Name: paper-based preconcentration and isolation of microvesicles and exosomes
Uploaded: 2020-04-29T15:00:00
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Cette étude a été soutenue par la National Research Foundation of Korea, Grant NRF-2018R1D1A1A09084044. J. H. Lee a reçu le soutien d’une subvention de recherche de l’Université Kwangwoon en 2019. Hyerin Kim a reçu l’appui du « Programme de développement des compétences pour les spécialistes de l’industrie » du Ministère coréen du commerce, de l’industrie et de l’énergie (MOTIE), géré par le Korea Institute for Advancement of Technology (KIAT) (No. P0002397, programme drh pour la convergence industrielle des appareils intelligents portables).

1. Fabrication d’appareils
<ol><li>Définir la région à imprimer sur papier à l’aide d’un logicield’imprimante( Table des matériaux ). REMARQUE : La conception comporte 12 couches à motifs de cire dans lesquelles les diamètres des zones d’échantillonnage circulaires se rétrécissent progressivement de 5 mm à 2 mm (figure 1A).</li>
	<li>Imprimer de la cire hydrophobe sur les régions désignées des deux côtés du papier cellulosique ( Tableau des mat...

<ol>
	<li>Edgar, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Q+&amp;+A:+What+are+exosomes,+exactly.">Q &amp; A: What are exosomes, exactly.</a> BMC Biology. 14 (1), 1-7 (2016).</li><li>Contreras-Naranjo, J. C., Wu, H. J., Ugaz, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics+for+exosome+isolation+and+analysis:+Enabling+liquid+biopsy+for+personalized+medicine.">Microfluidics for exosome isolation and analysis: Enabling liquid biopsy for personalized medicine.</a> Lab on a Chip. 17 (21), 3558-3577 (2017).</li><li>Simons, M., Raposo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+-+vesicular+carriers+for+intercellular+communication.">Exosomes - vesicular carriers for intercellular communication.</a> Current Opinion in Cell Biology. 21 (4), 575-581 (2009).</li><li>St&#229;hl, A. L., Johansson, K., Mossberg, M., Kahn, R., Karpman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+and+microvesicles+in+normal+physiology,+pathophysiology,+and+renal+diseases.">Exosomes and microvesicles in normal physiology, pathophysiology, and renal diseases.</a> Pediatric Nephrology. 34 (1), 11-30 (2019).</li><li>Chen, C., Lin, B. R., Hsu, M. Y., Cheng, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paper-based+devices+for+isolation+and+characterization+of+extracellular+vesicles.">Paper-based devices for isolation and characterization of extracellular vesicles.</a> Journal of Visualized Experiments. 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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+and+microvesicles:+Extracellular+vesicles+for+genetic+information+transfer+and+gene+therapy.">Exosomes and microvesicles: Extracellular vesicles for genetic information transfer and gene therapy.</a> Human Molecular Genetics. 21, 125-134 (2012).</li><li>Liu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Field-Free+Isolation+of+Exosomes+from+Extracellular+Vesicles+by+Microfluidic+Viscoelastic+Flows.">Field-Free Isolation of Exosomes from Extracellular Vesicles by Microfluidic Viscoelastic Flows.</a> ACS Nano. 11 (7), 6968-6976 (2017).</li><li>Marczak, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+isolation+and+preconcentration+of+exosomes+by+ion+concentration+polarization.">Simultaneous isolation and preconcentration of exosomes by ion concentration polarization.</a> Electrophoresis. 39 (15), 2029-2038 (2018).</li><li>Livshts, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+exosomes+by+differential+centrifugation:+Theoretical+analysis+of+a+commonly+used+protocol.">Isolation of exosomes by differential centrifugation: Theoretical analysis of a commonly used protocol.</a> Scientific Reports. 5, 1-14 (2015).</li><li>Chiriac&#242;, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lab-on-chip+for+exosomes+and+microvesicles+detection+and+characterization.">Lab-on-chip for exosomes and microvesicles detection and characterization.</a> Sensors. 18 (10), 3175 (2018).</li><li>Lobb, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+exosome+isolation+protocol+for+cell+culture+supernatant+and+human+plasma.">Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 4 (1), 1-11 (2015).</li><li>Taylor, D. D., Shah, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+of+isolating+extracellular+vesicles+impact+down-stream+analyses+of+their+cargoes.">Methods of isolating extracellular vesicles impact down-stream analyses of their cargoes.</a> Methods. 87, 3-10 (2015).</li><li>Han, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrokinetic+size-based+spatial+separation+of+micro/nanospheres+using+paper-based+3d+origami+preconcentrator.">Electrokinetic size-based spatial separation of micro/nanospheres using paper-based 3d origami preconcentrator.</a> Analytical Chemistry. 91 (16), 10744-10749 (2019).</li><li>Yeh, S. H., Chou, K. H., Yang, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sample+pre-concentration+with+high+enrichment+factors+at+a+fixed+location+in+paper-based+microfluidic+devices.">Sample pre-concentration with high enrichment factors at a fixed location in paper-based microfluidic devices.</a> Lab on a Chip. 16 (5), 925-931 (2016).</li></ol>

Bien que l’Exo-PAD ait été utilisé avec succès pour l’enrichissement et l’isolement des microvesicules et des exosomes, plusieurs points critiques doivent être soigneusement examinés : 1) le temps et la température d’incubation du four pendant la préparation de l’appareil, 2) le temps de traitement, 3) l’application de la tension avec des nombres de couches variables et les diamètres de la surface d’échantillonnage, et 4) l’applicabilité aux échantillons cliniques.
...

Les microvesicules et les exosomes sont de petites vésicules membranaires mesurant respectivement 0,2−1 μm et 30−200 nm. Ils sont sécrétés dans l’environnement extracellulaire par plusieurs types de cellules différents1,2,3,4,5. Ils contiennent des informations relatives aux cellules parentales sous forme de sous-ensembles d’ADN, d’ARNm, de miARN, de protéines et de lipides, et circulent dans tout le corps via divers fluides corporels tels que le sérum, le plasma, l’urine, le liquide céphalo-rachidien, le liquide amniotique et la salive6,,7,8,9. Ainsi, les techniques d’isolement efficace des microvesicules et des exosomes des fluides biologiques peuvent fournir de vastes possibilités dans les domaines du diagnostic, du pronostic et de la surveillance en temps réel de la maladie, ainsi que dans le développement de nouvelles thérapies.
Cependant, la méthode d’isolement conventionnelle pour les microvesicules et les exosomes basée sur l’ultracentrifugation prend énormément de temps et entraîne une perte et une contamination importantes de l’échantillon. C’est parce qu’il implique plusieurs étapes lourdes de pipetage et de chargement et le rejet de divers réactifs avec ultracentrifugation répétée5,6,10,11,12. En outre, le stress de cisaillement élevé induit par l’ultracentrifugation (~100 000 x g)peut causer la lyse physique des microvesicules et des exosomes, ce qui donne de faibles taux de récupération (5−23%)6,13,14. Par conséquent, une technique d’isolement discrète et très efficace pour les microvesicules et les exosomes doit être développée pour réduire les dommages et les pertes, atteignant ainsi des taux de récupération plus élevés.
Un dispositif origami-papier (Exo-PAD) a été développé pour un isolement plus simple, plus doux et très efficace des microvesicules et des exosomes6. La conception de l’Exo-PAD est un papier multifréqué avec des zones d’échantillonnage reliées en série qui diminuent progressivement de diamètre. La technique de polarisation de la concentration des ions (ICP), qui est un phénomène nano-électrocinétique qui préconcentre les biomolécules chargées par les préconcentrés, a été intégrée à cette conception unique. L’utilisation de l’Exo-PAD a entraîné un enrichissement quintuple des microvesicules et des exosomes dans des couches spécifiques et leur isolement en déroulant simplement l’appareil. Cet article décrit l’Exo-PAD en détail, de la fabrication et de l’exploitation globales de l’appareil à l’analyse de son utilisation, pour illustrer la méthode et afficher des résultats représentatifs6.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1356px;" width="1355">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:397px;">Ag/AgCl electrodes</td>
			<td style="width:207px;">A-M Systems, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">531500</td>
			<td style="width:633px;">0.15&#34; diameter</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Albumin from Bovine Serum (BSA), Alexa Fluor 594 conjugate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A13101</td>
			<td>BSA conjugated with Alexa Fluor 594 (Ex/Em: 590/617 nm)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Carbonate-Bicarbonate Buffer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C3041-50CAP</td>
			<td>Carbonate buffer</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">CorelDraw software (Coral Co., Canada)</td>
			<td>Corel Corporation</td>
			<td></td>
			<td>Printer software to define wax printing region</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ColorQube 8870</td>
			<td>Xerox Corporation</td>
			<td></td>
			<td>Wax printer</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Chromatography paper grade 1</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>3001-861</td>
			<td>Cellulose paper, dimension: 20 * 20 cm</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fluorescent-labeled exosome standards</td>
			<td>HansaBioMed Life Sciences, Ltd.</td>
			<td>HBM-F-PEP-100</td>
			<td>Exosome labeled with FITC (Ex/Em: 490/520 nm)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Keithley 2410 current/voltage source-meter</td>
			<td>Keithley Instruments, Inc.</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Current&#8211;voltage source measurement system</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Nafion perfluorinated resin solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>31175-20-9</td>
			<td>Permselective membrane, 20 wt.% in the mixture of lower aliphatic alcohols and water; contains 34% water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NanoSight LM10</td>
			<td>NanoSight Technology</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Nanoparticle tracking analysis (NTA) machine</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphate-buffered saline (PBS, pH7.4)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10010001</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

paper-based preconcentration and isolation of microvesicles and exosomes

Les microvesicules et les exosomes sont de petites vésicules membraneuses libérées dans l’environnement extracellulaire et distribuées dans tout le corps. Étant donné qu’ils contiennent diverses biomolécules d’origine cellulaire parentale telles que l’ADN, l’ARNm, le miARN, les protéines et les lipides, leur enrichissement et leur isolement sont des étapes essentielles pour leur exploitation en tant que biomarqueurs potentiels pour les applications cliniques. Toutefois, les méthodes d’isolement conventionnelles (p. ex., l’ultracentrifugation) causent des pertes et des dommages importants aux microvesicules et aux exosomes. Ces méthodes nécessitent également de multiples étapes répétitives d’ultracentrifugation, de chargement et de gaspillage de réactifs. Cet article décrit une méthode détaillée pour fabriquer un dispositif à base de papier origami (Exo-PAD) conçu pour l’enrichissement et l’isolement efficaces des microvesicules et des exosomes d’une manière simple. La conception unique de l’Exo-PAD, composée de couches multiples en forme d’accordéon avec des zones d’échantillonnage convergentes, est intégrée à la technique de polarisation de la concentration des ions, permettant ainsi un enrichissement quintuple des microvesicules et des exosomes sur des couches spécifiques. En outre, les microvesicules enrichies et les exosomes sont isolés en déployant simplement l’Exo-PAD.

Le temps d’opération doit être optimisé pour atteindre le rendement maximal de récupération des microvesicles enrichis et des exosomes. Le temps insuffisant ne permet pas une migration suffisante des microvesicules et des exosomes, ce qui diminue l’enrichissement, alors que le temps excessif détériore la focalisation spatiale et disperse donc les microvesicules et les exosomes. Ainsi, grâce à l’étape d’optimisation du temps, le facteur maximum de préconcentration des microvesicules et des exosomes et l...

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Paper-Based Preconcentration and Isolation of Microvesicles and Exosomes

Présenté est un protocole pour fabriquer un dispositif à base de papier pour l’enrichissement et l’isolement efficaces des microvesicules et des exosomes.

Préconcentration et isolation des microvesicules et des exosomes sur papier

Microvesicles and exosomes are small membranous vesicles released to the extracellular environment and circulated throughout the body. Because they ...

Dans ce protocole, nous décrivons une méthode simple pour fabriquer un dispositif basé sur le papier appelé le XO Pad, qui est conçu pour l’enrichissement efficace dans l’isolement des vésicules extracellulaires. Le XO Pad est un dispositif simple qui peut pré-concentrer et isoler la vésicule extracellulaire sans l’utilisation de produits chimiques ou de machines de travail, tout en montrant des taux de récupération plus élevés que les méthodes conventionnelles. Commencez par définir la région à imprimer avec un logiciel d’imprimante.La conception devrait avoir 12 couches à motifs de cire dans lesquelles les diamètres des zones de l’échantillon circulaire se rétrécir progressivement de cinq à deux millimètres. Ensuite, imprimez de la cire hydrophobe sur les régions désignées des deux côtés du papier cellulose. Placez le papier imprimé à la cire dans un four de laboratoire pendant 80 secondes à 120 degrés Celsius, puis coupez le papier imprimé à la cire à l’intérieur d’un coupeur pour fabriquer des appareils XO Pad individuels.Déposez respectivement cinq et deux microlitres de membrane sélective perm sur les zones de l’échantillon dans la plupart et la droite gauches de la plupart des couches. Placez les couches codées avec la membrane sélective perm sur une plaque chaude à 70 degrés Celsius pendant 30 minutes pour évaporer le solvant. Ensuite, scellez la surface extérieure de la couche enduite face à la solution tampon avec du ruban sensible à la pression, en laissant un petit trou.Pliez l’appareil XO Pad d’avant en arrière le long des lignes blanches pour relier convergentement toutes les zones de l’échantillon. Pipette 15 microlitres du microvesicle et de l’échantillon exosome dans les zones d’échantillonnage convergentes et attendre quelques secondes pour assurer un mouillage complet. Placez deux chambres acryliques aux deux extrémités de la garniture XO et serrez-la solidement avec de petites pinces de liant pour éviter le déroulement.Remplissez les chambres de 110 microlitres de 0,1 X PBS et insérez deux électrodes argentées. Ensuite, utilisez un système de mesure de la source de tension actuelle pour appliquer 30 volts sur les électrodes pendant 20 minutes. Pour isoler les microvesicles et exosomes enrichis, séparez le XO Pad plié des chambres acryliques et dépliez l’appareil pour isoler les particules enrichies des autres couches.Percer les zones de l’échantillon dans les couches huit et neuf où les microvesicles et les exosomes sont enrichis pour l’analyse en aval. Un test de migration en accéléré des microvesicles et exosomes étiquetés fluorescents a été effectué afin d’optimiser le temps de fonctionnement pour une récupération maximale des particules enrichies. Les intensités de fluorescence dans tous les secteurs d’échantillon ont été quantifiées avec le logiciel d’ImageJ.Avant le processus d’enrichissement, les microvesicles et les exosomes étaient dispersés dans toutes les zones de l’échantillon avec une diminution graduelle de l’intensité. Après 10 minutes de traitement, les particules ont migré électro-kinétiquement et une prise de pré-concentration instantanée est apparue sur la couche sept. Lorsque le temps a atteint 20 minutes, les microvesicles et les exosomes étaient fortement concentrés sur les couches huit et neuf et enrichis cinq fois en fonction des intensités de fluorescence.L’intégrité des microvesicles et exosomes enrichis dans la couche huit a été étudiée avec SEM. Beaucoup plus de particules non endommagées ont été observées après le processus d’enrichissement. La distribution de taille des microvésicules et exosomes enrichis a également été analysée.Par la suite, la concentration réelle des microvésicules et des exosomes enrichis sur les zones de l’échantillon dans les couches six, huit et 10 a été analysée. Dans la couche huit, les microvesicles et les exosomes ont été pré-concentrés par un facteur de 5.58, mais aucune pré-concentration notable n’a été observée dans les autres couches. Pour assurer la reproductibilité de cette procédure, précisément suivi le protocole pour le temps d’incubation du four et la température pendant la vérification de l’appareil et le temps de fonctionnement de l’appareil parce que ce sont les conditions optimisées.Le XO Pad peut également être utilisé pour séparer et isoler la vésicule extracellulaire d’échantillons riches en protéines, tels que le sérum ou le plasma, en utilisant un tampon carbonate. Ce protocole peut fournir un outil de préparation efficace et simple, avec ses capacités de pré-concentration et d’isolement requises pour la recherche clinique, telles que le diagnostic, l’administration de médicaments, l’immunothérapie et d’autres thérapeutiques.

Research

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Ice-binding proteins (IBPs) belong to a family of stress-induced proteins that are synthesized by certain organisms exposed to subzero temperatures. In ...

Recherche

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Exosomes, a type of nanovesicle released from all cell types, can be isolated from any bodily fluid. The contents of exosomes, including proteins and ...

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Détection et isolement des corps apoptotiques de haute pureté

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