Name: paper-based preconcentration and isolation of microvesicles and exosomes
Uploaded: 2020-04-29T15:00:00
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Questo studio è stato sostenuto dalla National Research Foundation of Korea, Grant NRF-2018R1D1A1A09084044. J. H. Lee è stato sostenuto da una borsa di ricerca della Kwangwoon University nel 2019. Hyerin Kim è stata sostenuta dal "Programma di sviluppo delle competenze per gli specialisti dell'industria" del Ministero coreano del commercio, dell'industria e dell'energia (MOTIE), gestito dal Korea Institute for Advancement of Technology (KIAT) (n. P0002397, programma HRD per la convergenza industriale di dispositivi intelligenti indossabili).

1. Fabbricazione del dispositivo
<ol><li>Definire la regione da stampare su carta utilizzando il software della stampante (Table of Materials). NOTA: Il disegno ha 12 strati con motivi di cera in cui i diametri delle aree campione circolari si restringono gradualmente da 5 a 2 mm (Figura 1A).</li>
	<li>Stampare la cera idrofobica sulle regioni designate su entrambi i lati della carta di cellulosa (Tabella dei materiali) utilizzando una stampante di cera...

<ol>
	<li>Edgar, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Q+&amp;+A:+What+are+exosomes,+exactly.">Q &amp; A: What are exosomes, exactly.</a> BMC Biology. 14 (1), 1-7 (2016).</li><li>Contreras-Naranjo, J. C., Wu, H. J., Ugaz, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics+for+exosome+isolation+and+analysis:+Enabling+liquid+biopsy+for+personalized+medicine.">Microfluidics for exosome isolation and analysis: Enabling liquid biopsy for personalized medicine.</a> Lab on a Chip. 17 (21), 3558-3577 (2017).</li><li>Simons, M., Raposo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+-+vesicular+carriers+for+intercellular+communication.">Exosomes - vesicular carriers for intercellular communication.</a> Current Opinion in Cell Biology. 21 (4), 575-581 (2009).</li><li>St&#229;hl, A. L., Johansson, K., Mossberg, M., Kahn, R., Karpman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+and+microvesicles+in+normal+physiology,+pathophysiology,+and+renal+diseases.">Exosomes and microvesicles in normal physiology, pathophysiology, and renal diseases.</a> Pediatric Nephrology. 34 (1), 11-30 (2019).</li><li>Chen, C., Lin, B. R., Hsu, M. Y., Cheng, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paper-based+devices+for+isolation+and+characterization+of+extracellular+vesicles.">Paper-based devices for isolation and characterization of extracellular vesicles.</a> Journal of Visualized Experiments. (98), e52722 (2015).</li><li>Kim, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origami-paper-based+device+for+microvesicle/exosome+preconcentration+and+isolation.">Origami-paper-based device for microvesicle/exosome preconcentration and isolation.</a> Lab on a Chip. 19 (23), 3917-3921 (2019).</li><li>Raposo, G., Stoorvogel, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles:+Exosomes,+microvesicles,+and+friends.">Extracellular vesicles: Exosomes, microvesicles, and friends.</a> Journal of Cell Biology. 200 (4), 373-383 (2013).</li><li>Lee, Y., El Andaloussi, S., Wood, M. J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+and+microvesicles:+Extracellular+vesicles+for+genetic+information+transfer+and+gene+therapy.">Exosomes and microvesicles: Extracellular vesicles for genetic information transfer and gene therapy.</a> Human Molecular Genetics. 21, 125-134 (2012).</li><li>Liu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Field-Free+Isolation+of+Exosomes+from+Extracellular+Vesicles+by+Microfluidic+Viscoelastic+Flows.">Field-Free Isolation of Exosomes from Extracellular Vesicles by Microfluidic Viscoelastic Flows.</a> ACS Nano. 11 (7), 6968-6976 (2017).</li><li>Marczak, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+isolation+and+preconcentration+of+exosomes+by+ion+concentration+polarization.">Simultaneous isolation and preconcentration of exosomes by ion concentration polarization.</a> Electrophoresis. 39 (15), 2029-2038 (2018).</li><li>Livshts, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+exosomes+by+differential+centrifugation:+Theoretical+analysis+of+a+commonly+used+protocol.">Isolation of exosomes by differential centrifugation: Theoretical analysis of a commonly used protocol.</a> Scientific Reports. 5, 1-14 (2015).</li><li>Chiriac&#242;, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lab-on-chip+for+exosomes+and+microvesicles+detection+and+characterization.">Lab-on-chip for exosomes and microvesicles detection and characterization.</a> Sensors. 18 (10), 3175 (2018).</li><li>Lobb, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+exosome+isolation+protocol+for+cell+culture+supernatant+and+human+plasma.">Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 4 (1), 1-11 (2015).</li><li>Taylor, D. D., Shah, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+of+isolating+extracellular+vesicles+impact+down-stream+analyses+of+their+cargoes.">Methods of isolating extracellular vesicles impact down-stream analyses of their cargoes.</a> Methods. 87, 3-10 (2015).</li><li>Han, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrokinetic+size-based+spatial+separation+of+micro/nanospheres+using+paper-based+3d+origami+preconcentrator.">Electrokinetic size-based spatial separation of micro/nanospheres using paper-based 3d origami preconcentrator.</a> Analytical Chemistry. 91 (16), 10744-10749 (2019).</li><li>Yeh, S. H., Chou, K. H., Yang, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sample+pre-concentration+with+high+enrichment+factors+at+a+fixed+location+in+paper-based+microfluidic+devices.">Sample pre-concentration with high enrichment factors at a fixed location in paper-based microfluidic devices.</a> Lab on a Chip. 16 (5), 925-931 (2016).</li></ol>

Anche se l'Exo-PAD è stato utilizzato con successo per l'arricchimento e l'isolamento di microvicoli ed esosomi, diversi punti critici devono essere attentamente considerati: 1) il tempo di incubazione del forno e la temperatura durante la preparazione del dispositivo, 2) tempo di elaborazione, 3) applicazione di tensione con diversi numeri di strato e diametri di area campione, e 4) l'applicabilità ai campioni clinici.
Il tempo di incubazione e la temperatura indicati nel protocollo sono co...

I microvescicoli e gli esosomi sono piccole vesciche a membrana che misurano rispettivamente 0,2 m e 30-200 nm. Essi sono secreti nell'ambiente extracellulare da diversi tipi di cellule1,2,3,4,5. Essi contengono informazioni sulle cellule parentali sotto forma di sottoinsiemi di DNA, mRNA, miRNA, proteine e lipidi, e circolano in tutto il corpo attraverso vari fluidi corporei come siero, plasma, urina, liquido cerebrospinale, liquido amniotico, e saliva6,7,8,9. Pertanto, le tecniche per un isolamento efficiente dei microviscoli e degli esosomi dai fluidi biologici possono fornire ampie opportunità nei campi della diagnosi, della prognosi e del monitoraggio in tempo reale della malattia, nonché nello sviluppo di nuove terapie.
Tuttavia, il metodo di isolamento convenzionale per microvicoli ed esosomi a base di ultracentrifugazione è estremamente dispendioso in termini di tempo e causa una significativa perdita e contaminazione del campione. Questo perché comporta diverse fasi ingombranti di pipettaggio e caricamento e lo scarto di vari reagenti con ultracentrifugazione ripetuta5,6,10,11,12.12 Inoltre, l'elevata sollecitazione di taglio indotta dall'ultracentrifugazione (100.000 x g)può causare il lisi fisico di microvessicoli ed esosomi, producendo bassi tassi di recupero (5-23%)6,13,14. Pertanto, è necessario sviluppare una tecnica di isolamento altamente efficiente e discreta per microvicoli ed esosomi per ridurre i danni e le perdite, ottenendo così tassi di recupero più elevati.
È stato sviluppato un dispositivo basato su origami (Exo-PAD) per un isolamento più semplice, più delicato ed altamente efficiente di microvescicoli ed esosomi6. Il design dell'Exo-PAD è una carta multipiegata con aree campione collegate in serie che diminuiscono gradualmente di diametro. La tecnica di polarizzazione della concentrazione di ioni (ICP), che è un fenomeno nano-elettrocinetico che preconcentra le biomolecole cariche, è stata integrata con questo design unico. L'utilizzo dell'Exo-PAD ha portato a un arricchimento quintuplicato dei microvessicoli e degli esosomi in strati specifici e al loro isolamento semplicemente aprendo il dispositivo. In questo articolo viene descritto in dettaglio Exo-PAD, dalla fabbricazione e il funzionamento complessivo del dispositivo all'analisi del relativo utilizzo, per illustrare il metodo e mostrare risultati rappresentativi6.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1356px;" width="1355">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:397px;">Ag/AgCl electrodes</td>
			<td style="width:207px;">A-M Systems, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">531500</td>
			<td style="width:633px;">0.15&#34; diameter</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Albumin from Bovine Serum (BSA), Alexa Fluor 594 conjugate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A13101</td>
			<td>BSA conjugated with Alexa Fluor 594 (Ex/Em: 590/617 nm)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Carbonate-Bicarbonate Buffer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C3041-50CAP</td>
			<td>Carbonate buffer</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">CorelDraw software (Coral Co., Canada)</td>
			<td>Corel Corporation</td>
			<td></td>
			<td>Printer software to define wax printing region</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ColorQube 8870</td>
			<td>Xerox Corporation</td>
			<td></td>
			<td>Wax printer</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Chromatography paper grade 1</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>3001-861</td>
			<td>Cellulose paper, dimension: 20 * 20 cm</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fluorescent-labeled exosome standards</td>
			<td>HansaBioMed Life Sciences, Ltd.</td>
			<td>HBM-F-PEP-100</td>
			<td>Exosome labeled with FITC (Ex/Em: 490/520 nm)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Keithley 2410 current/voltage source-meter</td>
			<td>Keithley Instruments, Inc.</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Current&#8211;voltage source measurement system</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Nafion perfluorinated resin solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>31175-20-9</td>
			<td>Permselective membrane, 20 wt.% in the mixture of lower aliphatic alcohols and water; contains 34% water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NanoSight LM10</td>
			<td>NanoSight Technology</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Nanoparticle tracking analysis (NTA) machine</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphate-buffered saline (PBS, pH7.4)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10010001</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

paper-based preconcentration and isolation of microvesicles and exosomes

I microvescoli e gli esosomi sono piccole vesciche membranose rilasciate nell'ambiente extracellulare e circolate in tutto il corpo. Poiché contengono varie biomolecole derivate dalle cellule parentali come DNA, mRNA, miRNA, proteine e lipidi, il loro arricchimento e isolamento sono passaggi critici per il loro sfruttamento come potenziali biomarcatori per applicazioni cliniche. Tuttavia, i metodi di isolamento convenzionali (ad esempio, l'ultracentrifuga) causano perdite e danni significativi ai microvescicoli e agli esosomi. Questi metodi richiedono anche più passaggi ripetitivi di ultracentrifugazione, carico e sprechezza dei reagenti. Questo articolo descrive un metodo dettagliato per fabbricare un dispositivo basato su origami (Exo-PAD) progettato per l'arricchimento efficace e l'isolamento di microvescicoli ed esosomi in modo semplice. Il design unico dell'Exo-PAD, costituito da strati multipiegati a fisarmonica con aree campione convergenti, è integrato con la tecnica di polarizzazione della concentrazione degli ioni, consentendo così l'arricchimento di cinque volte dei microvigli e degli esosomi su strati specifici. Inoltre, i microvescicoli arricchiti e gli esosomi sono isolati semplicemente dispiegando l'Exo-PAD.

Il tempo di funzionamento deve essere ottimizzato per ottenere il massimo rendimento di recupero dei microvessicoli arricchiti e degli esosomi. Tempo insufficiente non consente una sufficiente migrazione dei microvicoli e degli esosomi, che diminuisce l'arricchimento, mentre il tempo eccessivo deteriora la messa a fuoco spaziale e quindi disperde i migameni e gli esosomi. Così, attraverso la fase di ottimizzazione del tempo, è possibile identificare il massimo fattore di preconcentrazione di microvissicoli ed esosomi e...

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Paper-Based Preconcentration and Isolation of Microvesicles and Exosomes

Presentato è un protocollo per fabbricare un dispositivo cartaceo per l'arricchimento efficace e l'isolamento di microvescicoli ed esosomi.

Preconcentrazione su carta e isolamento di microvescicoli ed esosomi

Microvesicles and exosomes are small membranous vesicles released to the extracellular environment and circulated throughout the body. Because they ...

In questo protocollo, descriviamo un semplice metodo per fabbricare un dispositivo basato su carta chiamato XO Pad, progettato per l'arricchimento efficace in isolamento delle vescicole extracellulari. XO Pad è un semplice dispositivo in grado di pre-concentrare e isolare la vescicola extracellulare senza l'uso di sostanze chimiche o macchine di lavoro, mostrando al contempo tassi di recupero più elevati rispetto ai metodi convenzionali. Iniziare definendo l'area da stampare con il software della stampante.Il design dovrebbe avere 12 strati a cera in cui i diametri delle aree circolari del campione si restringono gradualmente da cinque a due millimetri. Quindi, stampare la cera idrofobica sulle regioni designate su entrambi i lati della carta di cellulosa. Posizionare la carta stampata in cera in un forno da laboratorio per 80 secondi a 120 gradi Celsius, quindi tagliare la carta stampata in cera con una fresa per realizzare singoli dispositivi XO Pad.Rilascia rispettivamente un cinque e due microlitri di membrana selettiva perm sulle aree campione nella maggior parte sinistra e destra della maggior parte degli strati. Posizionare gli strati codificati con la membrana selettiva perm su una piastra calda a 70 gradi Celsius per 30 minuti per evaporare il solvente. Quindi sigillare la superficie più esterna dello strato rivestito di fronte alla soluzione tampone con nastro sensibile alla pressione, lasciando un piccolo foro.Piegare il dispositivo XO Pad avanti e indietro lungo le linee bianche per collegare conver delicatamente tutte le aree campione. Pipettare 15 microlitri della microvesicola e del campione esosoma nelle aree del campione convergenti e attendere alcuni secondi per garantire una completa bagnatura. Posizionare due camere acriliche ad entrambe le estremità del pad XO e bloccarlo saldamente con piccole clip leganti per evitare lo svolgimento.Riempire le camere con 110 microlitri di 0,1X PBS e inserire due elettrodi d'argento. Quindi utilizzare un sistema di misurazione della sorgente di tensione di corrente per applicare 30 volt agli elettrodi per 20 minuti. Per isolare le microvesicelle ed esosomi arricchiti, separare il pad XO piegato dalle camere acriliche e aprire il dispositivo per isolare le particelle arricchite dagli altri strati.Perforare le aree campione negli strati otto e nove in cui le microvescicole e gli esosomi sono arricchiti per l'analisi a valle. È stato eseguito un saggio di migrazione time-lapse di microvesicelle ed esosomi etichettati fluorescentmente al fine di ottimizzare il tempo di funzionamento per il massimo recupero delle particelle arricchite. Le intensità di fluorescenza in tutte le aree campione sono state quantificate con il software ImageJ.Prima del processo di arricchimento, le microvesicelle e gli esosomi erano dispersi in tutte le aree campione con una graduale diminuzione dell'intensità. Dopo 10 minuti di elaborazione, le particelle migrarono elettro-cineticamente e una spina istantanea di pre-concentrazione apparve sullo strato sette. Quando il tempo ha raggiunto i 20 minuti, microvescicole ed esosomi erano fortemente focalizzati sugli strati otto e nove e arricchiti di cinque volte in base alle intensità di fluorescenza.L'integrità delle microvesicelle arricchite e degli esosomi nello strato otto è stata studiata con SEM. È stata inoltre analizzata la distribuzione delle dimensioni delle microvesicelle ed esosomi arricchiti.Successivamente, è stata analizzata l'effettiva concentrazione delle microvesicelle arricchite e degli esosomi sulle aree campione negli strati sei, otto e 10. Nello strato otto, le microvescicole e gli esosomi erano pre-concentrati di un fattore 5,58, ma non è stata osservata alcuna preconcentrzione evidente negli altri strati. Per garantire la riproducibilità di questa procedura, ha seguito con precisione il protocollo per il tempo e la temperatura di incubazione del forno durante la verifica del dispositivo e il tempo di funzionamento del dispositivo perché queste sono le condizioni ottimizzate.L'XO Pad può anche essere usato per separare e isolare la vescicola extracellulare da campioni ricchi di proteine, come siero o plasma, usando il tampone di carbonato. Questo protocollo può fornire uno strumento di preparazione efficiente e semplice, con le sue capacità di pre-concentrazione e isolamento necessarie per la ricerca clinica, come la diagnosi, la somministrazione di farmaci, l'immunoterapia e altre terapie.

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