Name: paper-based preconcentration and isolation of microvesicles and exosomes
Uploaded: 2020-04-29T15:00:00
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이 연구는 한국 국립연구재단인 그랜트 NRF-2018R1D1A09090840444가 지원했다. 이준은 2019년 광운대학교 연구보조금의 지원을 받았다. 김효린 은 한국과학기술원(KIAT)이 운영하는 산업통상자원부(MOTIE)의 '산업전문가를 위한 역량개발 프로그램'의 지원을 받았다. P0002397, 웨어러블 스마트 기기의 산업 융합을 위한 HRD 프로그램).

1. 장치 제작
<ol><li>프린터 소프트웨어(재료 표)를 사용하여 종이에 인쇄할영역을 정의합니다. 참고: 원형 샘플 영역의 직경이 5mm에서 2mm(그림1A)로점차 좁아진 12개의 왁스 패턴 레이어가 설계되어 있습니다.</li>
	<li>상업용 왁스 프린터(재료 표)를 이용하여 셀룰로오스용지(재료표)의양면에 지정된 부위에 소수성 왁스를인쇄한다(도<s...

<ol>
	<li>Edgar, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Q+&amp;+A:+What+are+exosomes,+exactly.">Q &amp; A: What are exosomes, exactly.</a> BMC Biology. 14 (1), 1-7 (2016).</li><li>Contreras-Naranjo, J. C., Wu, H. J., Ugaz, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics+for+exosome+isolation+and+analysis:+Enabling+liquid+biopsy+for+personalized+medicine.">Microfluidics for exosome isolation and analysis: Enabling liquid biopsy for personalized medicine.</a> Lab on a Chip. 17 (21), 3558-3577 (2017).</li><li>Simons, M., Raposo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+-+vesicular+carriers+for+intercellular+communication.">Exosomes - vesicular carriers for intercellular communication.</a> Current Opinion in Cell Biology. 21 (4), 575-581 (2009).</li><li>St&#229;hl, A. L., Johansson, K., Mossberg, M., Kahn, R., Karpman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+and+microvesicles+in+normal+physiology,+pathophysiology,+and+renal+diseases.">Exosomes and microvesicles in normal physiology, pathophysiology, and renal diseases.</a> Pediatric Nephrology. 34 (1), 11-30 (2019).</li><li>Chen, C., Lin, B. R., Hsu, M. Y., Cheng, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paper-based+devices+for+isolation+and+characterization+of+extracellular+vesicles.">Paper-based devices for isolation and characterization of extracellular vesicles.</a> Journal of Visualized Experiments. (98), e52722 (2015).</li><li>Kim, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origami-paper-based+device+for+microvesicle/exosome+preconcentration+and+isolation.">Origami-paper-based device for microvesicle/exosome preconcentration and isolation.</a> Lab on a Chip. 19 (23), 3917-3921 (2019).</li><li>Raposo, G., Stoorvogel, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles:+Exosomes,+microvesicles,+and+friends.">Extracellular vesicles: Exosomes, microvesicles, and friends.</a> Journal of Cell Biology. 200 (4), 373-383 (2013).</li><li>Lee, Y., El Andaloussi, S., Wood, M. J. 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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+exosomes+by+differential+centrifugation:+Theoretical+analysis+of+a+commonly+used+protocol.">Isolation of exosomes by differential centrifugation: Theoretical analysis of a commonly used protocol.</a> Scientific Reports. 5, 1-14 (2015).</li><li>Chiriac&#242;, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lab-on-chip+for+exosomes+and+microvesicles+detection+and+characterization.">Lab-on-chip for exosomes and microvesicles detection and characterization.</a> Sensors. 18 (10), 3175 (2018).</li><li>Lobb, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+exosome+isolation+protocol+for+cell+culture+supernatant+and+human+plasma.">Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 4 (1), 1-11 (2015).</li><li>Taylor, D. D., Shah, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+of+isolating+extracellular+vesicles+impact+down-stream+analyses+of+their+cargoes.">Methods of isolating extracellular vesicles impact down-stream analyses of their cargoes.</a> Methods. 87, 3-10 (2015).</li><li>Han, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrokinetic+size-based+spatial+separation+of+micro/nanospheres+using+paper-based+3d+origami+preconcentrator.">Electrokinetic size-based spatial separation of micro/nanospheres using paper-based 3d origami preconcentrator.</a> Analytical Chemistry. 91 (16), 10744-10749 (2019).</li><li>Yeh, S. H., Chou, K. H., Yang, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sample+pre-concentration+with+high+enrichment+factors+at+a+fixed+location+in+paper-based+microfluidic+devices.">Sample pre-concentration with high enrichment factors at a fixed location in paper-based microfluidic devices.</a> Lab on a Chip. 16 (5), 925-931 (2016).</li></ol>

엑소-PAD는 마이크로베실과 외종의 농축 및 절연을 위해 성공적으로 사용되었지만, 여러 가지 중요한 점은 신중하게 고려해야 합니다: 1) 장치 제조 중 오븐 잠복기 시간과 온도, 2) 처리 시간, 3) 다양한 층 수와 샘플 영역 직경을 가진 전압의 적용, 그리고 4) 임상 샘플에 대한 적용가능성.
프로토콜에 주어진 인큐베이션 시간과 온도는 신뢰할 수 있는 장치를 조작하는 데 최적화...

마이크로베식과 엑소좀은 각각 0.2-1 μm 및 30-200 nm를 측정하는 작은 멤브레인 소포입니다. 그(것)들은 몇몇 다른 세포,모형1,,2,3,,4,5에의해 세포 외 환경으로 분비됩니다., 그들은 DNA, mRNA, miRNA, 단백질 및 지질의 하위 집합의 형태로 부모 세포 정보를 포함하고, 혈청, 혈장, 소변, 뇌척수액, 양수 및 타액6,,7,,8,,9와같은 다양한 체액을 통해 신체 전체를 순환한다. 따라서, 생물학적 유체로부터 미생물과 외종의 효율적인 분리를 위한 기술은 새로운 치료법의 개발뿐만 아니라 질병의 진단, 예후 및 실시간 모니터링 분야에서 광범위한 기회를 제공할 수 있다.
그러나, 초원심분리에 기초한 마이크로베실 및 엑소좀에 대한 종래의 절연 방법은 매우 시간이 많이 소요되고 시료의 상당한 손실 및 오염을 야기한다. 이는 여러 번거로운 파이펫팅 및 적재 단계와 반복된 초원심,분리5,6,,10,11,,12를포함하는 다양한 시약의 폐기를 수반하기 때문이다., 더욱이, 초원심심분리(~100,000 x g)에의해 유도되는 높은 전단 응력은 미생물과 외종의 물리적 용해를 유발하여 회복율(5-23%)6,,13,,14를산출할 수 있다. 따라서, 마이크로베식및 엑소좀을 위한 매우 효율적이고 눈에 거슬리지 않는 격리 기술은 손상과 손실을 줄이기 위해 개발되어야 하므로 더 높은 회수율을 달성해야 합니다.
종이 접기 종이 기반 장치 (엑소-PAD)는 마이크로베실과 엑소좀6의간단하고 온화하며 매우 효율적인 격리를 위해 개발되었습니다. 엑소-PAD의 디자인은 지름이 점차 감소하는 일련 적으로 연결된 샘플 영역이 있는 다중 접힌 종이입니다. 이온 농도 편광(ICP) 기술은 전농축이 전하된 생체분자를 전하하는 나노 전기키네틱 현상이며, 이 독특한 설계와 통합되었다. Exo-PAD를 사용하면 특정 층에서 마이크로베식과 엑소좀이 5배 농축되고 장치를 전개하기만 하면 격리가 발생했습니다. 이 문서에서는 엑소-PAD를 자세히 설명하며, 전체 장치 제조 및 작동에서 사용 분석에 이르기까지 방법을 설명하고 대표적인 결과를 보여주는 6을설명한다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1356px;" width="1355">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:397px;">Ag/AgCl electrodes</td>
			<td style="width:207px;">A-M Systems, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">531500</td>
			<td style="width:633px;">0.15&#34; diameter</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Albumin from Bovine Serum (BSA), Alexa Fluor 594 conjugate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A13101</td>
			<td>BSA conjugated with Alexa Fluor 594 (Ex/Em: 590/617 nm)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Carbonate-Bicarbonate Buffer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C3041-50CAP</td>
			<td>Carbonate buffer</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">CorelDraw software (Coral Co., Canada)</td>
			<td>Corel Corporation</td>
			<td></td>
			<td>Printer software to define wax printing region</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ColorQube 8870</td>
			<td>Xerox Corporation</td>
			<td></td>
			<td>Wax printer</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Chromatography paper grade 1</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>3001-861</td>
			<td>Cellulose paper, dimension: 20 * 20 cm</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fluorescent-labeled exosome standards</td>
			<td>HansaBioMed Life Sciences, Ltd.</td>
			<td>HBM-F-PEP-100</td>
			<td>Exosome labeled with FITC (Ex/Em: 490/520 nm)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Keithley 2410 current/voltage source-meter</td>
			<td>Keithley Instruments, Inc.</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Current&#8211;voltage source measurement system</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Nafion perfluorinated resin solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>31175-20-9</td>
			<td>Permselective membrane, 20 wt.% in the mixture of lower aliphatic alcohols and water; contains 34% water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NanoSight LM10</td>
			<td>NanoSight Technology</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Nanoparticle tracking analysis (NTA) machine</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphate-buffered saline (PBS, pH7.4)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10010001</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

paper-based preconcentration and isolation of microvesicles and exosomes

Microvesicles 및 엑소좀은 세포 외 환경에 풀어 놓이고 바디를 통해 순환하는 작은 membranous 소포입니다. DNA, mRNA, miRNA, 단백질 및 지질과 같은 다양한 부모 세포 유래 생체 분자를 함유하고 있기 때문에, 그들의 농축 및 격리는 임상 응용을 위한 잠재적인 바이오마커로서 그들의 착취를 위한 중요한 단계입니다. 그러나, 종래의 절연 방법(예를 들어, 초원심분리)은 마이크로베실 및 엑소좀에 상당한 손실과 손상을 일으킨다. 또한 이러한 방법은 시약의 초원심 분리, 적재 및 낭비의 여러 반복 단계가 필요합니다. 이 문서에서는 간단한 방식으로 미세 채소와 외종의 효과적인 농축 및 절연을 위해 설계된 종이 접기 종이 기반 장치 (엑소-PAD)를 제조하는 상세한 방법을 설명합니다. 수렴 시료 영역이 있는 아코디언형 다층으로 구성된 엑소-PAD의 독특한 디자인은 이온 농도 편광 기술과 통합되어 특정 층에서 마이크로베실과 외종의 5배 농축을 가능하게 한다. 또한, 농축된 마이크로베실과 엑소솜은 엑소-PAD를 펼치기만 하면 격리된다.

농축 된 미생물 및 엑소좀의 최대 회수 율을 달성하기 위해 작동 시간을 최적화해야합니다. 시간이 부족하여 농축을 감소시키는 마이크로베식과 엑소좀의 충분한 이동을 허용하지 않는 반면, 과도한 시간은 공간 초점을 악화시키고 따라서 미세 채소와 외식을 분산시합니다. 따라서 시간 최적화 단계를 통해, 마이크로베식및 엑소좀의 최대 전농도 계수와 마이크로베실과 엑소좀이 가장 농축되는 ...

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Paper-Based Preconcentration and Isolation of Microvesicles and Exosomes

제시된 것은 미생물과 외종의 효과적인 농축 및 격리를 위한 종이 기반 장치를 제조하는 프로토콜이다.

마이크로베식및 엑소좀의 종이 기반 전농도 및 격리

Microvesicles and exosomes are small membranous vesicles released to the extracellular environment and circulated throughout the body. Because they ...

이 프로토콜에서는 세포외 소포를 분리하는 효과적인 농축을 위해 설계된 XO Pad라는 종이 기반 장치를 제조하는 간단한 방법을 설명합니다. XO 패드는 화학 물질이나 작업 기계를 사용하지 않고 세포 외 소포를 미리 농축하고 분리할 수 있는 간단한 장치이며, 기존의 방법보다 더 높은 회수율을 보이고 있습니다. 먼저 프린터 소프트웨어로 인쇄할 영역을 정의합니다.설계에는 원형 샘플 영역의 직경이 5밀리미터에서 2밀리미터로 점차 좁아진 12개의 왁스 패턴 레이어가 있어야 합니다. 그런 다음 셀룰로오스 용지의 양쪽에 지정된 부위에 소수성 왁스를 인쇄합니다. 왁스 인쇄 용지를 실험실 오븐에 섭씨 120도에서 80초 동안 놓고 왁스 인쇄 용지를 커터로 잘라 개별 XO Pad 장치를 만듭니다.파마 선택적 멤브레인의 5및 2 마이크로리터를 각각 왼쪽 대부분 및 오른쪽 대부분의 층의 샘플 영역에 놓습니다. 용매를 증발시키기 위해 30분 동안 온전한 플레이트에 파마 선택 멤브레인으로 코딩된 층을 30분간 섭씨 70도에 놓습니다. 그런 다음 버퍼 용액을 향하는 코팅된 층의 가장 바깥쪽 표면을 압력에 민감한 테이프로 밀봉하여 작은 구멍을 남깁니다.XO 패드 장치를 흰색 선을 따라 앞뒤로 접어 모든 샘플 영역을 수렴합니다. 수렴 샘플 영역에서 마이크로베식 및 외식 샘플의 피펫 15 마이크로리터와 완전한 습윤을 보장하기 위해 몇 초 정도 기다립니다. XO 패드의 양쪽 끝에 두 개의 아크릴 챔버를 놓고 작은 바인더 클립으로 단단히 고정하여 전개를 방지합니다.0.1X PBS의 110 마이크로리터로 챔버를 채우고 두 개의 은 전극을 삽입합니다. 그런 다음 전류 전압 소스 측정 시스템을 사용하여 20 분 동안 전극에 30 볼트를 적용하십시오. 농축된 마이크로베실과 외종기를 분리하기 위해 접힌 XO 패드를 아크릴 챔버에서 분리하고 장치를 전개하여 농축된 입자를 다른 층으로부터 분리한다.마이크로베실과 엑소좀이 다운스트림 분석을 위해 농축되는 8층과 9층의 샘플 영역을 펀치합니다. 농축된 입자의 최대 회수를 위해 작동 시간을 최적화하기 위해 형광으로 표지된 마이크로베시클 및 엑소좀의 시간 경과 이동 분석이 수행되었다. 모든 샘플 영역의 형광 강도는 ImageJ 소프트웨어로 정량화되었습니다.농축 공정 전에, 마이크로베실과 엑소좀은 강도의 점진적인 감소와 모든 견본 지역에 분산되었다. 10분간의 처리 후, 입자는 전기 키네틱으로 이동했고, 7층에는 즉각적인 사전 농도 플러그가 나타났다. 시간이 20분에 이르렀을 때, 마이크로베실과 엑소좀은 8층과 9층에 강하게 초점을 맞추고 형광 강도에 기초하여 5배 농축되었다.농축 된 미생물및 외종의 무결성은 SEM으로 조사되었다. 농축된 미생물및 엑소좀의 크기 분포도 분석되었다.이어서, 6층, 8층, 10층의 샘플 영역에 농축된 미생물 및 엑소좀의 실제 농도를 분석하였다. 8층에서는, 마이크로베실과 엑소좀은 5.58의 요인에 의해 미리 집중되었지만, 다른 층에서는 눈에 띄는 사전 농도가 관찰되지 않았다. 이 절차의 재현성을 보장하기 위해 최적화된 조건이므로 장치 검증 및 장치 작동 시간 동안 오븐 인큐베이션 시간과 온도에 대한 프로토콜을 정확하게 따랐습니다.XO 패드는 탄산염 버퍼를 사용하여 혈청 이나 혈장과 같은 단백질이 풍부한 샘플에서 세포 외 소포를 분리하고 분리하는 데 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜은 진단, 약물 전달, 면역 요법 및 기타 치료와 같은 임상 연구에 필요한 사전 집중 및 격리 기능을 갖춘 효율적이고 간단한 준비 도구를 제공할 수 있습니다.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Identification of Plant Ice-binding Proteins Through Assessment of Ice-recrystallization Inhibition and Isolation Using Ice-affinity Purification

식물은 아이스 친화 정제를 사용하여 얼음의 재결정 억제 및 절연의 평가를 통해 단백질을 아이스 결합의 식별

Ice-binding proteins (IBPs) belong to a family of stress-induced proteins that are synthesized by certain organisms exposed to subzero temperatures. In ...

연구

생화학

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

절연 및 호흡 측정의 미토 콘 드리 아 애기 thaliana 에서

Mitochondria are essential organelles involved in numerous metabolic pathways in plants, most notably the production of adenosine triphosphate (ATP) from ...

Protein Digestion, Ultrafiltration, and Size Exclusion Chromatography to Optimize the Isolation of Exosomes from Human Blood Plasma and Serum

단백질 소화, 한, 및 크기 배제 크로마토그래피 인간의 혈장 및 혈 청에서 Exosomes의 절연을 최적화 하

Exosomes, a type of nanovesicle released from all cell types, can be isolated from any bodily fluid. The contents of exosomes, including proteins and ...

Rapid Isolation of the Mitoribosome from HEK Cells

HEK 세포에서 Mitoribosome의 신속한 격리

The human mitochondria possess a dedicated set of ribosomes (mitoribosomes) that translate 13 essential protein components of the oxidative ...

Detection and Isolation of Apoptotic Bodies to High Purity

검색 및 Apoptotic 몸 높은 순도 절연

Apoptotic bodies (ApoBDs), microvesicles and exosomes are the key members of the extracellular vesicle family, with ApoBDs being one of the largest type. ...

Isolation of Physiologically Active Thylakoids and Their Use in Energy-Dependent Protein Transport Assays

생리 적으로 활성 Thylakoids 및 에너지 의존 단백질 수송 분석 실험에 있는 그들의 사용의 격리

Chloroplasts are the organelles in green plants responsible for carrying out numerous essential metabolic pathways, most notably photosynthesis. Within ...

Isolation of Glomeruli and In Vivo Labeling of Glomerular Cell Surface Proteins

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절연 Glomeruli와 비보에 사 세포 표면 단백질의 라벨

Proteinuria results from the disruption of the glomerular filter that is composed of the fenestrated endothelium, glomerular basement membrane, and ...

Looking Outwards: Isolation of Cyanobacterial Released Carbohydrate Polymers and Proteins

바깥쪽을 바라보며: 시안박테리아 방출 탄수화물 고분자 및 단백질 의 분리

Cyanobacteria can actively secrete a wide range of biomolecules into the extracellular environment, such as heteropolysaccharides and proteins. The ...

Isolation and Analysis of Plasma Lipoproteins by Ultracentrifugation

극심분리에 의한 혈장 지단백질의 격리 및 분석

Analysis of plasma lipoproteins and apolipoproteins is an essential part for the diagnosis of dyslipidemia and studies of lipid metabolism and ...

Isolation of Active Caenorhabditis elegans Nuclear Extract and Reconstitution for In Vitro Transcription

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생체외 전사에 대한 활성 Caenorhabditis elegans 핵 추출물 및 재구성의 고립

Caenorhabditis elegans has been an important model system for biological research since it was introduced in 1963. However, C. elegans has not been fully ...