Name: paper-based preconcentration and isolation of microvesicles and exosomes
Uploaded: 2020-04-29T15:00:00
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Este estudo foi apoiado pela Fundação Nacional de Pesquisa da Coreia, Grant NRF-2018R1D1A1A09084044. J. H. Lee foi apoiado por uma bolsa de pesquisa da Universidade Kwangwoon em 2019. Hyerin Kim foi apoiada pelo "Programa de Desenvolvimento de Competências para Especialistas da Indústria" do Ministério do Comércio, Indústria e Energia da Coreia (MOTIE), operado pelo Korea Institute for Advancement of Technology (KIAT) (No. P0002397, programa HRD para Convergência Industrial de Dispositivos Inteligentes Vestíveis).

1. Fabricação de dispositivos
<ol><li>Defina a região a ser impressa em papel usando software de impressora(Tabela de Materiais). NOTA: O desenho possui 12 camadas padrão de cera nas quais os diâmetros das áreas de amostra circular gradualmente diminuem de 5 mm a 2 mm(Figura 1A).</li>
	<li>Imprima cera hidrofóbica nas regiões designadas em ambos os lados do papel de celulose(Tabela de Materiais)utilizando uma impressora de cera comercial...

<ol>
	<li>Edgar, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Q+&amp;+A:+What+are+exosomes,+exactly.">Q &amp; A: What are exosomes, exactly.</a> BMC Biology. 14 (1), 1-7 (2016).</li><li>Contreras-Naranjo, J. C., Wu, H. J., Ugaz, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics+for+exosome+isolation+and+analysis:+Enabling+liquid+biopsy+for+personalized+medicine.">Microfluidics for exosome isolation and analysis: Enabling liquid biopsy for personalized medicine.</a> Lab on a Chip. 17 (21), 3558-3577 (2017).</li><li>Simons, M., Raposo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+-+vesicular+carriers+for+intercellular+communication.">Exosomes - vesicular carriers for intercellular communication.</a> Current Opinion in Cell Biology. 21 (4), 575-581 (2009).</li><li>St&#229;hl, A. L., Johansson, K., Mossberg, M., Kahn, R., Karpman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+and+microvesicles+in+normal+physiology,+pathophysiology,+and+renal+diseases.">Exosomes and microvesicles in normal physiology, pathophysiology, and renal diseases.</a> Pediatric Nephrology. 34 (1), 11-30 (2019).</li><li>Chen, C., Lin, B. R., Hsu, M. Y., Cheng, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paper-based+devices+for+isolation+and+characterization+of+extracellular+vesicles.">Paper-based devices for isolation and characterization of extracellular vesicles.</a> Journal of Visualized Experiments. (98), e52722 (2015).</li><li>Kim, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origami-paper-based+device+for+microvesicle/exosome+preconcentration+and+isolation.">Origami-paper-based device for microvesicle/exosome preconcentration and isolation.</a> Lab on a Chip. 19 (23), 3917-3921 (2019).</li><li>Raposo, G., Stoorvogel, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles:+Exosomes,+microvesicles,+and+friends.">Extracellular vesicles: Exosomes, microvesicles, and friends.</a> Journal of Cell Biology. 200 (4), 373-383 (2013).</li><li>Lee, Y., El Andaloussi, S., Wood, M. J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+and+microvesicles:+Extracellular+vesicles+for+genetic+information+transfer+and+gene+therapy.">Exosomes and microvesicles: Extracellular vesicles for genetic information transfer and gene therapy.</a> Human Molecular Genetics. 21, 125-134 (2012).</li><li>Liu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Field-Free+Isolation+of+Exosomes+from+Extracellular+Vesicles+by+Microfluidic+Viscoelastic+Flows.">Field-Free Isolation of Exosomes from Extracellular Vesicles by Microfluidic Viscoelastic Flows.</a> ACS Nano. 11 (7), 6968-6976 (2017).</li><li>Marczak, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+isolation+and+preconcentration+of+exosomes+by+ion+concentration+polarization.">Simultaneous isolation and preconcentration of exosomes by ion concentration polarization.</a> Electrophoresis. 39 (15), 2029-2038 (2018).</li><li>Livshts, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+exosomes+by+differential+centrifugation:+Theoretical+analysis+of+a+commonly+used+protocol.">Isolation of exosomes by differential centrifugation: Theoretical analysis of a commonly used protocol.</a> Scientific Reports. 5, 1-14 (2015).</li><li>Chiriac&#242;, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lab-on-chip+for+exosomes+and+microvesicles+detection+and+characterization.">Lab-on-chip for exosomes and microvesicles detection and characterization.</a> Sensors. 18 (10), 3175 (2018).</li><li>Lobb, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+exosome+isolation+protocol+for+cell+culture+supernatant+and+human+plasma.">Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 4 (1), 1-11 (2015).</li><li>Taylor, D. D., Shah, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+of+isolating+extracellular+vesicles+impact+down-stream+analyses+of+their+cargoes.">Methods of isolating extracellular vesicles impact down-stream analyses of their cargoes.</a> Methods. 87, 3-10 (2015).</li><li>Han, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrokinetic+size-based+spatial+separation+of+micro/nanospheres+using+paper-based+3d+origami+preconcentrator.">Electrokinetic size-based spatial separation of micro/nanospheres using paper-based 3d origami preconcentrator.</a> Analytical Chemistry. 91 (16), 10744-10749 (2019).</li><li>Yeh, S. H., Chou, K. H., Yang, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sample+pre-concentration+with+high+enrichment+factors+at+a+fixed+location+in+paper-based+microfluidic+devices.">Sample pre-concentration with high enrichment factors at a fixed location in paper-based microfluidic devices.</a> Lab on a Chip. 16 (5), 925-931 (2016).</li></ol>

Embora o Exo-PAD tenha sido utilizado com sucesso para o enriquecimento e isolamento de microvesculas e exosóis, vários pontos críticos devem ser cuidadosamente considerados: 1) o tempo de incubação do forno e a temperatura durante a preparação do dispositivo, 2) tempo de processamento, 3) aplicação de tensão com números de camadas variados e diâmetros da área da amostra, e 4) aplicabilidade às amostras clínicas.
O tempo de incubação e a temperatura dado no protocolo são cond...

Microvesículos e exosóis são pequenas vesículas de membrana medindo 0,2−1 μm e 30-200 nm, respectivamente. Eles são secretados no ambiente extracelular por vários tipos diferentes de células1,,2,,3,,4,5. Eles contêm informações de células parentais na forma de subconjuntos de DNA, mRNA, miRNA, proteínas e lipídios, e circulam por todo o corpo através de vários fluidos corporais, como soro, plasma, urina, fluido cefalorraquidiano, fluido amniótico e saliva6,,7,,8,,9. Assim, técnicas de isolamento eficiente de microvesículos e exosóis de fluidos biológicos podem proporcionar amplas oportunidades nas áreas do diagnóstico, prognóstico e monitoramento em tempo real da doença, bem como no desenvolvimento de novas terapêuticas.
No entanto, o método de isolamento convencional para microvesículos e exosóis baseados na ultracentrifugação é extremamente demorado e causa perda e contaminação significativas da amostra. Isso porque envolve várias etapas de tubulação e carregamento e descarte de vários reagentes com ultracentrifugação repetida5,6,,10,,11,12. Além disso, o alto estresse de corte induzido pela ultracentrifugação (~100.000 x g) pode causar a lise física de microvesículos e exosóis, gerando baixas taxas de recuperação (5-23%)6,13,14. Portanto, uma técnica de isolamento altamente eficiente e discreta para microvesculas e exosóis deve ser desenvolvida para reduzir danos e perdas, alcançando assim taxas de recuperação mais elevadas.
Um dispositivo à base de papel origami (Exo-PAD) foi desenvolvido para um isolamento mais simples, suave e altamente eficiente de microvesículos e exosóis6. O design do Exo-PAD é um papel multi-dobrado com áreas de amostra conectadas em série que gradualmente diminuem de diâmetro. A técnica de polarização da concentração de íons (ICP), que é um fenômeno nano-eletrocinético que pré-concentra biomoléculas carregadas, foi integrada a este design único. O uso do Exo-PAD resultou em enriquecimento cinco vezes maior dos microvesículos e exosóis em camadas específicas e seu isolamento simplesmente desdobrando o dispositivo. Este artigo descreve o Exo-PAD em detalhes, desde a fabricação e operação geral do dispositivo até a análise de seu uso, para ilustrar o método e mostrar resultados representativos6.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1356px;" width="1355">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:397px;">Ag/AgCl electrodes</td>
			<td style="width:207px;">A-M Systems, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">531500</td>
			<td style="width:633px;">0.15&#34; diameter</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Albumin from Bovine Serum (BSA), Alexa Fluor 594 conjugate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A13101</td>
			<td>BSA conjugated with Alexa Fluor 594 (Ex/Em: 590/617 nm)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Carbonate-Bicarbonate Buffer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C3041-50CAP</td>
			<td>Carbonate buffer</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">CorelDraw software (Coral Co., Canada)</td>
			<td>Corel Corporation</td>
			<td></td>
			<td>Printer software to define wax printing region</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ColorQube 8870</td>
			<td>Xerox Corporation</td>
			<td></td>
			<td>Wax printer</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Chromatography paper grade 1</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>3001-861</td>
			<td>Cellulose paper, dimension: 20 * 20 cm</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fluorescent-labeled exosome standards</td>
			<td>HansaBioMed Life Sciences, Ltd.</td>
			<td>HBM-F-PEP-100</td>
			<td>Exosome labeled with FITC (Ex/Em: 490/520 nm)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Keithley 2410 current/voltage source-meter</td>
			<td>Keithley Instruments, Inc.</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Current&#8211;voltage source measurement system</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Nafion perfluorinated resin solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>31175-20-9</td>
			<td>Permselective membrane, 20 wt.% in the mixture of lower aliphatic alcohols and water; contains 34% water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NanoSight LM10</td>
			<td>NanoSight Technology</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Nanoparticle tracking analysis (NTA) machine</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphate-buffered saline (PBS, pH7.4)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10010001</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

paper-based preconcentration and isolation of microvesicles and exosomes

Microvesículos e exosóis são pequenas vesículas membranous liberadas para o ambiente extracelular e circuladas por todo o corpo. Por conterem várias biomoléculas derivadas de células parentais, como DNA, mRNA, miRNA, proteínas e lipídios, seu enriquecimento e isolamento são passos críticos para sua exploração como potenciais biomarcadores para aplicações clínicas. No entanto, métodos convencionais de isolamento (por exemplo, ultracentrifugação) causam perdas e danos significativos a microvesculas e exosóis. Esses métodos também requerem múltiplas etapas repetitivas de ultracentrifugação, carregamento e desolação de reagentes. Este artigo descreve um método detalhado para fabricar um dispositivo baseado em papel origami (Exo-PAD) projetado para o enriquecimento efetivo e isolamento de microvesículos e exosóis de forma simples. O design único do Exo-PAD, composto por camadas multi-dobradas semelhantes a acordeões com áreas de amostra convergentes, é integrado à técnica de polarização da concentração de íons, permitindo assim o enriquecimento de cinco vezes dos microvesículos e exosóis em camadas específicas. Além disso, os microvesículos enriquecidos e exosóis são isolados simplesmente desdobrando o Exo-PAD.

O tempo de operação deve ser otimizado para alcançar o rendimento máximo de recuperação dos microvesículos enriquecidos e exosóis. O tempo insuficiente não permite migração suficiente dos microvesículos e exosóis, o que diminui o enriquecimento, enquanto o tempo excessivo deteriora o foco espacial e, portanto, dispersa os microvesículos e exosóis. Assim, através da etapa de otimização do tempo, pode ser identificado o fator máximo de pré-concentração de microvesículos e exosóis e o local final ond...

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Paper-Based Preconcentration and Isolation of Microvesicles and Exosomes

Apresentado é um protocolo para fabricar um dispositivo baseado em papel para o enriquecimento efetivo e isolamento de microvesículos e exosóis.

Pré-concentração baseada em papel e isolamento de microvesículos e exosóis

Microvesicles and exosomes are small membranous vesicles released to the extracellular environment and circulated throughout the body. Because they ...

Neste protocolo, descrevemos um método simples para fabricar um dispositivo baseado em papel chamado XO Pad, que foi projetado para o enriquecimento eficaz no isolamento de vesículas extracelulares. O XO Pad é um dispositivo simples que pode pré-concentrar e isolar vesícula extracelular sem o uso de quaisquer produtos químicos ou máquinas de trabalho, ao mesmo tempo em que mostra taxas de recuperação mais altas do que os métodos convencionais. Comece definindo a região a ser impressa com software de impressora.O desenho deve ter 12 camadas padronizadas de cera nas quais os diâmetros das áreas de amostra circular gradualmente diminuem de cinco a dois milímetros. Em seguida, imprima cera hidrofóbica nas regiões designadas em ambos os lados do papel de celulose. Coloque o papel impresso de cera em um forno de laboratório por 80 segundos a 120 graus Celsius, depois corte o papel impresso de cera com um cortador para fazer dispositivos XO Pad individuais.Solte um cinco e dois microliters de membrana seletiva perm nas áreas amostrais na maioria das camadas esquerda e direita, respectivamente. Coloque as camadas codificadas com a membrana seletiva perm em uma placa quente a 70 graus Celsius por 30 minutos para evaporar o solvente. Em seguida, sele a superfície mais externa da camada revestida voltada para a solução tampão com fita sensível à pressão, deixando um pequeno orifício.Dobre o dispositivo XO Pad para frente e para trás ao longo das linhas brancas para conectar convergentemente todas as áreas de amostra. Pipeta 15 microliters da amostra de microvesculas e exosóis nas áreas de amostra convergente e esperar alguns segundos para garantir a mochilão completa. Coloque duas câmaras de acrílico em ambas as extremidades do XO Pad e fixe-a com clipes pequenos para evitar o desenrolar.Encha as câmaras com 110 microliters de 0,1X PBS e insira dois eletrodos de prata. Em seguida, use um sistema de medição de fonte de tensão de corrente para aplicar 30 volts nos eletrodos por 20 minutos. Para isolar os microvesculas enriquecidos e exosóis, separe o XO Pad dobrado das câmaras acrílicas e desdobre o dispositivo para isolar as partículas enriquecidas das outras camadas.Esmurrem as áreas amostrais nas camadas oito e nove onde os microvesculas e exosóis são enriquecidos para análise a jusante. Um ensaio de migração de lapso de tempo de microvesículos e exosóis rotulados fluorescente foi realizado a fim de otimizar o tempo de operação para a recuperação máxima das partículas enriquecidas. As intensidades de fluorescência em todas as áreas amostrais foram quantificadas com o software ImageJ.Antes do processo de enriquecimento, microvesículos e exosóis foram dispersados em todas as áreas amostrais com diminuição gradual da intensidade. Após 10 minutos de processamento, as partículas migraram eletro-cineticamente e um plugue de pré-concentração instantâneo apareceu na camada sete. Quando o tempo chegou a 20 minutos, microvesículos e exosóis estavam fortemente focados nas camadas oito e nove e enriqueceram cinco vezes com base nas intensidades de fluorescência.A integridade dos microvesículos enriquecidos e exosóis na camada oito foi investigada com SEM. Significativamente mais partículas não danificadas foram observadas após o processo de enriquecimento. Também foi analisada a distribuição de tamanho dos microvesículos enriquecidos e exosóis.Posteriormente, analisou-se a concentração real dos microvesículos enriquecidos e exosóis nas áreas amostrais nas camadas seis, oito e 10. Na camada oito, os microvesculas e exosóis foram pré-concentrados por um fator de 5,58, mas não foi observada pré-concentração perceptível nas outras camadas. Para garantir a reprodutibilidade deste procedimento, seguiu com precisão o protocolo de tempo e temperatura de incubação do forno durante a verificação do dispositivo e o tempo de funcionamento do dispositivo, pois essas são as condições otimizadas.O XO Pad também pode ser usado para separar e isolar vesícula extracelular de amostras ricas em proteínas, como soro ou plasma, usando tampão de carbonato. Este protocolo pode fornecer uma ferramenta de preparação eficiente e simples, com suas capacidades de pré-concentração e isolamento necessárias para pesquisas clínicas, como diagnóstico, entrega de medicamentos, imunoterapia e outras terapêuticas.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Identification of Plant Ice-binding Proteins Through Assessment of Ice-recrystallization Inhibition and Isolation Using Ice-affinity Purification

Identificação de Proteínas de gelo Planta de ligao por meio da avaliação da Inibição de gelo-recristalização e isolamento utilizando purificação por afinidade de gelo

Ice-binding proteins (IBPs) belong to a family of stress-induced proteins that are synthesized by certain organisms exposed to subzero temperatures. In ...

Bioquímica

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Isolamento e medições respiratória de mitocôndrias de Arabidopsis thaliana

Mitochondria are essential organelles involved in numerous metabolic pathways in plants, most notably the production of adenosine triphosphate (ATP) from ...

Protein Digestion, Ultrafiltration, and Size Exclusion Chromatography to Optimize the Isolation of Exosomes from Human Blood Plasma and Serum

Digestão de proteínas, ultrafiltração e cromatografia de exclusão para otimizar o isolamento do Exosomes do Plasma de sangue humano e soro

Exosomes, a type of nanovesicle released from all cell types, can be isolated from any bodily fluid. The contents of exosomes, including proteins and ...

Rapid Isolation of the Mitoribosome from HEK Cells

Isolamento rápido do Mitoribosome de células HEK

The human mitochondria possess a dedicated set of ribosomes (mitoribosomes) that translate 13 essential protein components of the oxidative ...

Detection and Isolation of Apoptotic Bodies to High Purity

Detecção e isolamento de corpos Apoptotic de alta pureza

Apoptotic bodies (ApoBDs), microvesicles and exosomes are the key members of the extracellular vesicle family, with ApoBDs being one of the largest type. ...

Isolation of Physiologically Active Thylakoids and Their Use in Energy-Dependent Protein Transport Assays

Isolamento de fisiologicamente ativo contém e a sua utilização em ensaios de transporte de energia-dependente da proteína

Chloroplasts are the organelles in green plants responsible for carrying out numerous essential metabolic pathways, most notably photosynthesis. Within ...

Isolation of Glomeruli and In Vivo Labeling of Glomerular Cell Surface Proteins

Isolation of Glomeruli and In Vivo Labeling of Glomerular Cell Surface Proteins

Isolamento de glomérulos e In Vivo de rotulagem das proteínas de superfície celular Glomerular

Proteinuria results from the disruption of the glomerular filter that is composed of the fenestrated endothelium, glomerular basement membrane, and ...

Looking Outwards: Isolation of Cyanobacterial Released Carbohydrate Polymers and Proteins

Olhando para fora: isolamento de cianobactérias liberado polímeros de carboidratos e proteínas

Cyanobacteria can actively secrete a wide range of biomolecules into the extracellular environment, such as heteropolysaccharides and proteins. The ...

Isolation and Analysis of Plasma Lipoproteins by Ultracentrifugation

Isolamento e Análise de Lipoproteínas plasmáticas por Ultracentrifugação

Analysis of plasma lipoproteins and apolipoproteins is an essential part for the diagnosis of dyslipidemia and studies of lipid metabolism and ...

Isolation of Active Caenorhabditis elegans Nuclear Extract and Reconstitution for In Vitro Transcription

Isolation of Active Caenorhabditis elegans Nuclear Extract and Reconstitution for In Vitro Transcription

Isolamento da Caenorhabditis Ativa elegans Extrato Nuclear e Reconstituição para Transcrição In Vitro

Caenorhabditis elegans has been an important model system for biological research since it was introduced in 1963. However, C. elegans has not been fully ...