Name: paper-based preconcentration and isolation of microvesicles and exosomes
Uploaded: 2020-04-29T15:00:00
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この研究は、韓国国立研究財団、グラントNRF-2018R1D1A1A09084044によって支援されました。J.H.リーは、2019年に光明大学からの研究助成金によって支援されました。キム・ヒエリンは、韓国産業振興機構(KIAT)が運営する韓国産業エネルギー省の「産業専門家コンピテンシー開発プログラム」の支援を受けました(No.P0002397、ウェアラブルスマートデバイスの産業コンバージェンスのためのHRDプログラム)。

1. デバイスの製造
<ol><li>プリンタソフトウェアを使用して用紙に印刷する領域を定義します ([資料一覧] )。 注:設計には12のワックスパターンの層があり、円形サンプル領域の直径は5mmから2mmに徐々に狭くなります(図1A)。</li>
	<li>セルロース紙の両面の指定領域に疎水性ワックスを印刷し、市販のワックスプリンタ(材料表)を使?...

<ol>
	<li>Edgar, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Q+&amp;+A:+What+are+exosomes,+exactly.">Q &amp; A: What are exosomes, exactly.</a> BMC Biology. 14 (1), 1-7 (2016).</li><li>Contreras-Naranjo, J. C., Wu, H. J., Ugaz, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics+for+exosome+isolation+and+analysis:+Enabling+liquid+biopsy+for+personalized+medicine.">Microfluidics for exosome isolation and analysis: Enabling liquid biopsy for personalized medicine.</a> Lab on a Chip. 17 (21), 3558-3577 (2017).</li><li>Simons, M., Raposo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+-+vesicular+carriers+for+intercellular+communication.">Exosomes - vesicular carriers for intercellular communication.</a> Current Opinion in Cell Biology. 21 (4), 575-581 (2009).</li><li>St&#229;hl, A. L., Johansson, K., Mossberg, M., Kahn, R., Karpman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+and+microvesicles+in+normal+physiology,+pathophysiology,+and+renal+diseases.">Exosomes and microvesicles in normal physiology, pathophysiology, and renal diseases.</a> Pediatric Nephrology. 34 (1), 11-30 (2019).</li><li>Chen, C., Lin, B. R., Hsu, M. Y., Cheng, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paper-based+devices+for+isolation+and+characterization+of+extracellular+vesicles.">Paper-based devices for isolation and characterization of extracellular vesicles.</a> Journal of Visualized Experiments. (98), e52722 (2015).</li><li>Kim, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origami-paper-based+device+for+microvesicle/exosome+preconcentration+and+isolation.">Origami-paper-based device for microvesicle/exosome preconcentration and isolation.</a> Lab on a Chip. 19 (23), 3917-3921 (2019).</li><li>Raposo, G., Stoorvogel, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles:+Exosomes,+microvesicles,+and+friends.">Extracellular vesicles: Exosomes, microvesicles, and friends.</a> Journal of Cell Biology. 200 (4), 373-383 (2013).</li><li>Lee, Y., El Andaloussi, S., Wood, M. J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+and+microvesicles:+Extracellular+vesicles+for+genetic+information+transfer+and+gene+therapy.">Exosomes and microvesicles: Extracellular vesicles for genetic information transfer and gene therapy.</a> Human Molecular Genetics. 21, 125-134 (2012).</li><li>Liu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Field-Free+Isolation+of+Exosomes+from+Extracellular+Vesicles+by+Microfluidic+Viscoelastic+Flows.">Field-Free Isolation of Exosomes from Extracellular Vesicles by Microfluidic Viscoelastic Flows.</a> ACS Nano. 11 (7), 6968-6976 (2017).</li><li>Marczak, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+isolation+and+preconcentration+of+exosomes+by+ion+concentration+polarization.">Simultaneous isolation and preconcentration of exosomes by ion concentration polarization.</a> Electrophoresis. 39 (15), 2029-2038 (2018).</li><li>Livshts, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+exosomes+by+differential+centrifugation:+Theoretical+analysis+of+a+commonly+used+protocol.">Isolation of exosomes by differential centrifugation: Theoretical analysis of a commonly used protocol.</a> Scientific Reports. 5, 1-14 (2015).</li><li>Chiriac&#242;, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lab-on-chip+for+exosomes+and+microvesicles+detection+and+characterization.">Lab-on-chip for exosomes and microvesicles detection and characterization.</a> Sensors. 18 (10), 3175 (2018).</li><li>Lobb, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+exosome+isolation+protocol+for+cell+culture+supernatant+and+human+plasma.">Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 4 (1), 1-11 (2015).</li><li>Taylor, D. D., Shah, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+of+isolating+extracellular+vesicles+impact+down-stream+analyses+of+their+cargoes.">Methods of isolating extracellular vesicles impact down-stream analyses of their cargoes.</a> Methods. 87, 3-10 (2015).</li><li>Han, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrokinetic+size-based+spatial+separation+of+micro/nanospheres+using+paper-based+3d+origami+preconcentrator.">Electrokinetic size-based spatial separation of micro/nanospheres using paper-based 3d origami preconcentrator.</a> Analytical Chemistry. 91 (16), 10744-10749 (2019).</li><li>Yeh, S. H., Chou, K. H., Yang, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sample+pre-concentration+with+high+enrichment+factors+at+a+fixed+location+in+paper-based+microfluidic+devices.">Sample pre-concentration with high enrichment factors at a fixed location in paper-based microfluidic devices.</a> Lab on a Chip. 16 (5), 925-931 (2016).</li></ol>

Exo-PADはマイクロベシクルおよびエキソソームの濃縮および分離のために正常に使用されましたが、いくつかの重要な点を慎重に検討する必要があります:1)デバイス調製中のオーブンインキュベーション時間と温度、2)処理時間、3)様々な層数とサンプル面積径の電圧の適用、および4)臨床サンプルへの適用性。
プロトコルで与えられたインキュベーション時間と温度は、?...

マイクロベシクルとエキソソームはそれぞれ0.2-1 μmと30-200 nmの小膜小胞です。それらは、いくつかの異なる,細胞タイプ1、2、3、4、52,3,によって細胞外環境に分泌される。145それらはDNA、mRNA、miRNA、タンパク質、および脂質のサブセットの形態の親の細胞情報を含み、血清、血漿、尿、脳脊髄液、羊水、唾液66、7、8、97,8,9のような様々な体液を介して全身を循環する。このように、生物学的流体からの微小胞およびエキソソームを効率的に単離する技術は、疾患の診断、予後、およびリアルタイムモニタリングの分野において、ならびに新しい治療薬の開発において広範な機会を提供することができる。
しかし、超遠心分離に基づくミクロベシクルおよびエキソソームの従来の分離法は非常に時間がかかり、サンプルの著しい損失および汚染を引き起こす。これは、超遠心,,,55、6、10、11、126を繰り返した様々な試薬の、いくつかの面倒なピペットとローディングステップと廃棄を伴うからです。101112また、超遠心分離(〜100,000 x g)によって引き起こされる高剪断応力は、微小胞およびエキソソームの物理的なリシスを引き起こし、回復率が低い(5−23%)6、13、14を生じる。6,13,14そのため、損傷や損失を低減するために、マイクロベシクルおよびエキソソームの非常に効率的で目立たない分離技術を開発し、より高い回収率を達成する必要があります。
折り紙ベースのデバイス (Exo-PAD) は、マイクロベシクルとエキソソームの分離を簡単に、より穏やかで、高効率に開発しました。Exo-PADの設計は、直径が徐々に減少する連続的に接続されたサンプル領域を有する多重折紙である。このユニークな設計と統合された、電位分子を事前濃縮するナノ電気運動現象であるイオン濃度偏光(ICP)技術。Exo-PADを使用すると、特定の層の微小胞とエキソソームの5倍の濃縮と、単にデバイスを展開するだけで分離しました。この記事では、Exo-PAD について詳細に説明し、デバイスの全体的な製造と操作からその使用の分析まで、その方法を説明し、代表的な結果6を示します。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1356px;" width="1355">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:397px;">Ag/AgCl electrodes</td>
			<td style="width:207px;">A-M Systems, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">531500</td>
			<td style="width:633px;">0.15&#34; diameter</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Albumin from Bovine Serum (BSA), Alexa Fluor 594 conjugate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A13101</td>
			<td>BSA conjugated with Alexa Fluor 594 (Ex/Em: 590/617 nm)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Carbonate-Bicarbonate Buffer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C3041-50CAP</td>
			<td>Carbonate buffer</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">CorelDraw software (Coral Co., Canada)</td>
			<td>Corel Corporation</td>
			<td></td>
			<td>Printer software to define wax printing region</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ColorQube 8870</td>
			<td>Xerox Corporation</td>
			<td></td>
			<td>Wax printer</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Chromatography paper grade 1</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>3001-861</td>
			<td>Cellulose paper, dimension: 20 * 20 cm</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fluorescent-labeled exosome standards</td>
			<td>HansaBioMed Life Sciences, Ltd.</td>
			<td>HBM-F-PEP-100</td>
			<td>Exosome labeled with FITC (Ex/Em: 490/520 nm)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Keithley 2410 current/voltage source-meter</td>
			<td>Keithley Instruments, Inc.</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Current&#8211;voltage source measurement system</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Nafion perfluorinated resin solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>31175-20-9</td>
			<td>Permselective membrane, 20 wt.% in the mixture of lower aliphatic alcohols and water; contains 34% water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NanoSight LM10</td>
			<td>NanoSight Technology</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Nanoparticle tracking analysis (NTA) machine</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphate-buffered saline (PBS, pH7.4)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10010001</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

paper-based preconcentration and isolation of microvesicles and exosomes

マイクロベシクルおよびエキソソームは、細胞外環境に放出され、全身に循環する小さな膜小胞である。DNA、mRNA、miRNA、タンパク質、脂質などの様々な親の細胞由来生体分子が含まれているため、その濃縮と単離は、臨床応用の潜在的なバイオマーカーとしての活用に不可欠なステップです。しかしながら、従来の分離法(例えば、超遠心分離)は、微小胞およびエキソソームに重大な損失および損傷を引き起こす。これらの方法では、試薬の超遠心、荷重、および無駄の複数の繰り返しステップが必要です。本稿では、マイクロベシクルとエキソソームの効果的な濃縮と分離を簡単に行えるように設計された折り紙ベースのデバイス(Exo-PAD)を製造するための詳細な方法について説明します。収束したサンプル領域を持つアコーディオンのような多折層からなるExo-PADのユニークなデザインは、イオン濃度偏光技術と統合され、それによって特定の層上の微小胞およびエキソソームの5倍の濃縮を可能にする。さらに、濃縮されたマイクロベシクルとエキソソームは、単にExo-PADを展開することによって分離されます。

濃縮されたマイクロベシクルおよびエキソソームの最大の回収率を達成するために、操作時間を最適化する必要があります。時間が不十分なため、微小胞やエキソソームの十分な移動が可能で、富化が低下するのに対し、過度の時間は空間的な集着を悪化させ、したがって微小胞およびエキソソームを分散させる。したがって、時間最適化ステップを通じて、マイクロベシクルとエキソソー?...

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Paper-Based Preconcentration and Isolation of Microvesicles and Exosomes

提示は、マイクロベシクルおよびエキソソームの効果的な濃縮および分離のための紙ベースのデバイスを製造するためのプロトコルです。

マイクロベシクルとエキソソームのペーパーベースの事前濃縮と分離

Microvesicles and exosomes are small membranous vesicles released to the extracellular environment and circulated throughout the body. Because they ...

このプロトコルでは、細胞外小胞を分離して効果的な濃縮のために設計されたXO Padと呼ばれる紙ベースのデバイスを製造する簡単な方法を説明する。XO Padは、従来の方法よりも高い回収率を示しながら、化学物質や作業機械を使用せずに細胞外小胞を事前濃縮し、単離することができるシンプルなデバイスです。まず、印刷する領域をプリンタ ソフトウェアで定義します。設計は、円形のサンプル領域の直径が徐々に5ミリメートルから2ミリメートルに狭い12のワックスパターンの層を持っている必要があります。次に、セルロース紙の両側の指定領域に疎水性ワックスを印刷する。ワックスプリント紙を120°Cで80秒間実験室のオーブンに入れ、ワックスプリント紙をカッターで切って個々のXOパッドデバイスを作ります。5マイクロリットルと2マイクロリットルのパーマ選択的膜を、最も左と右のほとんどの層のサンプル領域にそれぞれ落とします。パーマ選択膜でコード化された層をホットプレートの上に摂氏70度で30分間置き、溶媒を蒸発させます。次に、緩衝液に面したコーティングされた層の最表面を感圧テープで密封し、小さな穴を残します。XO Pad デバイスを白線に沿って前後に折り、すべてのサンプル領域を収束的に接続します。収束サンプル領域のミクロベシクルおよびエキソソームサンプルのピペット15マイクロリットルを、完全な湿潤を確実にするために数秒待ちます。XOパッドの両端に2つのアクリルチャンバーを置き、展開を防ぐために小さなバインダークリップでしっかりとクランプします。0.1X PBSの110マイクロリットルでチャンバーを充填し、2つの銀電極を挿入します。次に、電流電圧源測定システムを使用して、30ボルトを電極に20分間塗布します。濃縮されたマイクロベシクルとエキソソームを分離するには、折り畳まれたXOパッドをアクリルチャンバーから分離し、デバイスを展開して濃縮された粒子を他の層から分離します。マイクロベシクルとエキソソームが下流解析のために濃縮されるレイヤー 8 と 9 のサンプル領域をパンチアウトします。蛍光標識されたマイクロベシクルおよびエキソソームのタイムラプス移行アッセイを実施し、濃縮粒子の最大回収のための動作時間を最適化した。全てのサンプル領域の蛍光強度をImageJソフトウェアで定量化した。濃縮プロセスの前に、マイクロベシクルおよびエキソソームは、強度の緩やかな減少を伴うすべてのサンプル領域に分散した。10分間の処理の後、粒子は電気キネテニックに移動し、即刻の事前濃度プラグが層7に現れた。20分に達すると、マイクロベシクルとエキソソームは8層と9層に強く焦点を当て、蛍光強度に基づいて5倍に濃縮された。8層の濃縮された微小胞およびエキソソームの完全性をSEMで調べた。濃縮された微小胞およびエキソソームのサイズ分布も分析した。続いて、6層、8層、10層のサンプル領域上の濃縮された微小胞およびエキソソームの実際の濃度を分析した。層8では、ミクロベシクルとエキソソームは5.58倍の予め濃縮されたが、他の層では顕著な前濃度は認められなかった。この手順の再現性を確保するために、デバイス検証時およびデバイスの動作時間が最適化された条件であるため、オーブンインキュベーション時間と温度のプロトコルに正確に従った。XOパッドは、炭酸塩バッファーを使用して、血清や血漿などのタンパク質が豊富なサンプルから細胞外小胞を分離および分離するためにも使用できます。このプロトコルは、診断、薬物送達、免疫療法、および他の治療などの臨床研究に必要な濃縮および分離機能を備えた効率的で簡単な準備ツールを提供することができます。

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Identification of Plant Ice-binding Proteins Through Assessment of Ice-recrystallization Inhibition and Isolation Using Ice-affinity Purification

アイスアフィニティー精製を用いた氷再結晶阻害とアイソレーションの評価による植物の氷結合タンパク質の同定

Ice-binding proteins (IBPs) belong to a family of stress-induced proteins that are synthesized by certain organisms exposed to subzero temperatures. In ...

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

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分離とシロイヌナズナ由来のミトコンドリアの呼吸測定

Mitochondria are essential organelles involved in numerous metabolic pathways in plants, most notably the production of adenosine triphosphate (ATP) from ...

Protein Digestion, Ultrafiltration, and Size Exclusion Chromatography to Optimize the Isolation of Exosomes from Human Blood Plasma and Serum

エクソソームおよび人間の血液からの分離を最適化するためにタンパク質の消化が、限外濾過、サイズ排除クロマトグラフィー

Exosomes, a type of nanovesicle released from all cell types, can be isolated from any bodily fluid. The contents of exosomes, including proteins and ...

Rapid Isolation of the Mitoribosome from HEK Cells

HEK 細胞から Mitoribosome の急速な隔離

The human mitochondria possess a dedicated set of ribosomes (mitoribosomes) that translate 13 essential protein components of the oxidative ...

Detection and Isolation of Apoptotic Bodies to High Purity

高純度にアポトーシス小体の検出と分離

Apoptotic bodies (ApoBDs), microvesicles and exosomes are the key members of the extracellular vesicle family, with ApoBDs being one of the largest type. ...

Isolation of Physiologically Active Thylakoids and Their Use in Energy-Dependent Protein Transport Assays

生理活性とエネルギー依存性タンパク質輸送アッセイでの使用の分離

Chloroplasts are the organelles in green plants responsible for carrying out numerous essential metabolic pathways, most notably photosynthesis. Within ...

Isolation of Glomeruli and In Vivo Labeling of Glomerular Cell Surface Proteins

Isolation of Glomeruli and In Vivo Labeling of Glomerular Cell Surface Proteins

腎糸球体と腎糸球体細胞表面タンパク質の標識体内の分離

Proteinuria results from the disruption of the glomerular filter that is composed of the fenestrated endothelium, glomerular basement membrane, and ...

Looking Outwards: Isolation of Cyanobacterial Released Carbohydrate Polymers and Proteins

外向きに見る:シアノバクテリア放出炭水化物ポリマーとタンパク質の単離

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Isolation and Analysis of Plasma Lipoproteins by Ultracentrifugation

超遠心分離による血漿リポタンパク質の単離と分析

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Isolation of Active Caenorhabditis elegans Nuclear Extract and Reconstitution for In Vitro Transcription

Isolation of Active Caenorhabditis elegans Nuclear Extract and Reconstitution for In Vitro Transcription

能動 カエノハブディティス・エレガンス 核抽出物の分離と インビトロ 転写のための再構成

Caenorhabditis elegans has been an important model system for biological research since it was introduced in 1963. However, C. elegans has not been fully ...