Name: paper-based preconcentration and isolation of microvesicles and exosomes
Uploaded: 2020-04-29T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Paper-Based Preconcentration and Isolation of Microvesicles and Exosomes at JoVE.com

Denne undersøgelse blev støttet af National Research Foundation of Korea, Grant NRF-2018R1D1A1A09084044. J. H. Lee blev støttet af et forskningstilskud fra Kwangwoon University i 2019. Hyerin Kim blev støttet af "Kompetenceudviklingsprogram for branchespecialister" fra det koreanske ministerium for handel, industri og energi (MOTIE), der drives af Korea Institute for Advancement of Technology (KIAT) (Nr. P0002397, HRD-program for industriel konvergens af bærbare smart-enheder).

1. Fremstilling af udstyr
<ol><li>Definer det område, der skal udskrives på papir, ved hjælp af printersoftware (Materialetabel). BEMÆRK: Designet har 12 voksmønstrede lag, hvor diametrene af de cirkulære prøveområder gradvist indsnævres fra 5 mm til 2 mm (figur 1A).</li>
	<li>Udskriv hydrofobvoks på de udpegede områder på begge sider af cellulosepapiret (Materialetabellen) ved hjælp af et kommercielt voksprinter (Materialetabel</st...

<ol>
	<li>Edgar, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Q+&amp;+A:+What+are+exosomes,+exactly.">Q &amp; A: What are exosomes, exactly.</a> BMC Biology. 14 (1), 1-7 (2016).</li><li>Contreras-Naranjo, J. C., Wu, H. J., Ugaz, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics+for+exosome+isolation+and+analysis:+Enabling+liquid+biopsy+for+personalized+medicine.">Microfluidics for exosome isolation and analysis: Enabling liquid biopsy for personalized medicine.</a> Lab on a Chip. 17 (21), 3558-3577 (2017).</li><li>Simons, M., Raposo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+-+vesicular+carriers+for+intercellular+communication.">Exosomes - vesicular carriers for intercellular communication.</a> Current Opinion in Cell Biology. 21 (4), 575-581 (2009).</li><li>St&#229;hl, A. L., Johansson, K., Mossberg, M., Kahn, R., Karpman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+and+microvesicles+in+normal+physiology,+pathophysiology,+and+renal+diseases.">Exosomes and microvesicles in normal physiology, pathophysiology, and renal diseases.</a> Pediatric Nephrology. 34 (1), 11-30 (2019).</li><li>Chen, C., Lin, B. R., Hsu, M. Y., Cheng, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paper-based+devices+for+isolation+and+characterization+of+extracellular+vesicles.">Paper-based devices for isolation and characterization of extracellular vesicles.</a> Journal of Visualized Experiments. (98), e52722 (2015).</li><li>Kim, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origami-paper-based+device+for+microvesicle/exosome+preconcentration+and+isolation.">Origami-paper-based device for microvesicle/exosome preconcentration and isolation.</a> Lab on a Chip. 19 (23), 3917-3921 (2019).</li><li>Raposo, G., Stoorvogel, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles:+Exosomes,+microvesicles,+and+friends.">Extracellular vesicles: Exosomes, microvesicles, and friends.</a> Journal of Cell Biology. 200 (4), 373-383 (2013).</li><li>Lee, Y., El Andaloussi, S., Wood, M. J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+and+microvesicles:+Extracellular+vesicles+for+genetic+information+transfer+and+gene+therapy.">Exosomes and microvesicles: Extracellular vesicles for genetic information transfer and gene therapy.</a> Human Molecular Genetics. 21, 125-134 (2012).</li><li>Liu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Field-Free+Isolation+of+Exosomes+from+Extracellular+Vesicles+by+Microfluidic+Viscoelastic+Flows.">Field-Free Isolation of Exosomes from Extracellular Vesicles by Microfluidic Viscoelastic Flows.</a> ACS Nano. 11 (7), 6968-6976 (2017).</li><li>Marczak, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+isolation+and+preconcentration+of+exosomes+by+ion+concentration+polarization.">Simultaneous isolation and preconcentration of exosomes by ion concentration polarization.</a> Electrophoresis. 39 (15), 2029-2038 (2018).</li><li>Livshts, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+exosomes+by+differential+centrifugation:+Theoretical+analysis+of+a+commonly+used+protocol.">Isolation of exosomes by differential centrifugation: Theoretical analysis of a commonly used protocol.</a> Scientific Reports. 5, 1-14 (2015).</li><li>Chiriac&#242;, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lab-on-chip+for+exosomes+and+microvesicles+detection+and+characterization.">Lab-on-chip for exosomes and microvesicles detection and characterization.</a> Sensors. 18 (10), 3175 (2018).</li><li>Lobb, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+exosome+isolation+protocol+for+cell+culture+supernatant+and+human+plasma.">Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 4 (1), 1-11 (2015).</li><li>Taylor, D. D., Shah, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+of+isolating+extracellular+vesicles+impact+down-stream+analyses+of+their+cargoes.">Methods of isolating extracellular vesicles impact down-stream analyses of their cargoes.</a> Methods. 87, 3-10 (2015).</li><li>Han, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrokinetic+size-based+spatial+separation+of+micro/nanospheres+using+paper-based+3d+origami+preconcentrator.">Electrokinetic size-based spatial separation of micro/nanospheres using paper-based 3d origami preconcentrator.</a> Analytical Chemistry. 91 (16), 10744-10749 (2019).</li><li>Yeh, S. H., Chou, K. H., Yang, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sample+pre-concentration+with+high+enrichment+factors+at+a+fixed+location+in+paper-based+microfluidic+devices.">Sample pre-concentration with high enrichment factors at a fixed location in paper-based microfluidic devices.</a> Lab on a Chip. 16 (5), 925-931 (2016).</li></ol>

Selv om Exo-PAD blev anvendt med succes til berigelse og isolering af mikrovekler og exosomer, bør flere kritiske punkter nøje overvejes: 1) ovnens inkubationstid og -temperatur under enhedens tilberedning, 2) behandlingstid, 3) påføring af spænding med varierende lagtal og prøveområdediametre og 4) anvendelighed på kliniske prøver.
Inkubationstiden og -temperaturen i protokollen er optimerede betingelser for at fremstille en pålidelig enhed. Længere inkubationstider eller en højer...

Mikrovekler og exosomer er små membran vesikler, der måler henholdsvis 0,2−1 μm og 30−200 nm. De udskilles i det ekstracellulære miljø af flere forskellige celletyper1,,2,,3,,4,,5. De indeholder forældrecelle oplysninger i form af undergrupper af DNA, mRNA, miRNA, proteiner og lipider, og cirkulerer i hele kroppen via forskellige kropsvæsker såsom serum, plasma, urin, cerebrospinalvæske, fostervand, og spyt6,7,8,9. Således kan teknikker til effektiv isolering af mikrovekler og exosomer fra biologiske væsker give omfattende muligheder inden for diagnose, prognose, og real-time overvågning af sygdom, samt i udviklingen af nye terapeutiske.
Den konventionelle isolationsmetode for mikrovesiler og exosomer baseret på ultracentrifugation er imidlertid yderst tidskrævende og medfører betydelige tab og kontaminering af prøven. Dette skyldes , at det indebærer flere besværlige pipetterings- og lastningstrin og udsmid af forskellige reagenser med gentagen ultracentrifugation5,6,10,11,12. Desuden kan den høje forskydningsbelastning forårsaget af ultracentrifugation (~100.000 x g) forårsage fysisk lysis af mikrovende stoffer og exosomer, hvilket giver dårlige restitutionsrater (5−23 %)6,13,14. Derfor skal der udvikles en yderst effektiv, diskret isolationsteknik til mikrovende stoffer og exosomer for at reducere skader og tab og derved opnå højere restitutionsrater.
En origami-papir-baseret enhed (Exo-PAD) blev udviklet til enklere, blidere, og meget effektiv isolering af mikrovekler og exosomer6. Udformningen af Exo-PAD er et flerfoldet papir med serielt forbundne prøveområder, der gradvist falder i diameter. Ionkoncentrationspolariseringsteknikken (ICP), som er et nanoelektrokinetisk fænomen, der prækoncentrerer ladede biomolekyler, blev integreret med dette unikke design. Brug af Exo-PAD resulterede i femdoblet berigelse af mikrovekler og exosomer i specifikke lag og deres isolation ved blot at folde enheden ud. Denne artikel beskriver Exo-PAD i detaljer, fra den samlede enhed fabrikation og drift til analyse af dens anvendelse, for at illustrere metoden og vise repræsentative resultater6.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1356px;" width="1355">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:397px;">Ag/AgCl electrodes</td>
			<td style="width:207px;">A-M Systems, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">531500</td>
			<td style="width:633px;">0.15&#34; diameter</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Albumin from Bovine Serum (BSA), Alexa Fluor 594 conjugate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A13101</td>
			<td>BSA conjugated with Alexa Fluor 594 (Ex/Em: 590/617 nm)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Carbonate-Bicarbonate Buffer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C3041-50CAP</td>
			<td>Carbonate buffer</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">CorelDraw software (Coral Co., Canada)</td>
			<td>Corel Corporation</td>
			<td></td>
			<td>Printer software to define wax printing region</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ColorQube 8870</td>
			<td>Xerox Corporation</td>
			<td></td>
			<td>Wax printer</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Chromatography paper grade 1</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>3001-861</td>
			<td>Cellulose paper, dimension: 20 * 20 cm</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fluorescent-labeled exosome standards</td>
			<td>HansaBioMed Life Sciences, Ltd.</td>
			<td>HBM-F-PEP-100</td>
			<td>Exosome labeled with FITC (Ex/Em: 490/520 nm)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Keithley 2410 current/voltage source-meter</td>
			<td>Keithley Instruments, Inc.</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Current&#8211;voltage source measurement system</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Nafion perfluorinated resin solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>31175-20-9</td>
			<td>Permselective membrane, 20 wt.% in the mixture of lower aliphatic alcohols and water; contains 34% water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NanoSight LM10</td>
			<td>NanoSight Technology</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Nanoparticle tracking analysis (NTA) machine</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphate-buffered saline (PBS, pH7.4)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10010001</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

paper-based preconcentration and isolation of microvesicles and exosomes

Microvesicles og exosomer er små membranøse vesikler frigivet til det ekstracellulære miljø og cirkulerede i hele kroppen. Fordi de indeholder forskellige forældrecellebaserede biomolekyler såsom DNA, mRNA, miRNA, proteiner og lipider, er deres berigelse og isolation afgørende skridt for deres udnyttelse som potentielle biomarkører til kliniske anvendelser. Konventionelle isolationsmetoder (f.eks. ultracentrifugation) forårsager imidlertid betydelige tab og skader på mikrovekler og exosomer. Disse metoder kræver også flere gentagne trin i ultracentrifugation, lastning og spilde af reagenser. Denne artikel beskriver en detaljeret metode til at fremstille en origami-papir-baseret enhed (Exo-PAD) designet til effektiv berigelse og isolering af mikrovekler og exosomer på en enkel måde. Exo-PAD's unikke design, der består af harmonikalignende flerfoldede lag med konvergerende prøveområder, er integreret med ionkoncentrationspolariseringsteknikken, hvilket muliggør femdoblet berigelse af mikrovekler og exosomer på specifikke lag. Desuden er de berigede mikrovekler og exosomer isoleret ved blot at udfolde Exo-PAD.

Driftstiden skal optimeres for at opnå det maksimale genvindingsudbytte af de berigede mikrovekler og exosomer. Utilstrækkelig tid tillader ikke tilstrækkelig migration af mikrovekler og exosomer, hvilket reducerer berigelsen, mens overdreven tid forr formindsker den rumlige fokusering og dermed spreder mikrovepik og exosomer. Således kan den maksimale prækoncentrationsfaktor for mikrovesiler og exosomer og den endelige placering, hvor mikrovende stoffer og exosomer er mest berigede, identificeres gennem tidsoptimer...

Watch this Scientific Journal Video about Paper-Based Preconcentration and Isolation of Microvesicles and Exosomes at JoVE.com

Paper-Based Preconcentration and Isolation of Microvesicles and Exosomes

Præsenteret er en protokol til at fremstille en papir-baseret enhed til effektiv berigelse og isolering af mikrovekler og exosomer.

Papirbaseret forkoncentration og isolering af mikrovekler og exosoler

Microvesicles and exosomes are small membranous vesicles released to the extracellular environment and circulated throughout the body. Because they ...

I denne protokol beskriver vi en enkel metode til at fremstille en papirbaseret enhed kaldet XO Pad, som er designet til effektiv berigelse isoleret af ekstracellulære vesikler. XO Pad er en simpel enhed, der kan pre-koncentrat og isolere ekstracellulære vesicle uden brug af kemikalier eller arbejdsmaskiner, samtidig med at der vises højere restitutionsrater end konventionelle metoder. Begynd med at definere det område, der skal udskrives med printersoftware.Designet skal have 12 voksmønstrede lag, hvor diameteren af de cirkulære prøveområder gradvist indsnævres fra fem til to millimeter. Derefter udskrives hydrofobe voks på de udpegede områder på begge sider af cellulosepapiret. Placer voks trykt papir i et laboratorium ovn i 80 sekunder ved 120 grader Celsius, derefter skære voks trykt papir med en kutter til at gøre individuelle XO Pad enheder.Drop en fem og to mikroliter perm selektiv membran på prøven områder i venstre mest og højre de fleste lag, henholdsvis. Placer lagene kodet med perm selektiv membran på en varmeplade ved 70 grader Celsius i 30 minutter for at fordampe opløsningsmidlet. Derefter forsegle den yderste overflade af det belagte lag vender buffer løsning med trykfølsom tape, efterlader et lille hul.Fold XO Pad-enheden frem og tilbage langs de hvide linjer for at forbinde alle prøveområder. Pipette 15 mikroliter af mikrovæk og exosom prøve i de konvergerende prøveområder og vent et par sekunder for at sikre fuldstændig befugtning. Placer to akrylkamre i begge ender af XO Pad og klem det sikkert med små bindemiddel klip for at forhindre udfoldelse.Fyld kamrene med 110 mikroliter 0,1 X PBS og indsæt to sølvelektroder. Brug derefter et strømspændingskildemålingssystem til at anvende 30 volt på elektroderne i 20 minutter. For at isolere de berigede mikrovesikler og exosomer, adskille den foldede XO Pad fra akrylkamrene og udfolde enheden for at isolere de berigede partikler fra de andre lag.Udstansning af prøveområderne i lag otte og ni, hvor mikrovæsnerne og exosomer beriges til downstream-analyse. Der blev udført en tidsforstyrret migrationsanalyse af fluorescerende mærkede mikrovesikler og exosomer for at optimere driftstiden for maksimal genvinding af de berigede partikler. Fluorescensintensiteten i alle prøveområder blev kvantificeret med ImageJ-software.Før tilsætningsprocessen blev mikrovesikler og exosomer spredt i alle prøveområder med et gradvist fald i intensiteten. Efter 10 minutters behandling, partiklerne migreret elektrokinetisk og en øjeblikkelig pre-koncentration stik dukkede op på lag syv. Når tiden nåede 20 minutter, mikrovesicles og exosomer var stærkt fokuseret på lag otte og ni og beriget fem gange baseret på fluorescens intensiteter.Integriteten af de berigede mikrovesikler og exosomer i lag otte blev undersøgt med SEM. Betydeligt flere ikke-beskadigede partikler blev observeret efter tilsætningsprocessen. Størrelsesfordelingen af de berigede mikrovesikler og exosomer blev også analyseret.Efterfølgende blev den faktiske koncentration af de berigede mikrovesikler og exosomer på prøveområderne i lag seks, otte og 10 analyseret. I lag otte var mikrovesiklerne og exosomerne forkoncentreret med en faktor på 5,58, men der blev ikke observeret nogen mærkbar prækoncentration i de andre lag. For at sikre reproducerbarheden af denne procedure, præcist fulgt protokollen for ovn inkubation tid og temperatur under enhedens verifikation og enhedens driftstid, fordi disse er de optimerede betingelser.XO Pad kan også bruges til at adskille og isolere ekstracellulære vesicle fra proteinrige prøver, såsom serum eller plasma, ved hjælp af karbonatbuffer. Denne protokol kan give en effektiv, enkel forberedelse værktøj, med sin pre-koncentration og isolere kapaciteter, der kræves for klinisk forskning, såsom diagnose, lægemiddellevering, immunterapi, og andre terapeutiske.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Identification of Plant Ice-binding Proteins Through Assessment of Ice-recrystallization Inhibition and Isolation Using Ice-affinity Purification

Identifikation af Plant Ice-bindende Proteiner Gennem Vurdering af Ice-omkrystallisation inhibering og isolering ved hjælp af is-affinitet Oprensning

Ice-binding proteins (IBPs) belong to a family of stress-induced proteins that are synthesized by certain organisms exposed to subzero temperatures. In ...

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Isolation og respiratoriske målinger af mitokondrier fra Arabidopsis thaliana

Mitochondria are essential organelles involved in numerous metabolic pathways in plants, most notably the production of adenosine triphosphate (ATP) from ...

Protein Digestion, Ultrafiltration, and Size Exclusion Chromatography to Optimize the Isolation of Exosomes from Human Blood Plasma and Serum

Protein fordøjelse, ultrafiltrering og størrelse udstødelse kromatografi at optimere Isolation af Exosomes fra humant blod Plasma og Serum

Exosomes, a type of nanovesicle released from all cell types, can be isolated from any bodily fluid. The contents of exosomes, including proteins and ...

Rapid Isolation of the Mitoribosome from HEK Cells

Hurtig Isolation af Mitoribosome fra HEK celler

The human mitochondria possess a dedicated set of ribosomes (mitoribosomes) that translate 13 essential protein components of the oxidative ...

Detection and Isolation of Apoptotic Bodies to High Purity

Detektion og isolering af apoptotiske organer til høj renhed

Apoptotic bodies (ApoBDs), microvesicles and exosomes are the key members of the extracellular vesicle family, with ApoBDs being one of the largest type. ...

Isolation of Physiologically Active Thylakoids and Their Use in Energy-Dependent Protein Transport Assays

Isolering af fysiologisk aktive tylakoiderne og deres anvendelse i energiafhængige Protein Transport Assays

Chloroplasts are the organelles in green plants responsible for carrying out numerous essential metabolic pathways, most notably photosynthesis. Within ...

Isolation of Glomeruli and In Vivo Labeling of Glomerular Cell Surface Proteins

Isolation of Glomeruli and In Vivo Labeling of Glomerular Cell Surface Proteins

Isolering af Glomeruli og In Vivo mærkning af glomerulær celle overflade proteiner

Proteinuria results from the disruption of the glomerular filter that is composed of the fenestrated endothelium, glomerular basement membrane, and ...

Looking Outwards: Isolation of Cyanobacterial Released Carbohydrate Polymers and Proteins

Ser udad: isolering af Cyanobakteriale frigivne kulhydratpolymerer og proteiner

Cyanobacteria can actively secrete a wide range of biomolecules into the extracellular environment, such as heteropolysaccharides and proteins. The ...

Isolation and Analysis of Plasma Lipoproteins by Ultracentrifugation

Isolation og analyse af Plasma Lipoproteiner ved Ultracentrifugation

Analysis of plasma lipoproteins and apolipoproteins is an essential part for the diagnosis of dyslipidemia and studies of lipid metabolism and ...

Isolation of Active Caenorhabditis elegans Nuclear Extract and Reconstitution for In Vitro Transcription

Isolation of Active Caenorhabditis elegans Nuclear Extract and Reconstitution for In Vitro Transcription

Isolering af aktiv caenorhabditis elegans nukleare ekstrakt og rekonstitution for In Vitro Transskription

Caenorhabditis elegans has been an important model system for biological research since it was introduced in 1963. However, C. elegans has not been fully ...