li>Cotlet, M., Goodwin, P. M., Waldo, G. S., Werner, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+the+fluorescence+dynamics+of+single+molecules+of+a+green+fluorescent+protein:+One-+versus+two-photon+excitation.">A comparison of the fluorescence dynamics of single molecules of a green fluorescent protein: One- versus two-photon excitation.</a> ChemPhysChem. , (2006).</li><li>Andersen, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+unstable+variants+of+green+fluorescent+protein+for+studies+of+transient+gene+expression+in+bacteria.">New unstable variants of green fluorescent protein for studies of transient gene expression in bacteria.</a> Applied and Environmental Microbiology. 64, 2240-2246 (1998).</li><li>Barger, N., Litovco, P., Li, X., Habib, M., Daniel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+metabolic+computation+in+a+bioluminescence-sensing+system.">Synthetic metabolic computation in a bioluminescence-sensing system.</a> Nucleic Acids Research. , (2019).</li><li>Young, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+single-cell+gene+expression+dynamics+in+bacteria+using+fluorescence+time-lapse+microscopy.">Measuring single-cell gene expression dynamics in bacteria using fluorescence time-lapse microscopy.</a> Nature Protocols. , (2012).</li><li>Swain, P. S., Elowitz, M. B., Siggia, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+and+extrinsic+contributions+to+stochasticity+in+gene+expression.">Intrinsic and extrinsic contributions to stochasticity in gene expression.</a> Proceedings of the National Academy of Science United States. , (2002).</li><li>Elowitz, M. B., Levine, A. J., Siggia, E. D., Swain, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stochastic+gene+expression+in+a+single+cell.">Stochastic gene expression in a single cell.</a> Science. , (2002).</li><li>Baumgart, L., Mather, W., Hasty, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synchronized+DNA+cycling+across+a+bacterial+population.">Synchronized DNA cycling across a bacterial population.</a> Nature Genetics. , (2017).</li><li>Arriaga, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+biological+noise+via+single+cell+analysis.">Determining biological noise via single cell analysis.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. , (2009).</li><li>Nielsen, A. A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+circuit+design+automation.">Genetic circuit design automation.</a> Science. , (2016).</li><li>Ozbudak, E. M., Thattai, M., Kurtser, I., Grossman, A. D., van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+noise+in+the+expression+of+a+single+gene.">Regulation of noise in the expression of a single gene.</a> Nature Genetics. 31, 69-73 (2002).</li><li>Pedraza, J. H., Van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noise+propagations+in+gene+networks.">Noise propagations in gene networks.</a> Science. , (2005).</li><li>Jennifer, A. N. B., Christopher, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+genetic+circuit+design.">Principles of genetic circuit design.</a> Nature Methods. , (2014).</li><li>Aoki, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+universal+biomolecular+integral+feedback+controller+for+robust+perfect+adaptation.">A universal biomolecular integral feedback controller for robust perfect adaptation.</a> Nature. , (2019).</li><li>Hanna, H. A., Danial, L., Kvatinsky, S., Daniel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cytomorphic Electronics with Memristors for Modeling Fundamental Genetic Circuits. 4545, (2020).</li><li>de Jong, I. G., Beilharz, K., Kuipers, O. P., Veening, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+cell+imaging+of+Bacillus+subtilis+and+Streptococcus+pneumoniae+using+automated+time-lapse+microscopy.">Live cell imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using automated time-lapse microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2011).</li><li>Eling, N., Morgan, M. D., Marioni, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+in+measuring+and+understanding+biological+noise.">Challenges in measuring and understanding biological noise.</a> Nature Reviews Genetics. , (2019).</li><li>Thattai, M., Van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Attenuation+of+noise+in+ultrasensitive+signaling+cascades.">Attenuation of noise in ultrasensitive signaling cascades.</a> Biophysical Journal. , (2002).</li><li>Thattai, M., Van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+noise+in+gene+regulatory+networks.">Intrinsic noise in gene regulatory networks.</a> Proceedings of the National Academy of Science United States. , (2001).</li><li>Rosenfeld, N., Young, J. W., Alon, U., Swain, P. S., Elowitz, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+regulation+at+the+single-cell+level.">Gene regulation at the single-cell level.</a> Science. , (2005).</li><li>Van Der Ziel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Noise in Measurements. , (1976).</li><li>Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+cloning:+A+laboratory+manual.+2nd+Edition.">Molecular cloning: A laboratory manual. 2nd Edition.</a> Cold Spring Harbor Laboratory Press. , (1989).</li><li>Carpenter, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CellProfiler:+Image+analysis+software+for+identifying+and+quantifying+cell+phenotypes.">CellProfiler: Image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes.</a> Genome Biology. , (2006).</li><li>Paintdakhi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oufti:+An+integrated+software+package+for+high-accuracy,+high-throughput+quantitative+microscopy+analysis.">Oufti: An integrated software package for high-accuracy, high-throughput quantitative microscopy analysis.</a> Molecular Microbiology. , (2016).</li><li>Ducret, A., Quardokus, E. M., Brun, Y. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicrobeJ,+a+tool+for+high+throughput+bacterial+cell+detection+and+quantitative+analysis.">MicrobeJ, a tool for high throughput bacterial cell detection and quantitative analysis.</a> Nature Microbiology. , (2016).</li><li>Stylianidou, S., Brennan, C., Molecular, S. B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> SuperSegger: robust image segmentation, analysis and lineage tracking of bacterial cells - Stylianidou - 2016 - Molecular Microbiology. , (2016).</li><li>Balomenos, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image+analysis+driven+single-cell+analytics+for+systems+microbiology.">Image analysis driven single-cell analytics for systems microbiology.</a> Biomedcentral System Biology. , (2017).</li><li>Smit, J. H., Li, Y., Warszawik, E. M., Herrmann, A., Cordes, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colicoords:+A+Python+package+for+the+analysis+of+bacterial+fluorescence+microscopy+data.">Colicoords: A Python package for the analysis of bacterial fluorescence microscopy data.</a> PLoS One. , (2019).</li><li>Guido, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bottom-up+approach+to+gene+regulation.">A bottom-up approach to gene regulation.</a> Nature. , (2006).</li><li>Beal, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signal-to-noise+ratio+measures+efficacy+of+biological+computing+devices+and+circuits.">Signal-to-noise ratio measures efficacy of biological computing devices and circuits.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. , (2015).</li><li>Marr, D., Hildreth, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Theory+of+edge+detection.">Theory of edge detection.</a> Proceedings of the Royal Society - Biology Science. 207, 187-217 (1980).</li><li>Otsu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Threshold+selection+method+from+gray-level+histograms.">Threshold selection method from gray-level histograms.</a> IEEE Transactions Systems Man Cybernetics. , (1979).</li><li>Soille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Morphological Image Analysis: Principles and Applications, Second edition. , (2000).</li><li>Bradley, D., Roth, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptive+Thresholding+using+the+Integral+Image.">Adaptive Thresholding using the Integral Image.</a> Journal of Graphics Tools. , (2007).</li><li>Meyer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topographic+distance+and+watershed+lines.">Topographic distance and watershed lines.</a> Signal Processing. , (1994).</li><li>Maurer, C. R., Qi, R., Raghavan, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+linear+time+algorithm+for+computing+exact+Euclidean+distance+transforms+of+binary+images+in+arbitrary+dimensions.">A linear time algorithm for computing exact Euclidean distance transforms of binary images in arbitrary dimensions.</a> IEEE Transactions on Pattern Analysis and Machine. , (2003).</li><li>Millo, R., Phillips, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+is+the+maturation+time+for+fluorescent+proteins.">What is the maturation time for fluorescent proteins.</a> Cell Biology by Numbers. , (2015).</li></ol>

Bu çalışmada, Escherichia coli canlı hücrelerinin bilgisayar izlemesini sağlayan, bir saat boyunca bölünme ve floresan seviyelerini takip eden bir protokol geliştirdik. Bu protokol, CV ve SNR'yi gerçek zamanlı olarak ölçerek Escherichia coli'deki genetik devrelerin stokastik dinamiklerini ölçmemizi sağlar. Bu protokolde şekil 10'dagösterildiği gibi iki farklı devrenin stokastik davranışlarını karşılaştırdık. Düşük kopya numaralarına sahip plazmidlerin st...

Sentetik biyoloji, son on yılda ortaya çıkan ve mühendislik tasarım ilkelerini rasyonel biyolojik tasarım 1 , 2,3, temel bilimi anlamak için canlı hücrelerde çok sinyalli entegrasyon ve işlemeyi sağlamak amacıyla 4,5, tanısal, terapötik ve biyoteknolojik uygulamalar6,7,8,9,10'a çevirmeyi amaçlayan multidisipliner bir alandır. Sentetik gen devrelerinin giriş-çıkış tepkisini ölçme yeteneğimiz, otomatik zaman atlamalı mikroskopi11kullanılarak akış analizörü ve canlı hücre görüntüleme de dahil olmak üzere tek hücreli teknolojideki son gelişmelerle devrime uğradı. Bir akış analizörü genellikle bu devrelerin tepkisini sabit durumda ölçmek için kullanılır1,12ve ters mikroskopi, sentetik gen devrelerinin dinamik tepkisini tek bir hücre düzeyinde ölçmek için kullanılır3. Örneğin, sentetik biyolojideki ilk çalışmalardan biri, gecikmeli negatif geri bildirim döngüleri kullanılarak canlı hücrelerde genetik osilatör ağlarının inşasını içeriyordu3. Daha sonra, canlı hücrelerin dinamik ortamında metabolik kontrolü anlamak için genetik osilatör devreleri uygulandı4. Otomatik zaman atlamalı mikroskopi, bu tür devreleri karakterize etmek için bir yöntemdir. Konak hücrelerin, Escherichia coli, mikro koloniler oluştururken senkronize olduğunu, tam anne-kız ilişkilerini izlemeden sinyal ölçümüne ve gürültünün hesaplanmasına izin verdiğini vardır.
Gürültü, biyolojik sistemlerin genellikle birden fazla kaynaktan kaynaklanan temel, doğal bir yönüdür. Örneğin, proteinlerin difüzyonu gibi ayrık rastgele taşıyıcıların taşınmasından kaynaklanan sinyalleri içeren biyokimyasal reaksiyonları düşünün13. Bu sinyaller rastgele dalgalanmalarla yayılır14. Diğer gürültü kaynakları kaynak kullanılabilirliği, hücre bölünmesi ve sıcaklık, nem ve basınç gibi çevresel koşullardaki farklılıklardır. Sentetik gen devrelerinde yayılan biyolojik sinyaller genellikle gürültü oranına (SNR) çok düşük bir sinyale sahiptir ve bu da bu tür devrelerin performansını bozmaktadır. Bu nedenle, genetik devre tasarımı genetik mühendisliğinin en zorlu yönlerinden biri olmaya devam etmektedir15. Örneğin, yalnızca ortalama gen ekspresyonunun hesapladığı çoğu yaklaşımın aksine (tüm hücre popülasyonu üzerinden ölçülür), sentetik gen ağları aracılığıyla öngörülebilir davranışı tasarlamak için ölçülen sinyalin varyansı dikkate alınır12. Bu nedenle, protein ifadesindeki değişkenlik veya gürültü seviyeleri, analog ve dijital gen devrelerinin tasarımında ve performansında baskın bir rol oynar1,16,17.
Escherichia coli3,7,18dahil olmak üzere hücreden hücreye değişkenliği ölçmek için birçok yaklaşım geliştirilmiştir. Bu yöntemler genellikle gen aktivasyonunu ve metabolik yolları incelemek için kullanılır, ancak özellikle bunun temel bir zorluk olduğu canlı hücrelerdeki genetik devreler için belirli gürültü kaynaklarını ölçmek ve dağıtmak gibi stokastik gürültü dinamiklerinin incelenmesine daha az odaklanarak19,20,21. Hem devrenin kendisine miras kalan (içsel) hem de konak hücrelerden (dışsal) türetilen çeşitli faktörler genetik devrelerin sürekli performansını bozabilir. Bu yazıda, içsel ve dışsal gürültü kaynakları da dahil olmak üzere Escherichia coli hücrelerindeki toplam gürültüyü ölçmeyi amaçlayan bir protokol geliştirdik6,22. Toplam gürültüyü ölçerek ve daha sonra SNR23'ü değerlendirerek gen devrelerinin tasarımı geliştirilebilir. Bu yöntem, birkaç floresanproteiniizleyerek bağımsız gürültü kaynaklarını ayrı ayrı ölçmek için değiştirilebilir 6,20. Burada açıklanan protokol için çevre koşullarını iyi kontrol altında tutuyor ve dış faktörlerin etkisi olmadan hücrelerin aktivitesini sürekli ölçüyoruz. Floresan proteinlerden gelen sinyali zaman içinde tek hücrelerde ölçtük ve aynı anda bir agarose substratı altında görüntüleyeceğiz. Elde edilen görüntüler laboratuvarın özel MATLAB'ı kullanılarak analiz edilir.
İdeal olarak, bir hücre içindeki floresan proteinlerin gerçek zamanlı aktivitesinin sürekli ölçümü, hücrelerin büyümesi ve bölünmesi yoluyla doğru veriler üretecektir. Ancak, bu tür verileri elde etmek zordur. Bunun nedeni, foto-ağartma7olarak bilinen floresan proteinlerin, heyecanlanma sürecinde radyasyona maruz kaldıklarında bozulmasıdır. Ayrıca, Escherichia coli hücreleri de fototoksiteye yol açabilecek heyecan için hassastır7. Her iki sorun da elde edilebilen fotoğraf karelerinin miktarını ve satın almalar arasındaki süreyi sınırlar. Görüntüleme sırasında hücreleri büyütmek için kullanılan substrat ve orta tipler (örneğin, lysogeny et suyu) da kritik bir role sahiptir. Floresan olmayan arka planı en aza indiren ve hücre bölünme süresini uzatan minimum ortam kullanmanızı öneririz.
Ayrıca, numunenin aşağıdaki gereksinimler göz önünde bulundurularak hazırlanması gerekir (1) Düşük hücre bölünme oranı, bölme döngüsünü yakından görüntülemek ve fototoksiklik ve fotobleaching olasılığını azaltmak için daha az sıklık pozlama sağlar. Edinme süresini öngörülen mitoz süresinin yaklaşık yarısına ayarladık (2) Deneyin başındaki düşük hücre yoğunluğu, bölünmenin daha iyi homojenliğini ve izlenebilirliğini sağlar. Hücre yoğunluğu, bu protokolün başarısı için önemli bir parametre olan ve her laboratuvar için belirlenmesi gereken Escherichia coli hücrelerinin seyreltme oranından etkilenir. Oranı belirlemek için, kullanılan her yeni Escherichia coli suşu veya ortamı büyüme hızı grafikleri ile donatılmalıdır(Tamamlayıcı Şekil 1). Hücreler yaklaşık600nm = 0.1 başlangıç yoğunluğundan kısa bir inkübasyondan sonra ek titreme olmadan büyüyebiliyorsa uygun bir oran elde edilmiştir. Bu aşamadaki hücreler sadece ortam sıcaklığına göre bölünür (3) Hücre hareketinin kısıtlanması: hücre hareketi güçlü bir şekilde substrat (agarose pad) sıkılığına bağlıdır. Substrat sıkılığı toplam agarose miktarına ve jel katılaşma süresine bağlıdır. Escherichia coli mitoz geçireceğinden, jeller oda sıcaklığında bir gecede katılaşmaya bırakılamaz. Substrat stabilitesini etkileyen diğer faktörler arasında numunedeki su miktarı ve nem sayar. Ek konular Temsilci Sonuçları 'nda ayrıntılı olarak ele alınmıştır. Bu protokol birçok ayrıntı sağlar ve yavaş yavaş bir adımdan diğerine geçer. Protokol, görüntüleme deneyleri için uzun kararlılık sunar ve temel bir görüntü işleme aracı sağlar.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:748px;" width="747">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">35mm glass dish</td>
			<td style="width:216px;">mattek</td>
			<td style="width:137px;">P35G-0.170-14-C</td>
			<td style="width:172px;">thickness corresponding with microscope lense.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Agarose&#160;</td>
			<td style="width:216px;">Lonza</td>
			<td style="width:137px;">5004</td>
			<td>LB preperation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">AHL&#160;</td>
			<td style="width:216px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">K3007</td>
			<td>inducer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Bacto tryptone&#160;</td>
			<td style="width:216px;">BD - Becton, Dickinson and Company&#160;</td>
			<td style="width:137px;">211705</td>
			<td>LB preperation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Carb</td>
			<td style="width:216px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:137px;">10177-012</td>
			<td>antibiotic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Carb</td>
			<td style="width:216px;">Formedium</td>
			<td style="width:137px;">CAR0025</td>
			<td>antibiotic</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Casamino acids&#160;</td>
			<td style="width:216px;">BD - Becton, Dickinson and Company&#160;</td>
			<td style="width:137px;">223050</td>
			<td>minimal media solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">eclipse Ti</td>
			<td style="width:216px;">nikon</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td>inverted microscope</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Glucose</td>
			<td style="width:216px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">G5767</td>
			<td>minimal media solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Glyserol</td>
			<td style="width:216px;">Bio-Lab</td>
			<td style="width:137px;">000712050100</td>
			<td>minimal media substrate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Immersol 518F</td>
			<td style="width:216px;">zeiss</td>
			<td style="width:137px;">4449600000000</td>
			<td>immersion oil</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">M9 salt solution&#160;</td>
			<td style="width:216px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">M6030</td>
			<td>minimal media solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">NaCl</td>
			<td style="width:216px;">Bio-Lab</td>
			<td style="width:137px;">214010</td>
			<td>LB preperation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Noble agar</td>
			<td style="width:216px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">A5431</td>
			<td>minimal media substrate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">parafilm tape</td>
			<td style="width:216px;">Bemis</td>
			<td style="width:137px;">PM-996</td>
			<td>refered to as tape in text</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Seaplaque GTG Agarose</td>
			<td style="width:216px;">Lonza</td>
			<td style="width:137px;">50111</td>
			<td>minimal media substrate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">thaymine B1</td>
			<td style="width:216px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">T0376&#160;</td>
			<td>minimal media solution</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Yeast Extract</td>
			<td style="width:216px;">BD - Becton, Dickinson and Company&#160;</td>
			<td style="width:137px;">212750</td>
			<td>LB preperation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

continuous measurement of biological noise in escherichia coli using time-lapse microscopy

Burada geliştirilen protokol, Escherichia coli bölümünün ve floresan seviyelerinin birkaç saat boyunca bilgisayar takibini sağlamak için bir araç sunmaktadır. Süreç, sadece doğru plazmidi barındıran Escherichia coli'nin belirli koşullarda gelişebileceğini varsayarak, minimum medyada hayatta kalan kolonileri tarayarak başlar. Birçok DNA parçasının montajını gerektiren büyük genetik devreler oluşturma süreci zor olduğundan, devre bileşenleri genellikle birkaç antibiyotik kullanılmasını gerektiren farklı kopya numaralarında birden fazla plazmid arasında dağıtılır. Plazmiddeki mutasyonlar antibiyotik direnci genlerinin transkripsiyonunu yok edebilir ve nekroza yol açan hücredeki kaynak yönetimi ile kesişebilir. Seçilen koloni cam tabanlı bir Petri kabına ayarlanır ve hem parlak alanda hem de floresan etki alanlarında mikroskopi takibi için birkaç odak düzlemi seçilir. Protokol, düzenlenemeyen ilk koşullar altında görüntü odağını 12 saatten fazla tutar ve birkaç zorluk yaratır. Örneğin, ölü hücreler birkaç saatlik görüntülemeden sonra lenslerin odak alanında birikmeye başlar, bu da toksinlerin birikmesine ve sinyalin bulanıklaşmasına ve çürümesine neden olur. Besinlerin tükenmesi yeni metabolik süreçleri tanıtır ve devrenin istenen yanıtını engeller. Deneyin sıcaklığı indükleyicilerin ve antibiyotiklerin etkisini düşürür ve bu da sinyalin güvenilirliğine daha fazla zarar verebilir. Minimum ortam jeli küçülür ve kurur ve sonuç olarak optik odak zamanla değişir. Bu yöntemi geliştirdik Escherichia coliDiğer mikro organizmalar için benzer yöntemler geliştiren önceki çalışmalara benzer. Buna ek olarak, bu yöntem değişmemiş ve değiştirilmiş hücrelerdeki toplam stokastik gürültüyü ölçmek için bir algoritma sunar ve sonuçların benzer bir değişim katsayısı (CV) ile gösterildiği gibi akış analizörü tahminleri ile tutarlı olduğunu bulur.

Yazılım, beyaz ve siyah olmayan parlak alan adı görüntülerini analiz eder. Escherichia coli, beyaz olmayan bir arka plan üzerinde siyah dikdörtgen şekillere benzeyecek ve dinamik parlaklık aralığı merkezinde bir artış göstermelidir (Şekil 1). Floresan görüntülerde hücreler küçük bir haleye sahip olabilir, ancak dikdörtgen şekillere sahip bireysel hücreler hala çözülebilir. Bir mitoz olayı ilk olarak 30 dakika sonra tespit edilmelidir. Mikroskop odağı...

Watch this Scientific Journal Video about Continuous Measurement of Biological Noise in Escherichia Coli Using Time-lapse Microscopy at JoVE.com

Continuous Measurement of Biological Noise in Escherichia Coli Using Time-lapse Microscopy

Bu çalışma, sentetik gen devrelerinin stokastik davranışının analizi ve nicelleştirilmesi için tek bir Escherichia coli hücresinin canlı görüntülenmesini sağlayan bir mikroskopi yöntemi sunun.

Zaman Atlamalı Mikroskopi Kullanılarak Escherichia Coli'de Biyolojik Gürültünün Sürekli Ölçümü

The protocol developed here offers a tool to enable computer tracking of Escherichia coli division and fluorescent levels over several hours. The process ...

Bitkisellerde bu protokol, E.coli'deki genetik devrelerin sürekli ölçümü ve devre performansını değerlendirmek için bireysel bakteri hücresinde sinyal değişkenliği ve sinyal-gürültü oranının hesaplanması. Bu tekniğin ana avantajları, farklı suşlara ve laboratuvarlara kolayca adapte edilebilen, minimum eğitim gerektiren ve özel ekipman gerektirmeyen ve nispeten ucuz olmasıdır. Gürültü, biyolojik sistemlerin işlevselliğinin belirlenmesinde önemli bir rol oynar.Şu anda, büyük ölçekli gen devreleri inşa etmek için bir ilgi vardır. Bu sistemler gürültü ile engellenebilir Numuneleri iyice kurutacağından, bu soğuk pedleri mümkün olduğunca dört santigrat derecede tuttuğundan ve parçaları sabırla ve nazikçe kesip böldüğünden emin olun. Bakterileri analize hazırlamak için transfected E.coli kültüründen tek bir koloniyi aşılar.Örneğin, GFP muhabiri olan bir devre. Beş mililitre LB suyu içeren bir cam tüpte ilgili antibiyotiklerle takviye edin. Et suyu bulanık olana kadar iki saat boyunca titreyen bir inkübatörde hücreleri 37 santigrat derecede ve dakikada 250 devirde büyütün.Kuluçkanın sonunda, iki mililitrelik bir mini mikro santrifüjde bir mililitre seyreltme çözeltisini aşağı çevirin ve 30 mikrolitre bakteriyi ve tüm seyreltme çözeltisini yeni bir iki mililitrelik tüpe aktarın. Daha sonra, bu süspansiyonun 40 ila 60 mikrolitresini M9 kültür plakalarına tohumlamadan önce sallama ile kültürü bir saat kuluçkaya yatırın. Bakterileri analize hazırlamak için, transfected E.Coli kültüründen tek bir koloni aşıla.Örneğin, ilgili antibiyotiklerle desteklenmiş beş mililitre LB suyu içeren bir cam tüpte GFP muhabiri olan bir devre. Et suyu bulanık olana kadar iki saat boyunca titreyen bir inkübatörde hücreleri 37 santigrat derecede ve dakikada 250 devirde büyütün. Kuluçkanın sonunda, iki mililitrelik bir mini mikro santrifüj tüpünde bir mililitre seyreltme çözeltisini aşağı çevirin ve 30 mikrolitre bakteri ve tüm seyreltme çözeltisi hacmini yeni bir iki mililitrelik tüpe aktarın.Sonra kültürü sallanarak bir saat kuluçkaya yatırın. Mikroskop plakaları hazırlamak için, 112,5 miligram düşük erimeli agar ile 40 miligram agar ve 25 mililitre Erlenmeyer şişesinde bir mililitre% 2 casamino asit karıştırın. Daha sonra, 25 mililitrelik bir Errlenmeye şişesinin iç dudaklarına 8,92 mililitre minimum ortam ekleyin ve elde eden çözeltiyi kısaca, iki ila üç saniyelik patlamalarla mikrodalgaya koyun.Sonra su banyoyu 55 santigrat dereceye ayarlayın. Çözelti açık olduğunda, 25 mililitre Erlenmeyer şişesini 60 santigrat derecelik bir su banyosuna yerleştirin ve agar çözeltisinin sıcaklığı yaklaşık 45 ila 50 santigrat dereceye düşene kadar soğumasını bekleyin. Agar soğurken, laboratuvar tezgahını% 70 etanol ile temizleyin ve temizlenen tezgaha bir laboratuvar bandı parçası pürüzsüzleştirin.Bant üzerine bir cam kapak kayması yerleştirin ve yakınına ikinci bir kapak kayması yerleştirin. Uygun antibiyotiklere ve çözeltiye soğutulmuş agar çözeltisi ekleyin. Bant üzerine yerleştirilen kapak kaymasına 1,5 mililitre taze hazırlanmış jel çözeltisi dökün ve kabarcıklardan kaçınmaya dikkat ederek ikinci kapak kaymasını jel üzerine yerleştirin.Erlenmeyer'i sıcak su banyosuna geri verin ve kapak kaymalarını 20 dakika örtün. Kapak kaymalarını dört santigrat derecede bir saatlik kuluçka için çevirin. Kuluçkanın sonunda, kapak kaymalarını kuru jelden çıkarın ve agarosedan küçük bir ped kesin.Kuluçka sırasında, hazırlanan bakteri süspansiyonunun altı mikrolitre damlasını 35 milimetrelik bir kabın içine ekleyin ve damlaların en az 15 ila 30 dakika kurumasını bekleyin. Daha sonra pedi bir seferde bir bakteri damlasına dikkatlice yerleştirin ve numunelerin oda sıcaklığında 20 dakika ayarlamasına izin verin. Agar yatağını numuneyi bulaştırmadan yerleştirmek için, soğuk pedi hafifçe dokunarak damlacık üzerine dikkatlice yerleştirin.Numuneleri görüntülemek için şişeyi sudan çıkarın ve jel çözeltisinin vücut sıcaklığına soğumasını bekleyin. Jelin üç milimetresini numune plakasının çevresine dökün. Agarose katılaştırıldığında, plakayı bantla kapatın ve bant içine birkaç delik açmak için 25 kalibrelik bir iğne kullanın.Daha sonra, hücre mitozını önlerken agaroseun tamamen katılaşmasını sağlamak için plakayı en az 30 dakika boyunca dört santigrat derecede baş aşağı yerleştirin. 24 saat içinde, numuneyi en düşük büyütmede bulmak ve mikroskobun otomatik odak sistemini meşgul etmek için floresan konfokal mikroskop kullanın. Uygun hedefe yağ uygulayın ve yağı dikkatlice yaymak için plakayı hareket ettirmek için platform denetleyicisini kullanın.Ardından otomatik odağı yeniden devreye sokun ve örneği görüntülemek için Z adım kesitleri için varsayılan öneriyi izleyin. E.coli, beyaz bir arka plan üzerinde siyah dikdörtgen şekiller olarak görünmelidir. Ve parlaklığın dinamik aralığı merkezinde bir artış göstermelidir.Mitoz olayları ilk olarak 30 dakika sonra floresan mikroskopi ile tespit edilebilir. Tek tek hücrelerin düşük büyütmede tespit edilmesi zor olsa da. Yanlış seyreltme oranında hazırlanan bakteri hücre kültürleri değişmeyen hücre sayısını gösterebilir ve plaka sızdırmazlık olmadan hazırlanan numuneler aşırı büzülme gösterebilir ve bu da odaklanma kaybına neden olabilir.Hücreler ayrıca besin arayışlarında jeli girintileyebilir, bu da bakteri hücrelerinin üst üste istiflenmesine ve hücre monolayerinin tehlikeye atarak hücre algılamasını ve güvenilir floresan sinyal ölçümünü etkili bir şekilde önleyebilir. Bu veriler tarafından önerildikçe, farklı alan aralıkları aynı eğilimi gösterdiğinden, bölme döngüsündeki hücre aşaması gürültü düzeyini etkilemez. Ayrıca, bu temsili verilerle gösterildiği gibi, GFP ve süper kat GFP arasında sinyal-gürültü oranında önemli bir değişiklik gözlenmez.Bu işlemi gerçekleştirirken, deney için kullanılan bakteri suşu için doğru seyreltme oranını belirlemeye özen gösterin. Düzenlenmiş her devrenin sinyal-gürültü oranını bu taban hattıyla karşılaştırmak, en iyi performans devresinin seçilmesini sağlar ve ilginç fenomenleri ortaya çıkarır

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Continuous Measurement of Biological Noise in Escherichia Coli Using Time-lapse Microscopy

Engineering Biological-Based Vascular Grafts Using a Pulsatile Bioreactor

Pulsatif Biyoreaktör kullanarak Mühendislik Biyolojik Tabanlı Vasküler Greftler

Much effort has been devoted to develop and advance the methodology to regenerate functional small-diameter arterial bypasses. In the physiological ...

Three-dimensional Optical-resolution Photoacoustic Microscopy

Üç boyutlu optik çözünürlük foto akustik Mikroskopi

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As ...

Fluorescent Nanoparticles for the Measurement of Ion Concentration in Biological Systems

Biyolojik Sistemleri İyon Konsantrasyon Ölçümü için Floresan Nanopartiküller

Tightly regulated ion homeostasis throughout the body is necessary for the prevention of such debilitating states as dehydration.1 In contrast, rapid ion ...

Time-lapse Fluorescence Imaging of Arabidopsis Root Growth with Rapid Manipulation of The Root Environment Using The RootChip

RootChip kullanarak Kök Çevre Rapid manipülasyonu ile Arabidopsis Kök Büyüme Time-lapse Floresans Görüntüleme

The root functions as the physical anchor of the plant and is the organ responsible for uptake of water and mineral nutrients such as nitrogen, ...

In situ TEM of Biological Assemblies in Liquid

In situ TEM of Biological Assemblies in Liquid

Yerinde Sıvıda Biyolojik Montajlar TEM

Researchers regularly use Transmission Electron Microscopes (TEMs) to examine biological entities and to assess new materials. Here, we describe an ...

Sample Drift Correction Following 4D Confocal Time-lapse Imaging

4D Eşodaklı Time-lapse Görüntüleme ardından Numune Drift Düzeltme

The generation of four-dimensional (4D) confocal datasets; consisting of 3D image sequences over time; provides an excellent methodology to capture ...

Surface Potential Measurement of Bacteria Using Kelvin Probe Force Microscopy

Kelvin Probe Kuvvet Mikroskobu kullanılarak Bakterilerin Yüzey Potansiyel Ölçümü

Surface potential is a commonly overlooked physical characteristic that plays a dominant role in the adhesion of microorganisms to substrate surfaces. ...

Design and Construction of Artificial Extracellular Matrix (aECM) Proteins from Escherichia coli for Skin Tissue Engineering

Design and Construction of Artificial Extracellular Matrix aECM Proteins from Escherichia coli for Skin Tissue Engineering

Tasarım ve Yapay Ekstrasellüler Matrix İnşaatı (aECM) Proteinler gelen<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Cilt Doku Mühendisliği

Recombinant technology is a versatile platform to create novel artificial proteins with tunable properties. For the last decade, many artificial proteins ...

A Novel Technique for Generating and Observing Chemiluminescence in a Biological Setting

Biyolojik ortamda oluşturuluyor ve Gözlem Kemilüminesans için Yeni Bir Teknik

Intraoperative imaging techniques have the potential to make surgical interventions safer and more effective; for these reasons, such techniques are ...