Name: paper-based preconcentration and isolation of microvesicles and exosomes
Uploaded: 2020-04-29T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Paper-Based Preconcentration and Isolation of Microvesicles and Exosomes at JoVE.com

Это исследование было поддержано Национальным исследовательским фондом Кореи Grant NRF-2018R1D1A1A09084044. J. H. Lee был поддержан исследовательским грантом Университета Кванвуна в 2019 году. Херин Ким был поддержан «Программой развития компетенций для специалистов отрасли» Министерства торговли, промышленности и энергетики Кореи (MOTIE), управляемой Корейским институтом развития технологий (KIAT) (No. P0002397, HRD программа для промышленной конвергенции носимых смарт-устройств).

1. Изготовление устройств
<ol><li>Определите регион, который будет напечатан на бумаге с помощью программного обеспеченияпринтера( Таблица материалов ). ПРИМЕЧАНИЕ: Конструкция имеет 12 восковых узорных слоев, в которых диаметры круговой выборки постепенно сужаются от 5 мм до 2 м...

<ol>
	<li>Edgar, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Q+&amp;+A:+What+are+exosomes,+exactly.">Q &amp; A: What are exosomes, exactly.</a> BMC Biology. 14 (1), 1-7 (2016).</li><li>Contreras-Naranjo, J. C., Wu, H. J., Ugaz, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics+for+exosome+isolation+and+analysis:+Enabling+liquid+biopsy+for+personalized+medicine.">Microfluidics for exosome isolation and analysis: Enabling liquid biopsy for personalized medicine.</a> Lab on a Chip. 17 (21), 3558-3577 (2017).</li><li>Simons, M., Raposo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+-+vesicular+carriers+for+intercellular+communication.">Exosomes - vesicular carriers for intercellular communication.</a> Current Opinion in Cell Biology. 21 (4), 575-581 (2009).</li><li>St&#229;hl, A. L., Johansson, K., Mossberg, M., Kahn, R., Karpman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+and+microvesicles+in+normal+physiology,+pathophysiology,+and+renal+diseases.">Exosomes and microvesicles in normal physiology, pathophysiology, and renal diseases.</a> Pediatric Nephrology. 34 (1), 11-30 (2019).</li><li>Chen, C., Lin, B. R., Hsu, M. Y., Cheng, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paper-based+devices+for+isolation+and+characterization+of+extracellular+vesicles.">Paper-based devices for isolation and characterization of extracellular vesicles.</a> Journal of Visualized Experiments. (98), e52722 (2015).</li><li>Kim, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origami-paper-based+device+for+microvesicle/exosome+preconcentration+and+isolation.">Origami-paper-based device for microvesicle/exosome preconcentration and isolation.</a> Lab on a Chip. 19 (23), 3917-3921 (2019).</li><li>Raposo, G., Stoorvogel, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles:+Exosomes,+microvesicles,+and+friends.">Extracellular vesicles: Exosomes, microvesicles, and friends.</a> Journal of Cell Biology. 200 (4), 373-383 (2013).</li><li>Lee, Y., El Andaloussi, S., Wood, M. J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+and+microvesicles:+Extracellular+vesicles+for+genetic+information+transfer+and+gene+therapy.">Exosomes and microvesicles: Extracellular vesicles for genetic information transfer and gene therapy.</a> Human Molecular Genetics. 21, 125-134 (2012).</li><li>Liu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Field-Free+Isolation+of+Exosomes+from+Extracellular+Vesicles+by+Microfluidic+Viscoelastic+Flows.">Field-Free Isolation of Exosomes from Extracellular Vesicles by Microfluidic Viscoelastic Flows.</a> ACS Nano. 11 (7), 6968-6976 (2017).</li><li>Marczak, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+isolation+and+preconcentration+of+exosomes+by+ion+concentration+polarization.">Simultaneous isolation and preconcentration of exosomes by ion concentration polarization.</a> Electrophoresis. 39 (15), 2029-2038 (2018).</li><li>Livshts, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+exosomes+by+differential+centrifugation:+Theoretical+analysis+of+a+commonly+used+protocol.">Isolation of exosomes by differential centrifugation: Theoretical analysis of a commonly used protocol.</a> Scientific Reports. 5, 1-14 (2015).</li><li>Chiriac&#242;, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lab-on-chip+for+exosomes+and+microvesicles+detection+and+characterization.">Lab-on-chip for exosomes and microvesicles detection and characterization.</a> Sensors. 18 (10), 3175 (2018).</li><li>Lobb, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+exosome+isolation+protocol+for+cell+culture+supernatant+and+human+plasma.">Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 4 (1), 1-11 (2015).</li><li>Taylor, D. D., Shah, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+of+isolating+extracellular+vesicles+impact+down-stream+analyses+of+their+cargoes.">Methods of isolating extracellular vesicles impact down-stream analyses of their cargoes.</a> Methods. 87, 3-10 (2015).</li><li>Han, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrokinetic+size-based+spatial+separation+of+micro/nanospheres+using+paper-based+3d+origami+preconcentrator.">Electrokinetic size-based spatial separation of micro/nanospheres using paper-based 3d origami preconcentrator.</a> Analytical Chemistry. 91 (16), 10744-10749 (2019).</li><li>Yeh, S. H., Chou, K. H., Yang, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sample+pre-concentration+with+high+enrichment+factors+at+a+fixed+location+in+paper-based+microfluidic+devices.">Sample pre-concentration with high enrichment factors at a fixed location in paper-based microfluidic devices.</a> Lab on a Chip. 16 (5), 925-931 (2016).</li></ol>

Хотя Exo-PAD был успешно использован для обогащения и изоляции микрорезокм и экзосом, следует тщательно рассмотреть несколько критических точек: 1) время инкубации печи во время подготовки устройства, 2) время обработки, 3) применение напряжения с различными номерами слоя и диаметрами выбо?...

Микровесицы и экзосомы представляют собой небольшие мембранные пузырьки размером 0,2–1 мкм и 30–200 нм соответственно. Они выделяются в внеклеточной среде несколькими различными типами клеток1,,2,,3,,4,,5. Они содержат информацию о родительских клетках в виде подмножеств ДНК, мРНК, миРНК, белков и липидов, и циркулируют по всему телу через различные жидкости организма, такие как сыворотка, плазма, моча, спинномозговая жидкость, амниотическая жидкость и слюна6,,7,,8,,9. Таким образом, методы эффективной изоляции микровесий и экзосом от биологических жидкостей могут предоставить широкие возможности в области диагностики, прогноза и мониторинга заболеваний в режиме реального времени, а также в разработке новых терапевтических средств.
Однако обычный метод изоляции микрорезокм и экзосом на основе ультрацентрифугации занимает чрезвычайно много времени и приводит к значительным потерям и загрязнению образца. Это потому, что она включает в себя несколько громоздких трубопроводов и погрузочных шагов и отбрасывания различных реагентов с повторными ультрацентрифугации5,6,10,11,12. Кроме того, высокий сдвига стресса, вызванного ультрацентрифугации (100000 х г) может вызвать физический лизис микрорез и экзосомы, что дает плохие темпы восстановления (5-23%)6,13,14. Поэтому необходимо разработать высокоэффективный, ненавязчивый метод изоляции микровесицы и экзосомы для уменьшения урона и потерь, тем самым достигая более высоких скоростей восстановления.
Устройство на основе оригами (Exo-PAD) было разработано для более простой, мягкой и высокоэффективной изоляции микровесий и экзосом6. Конструкция Exo-PAD представляет собой многоотраслую бумагу с последовательно связанными участками образца, которые постепенно уменьшаются в диаметре. Техника поляризации концентрации иона (ICP), которая является наноэлектрическим явлением, которое предконцентрирует заряженные биомолекулы, была интегрирована с этой уникальной конструкцией. Использование Exo-PAD привело к пятикратному обогащению микровесиков и экзосом в определенных слоях и их изоляции, просто развернувшись устройством. В этой статье подробно описывается Exo-PAD, от общего изготовления и эксплуатации устройства до анализа его использования, иллюстрации метода и показа репрезентативных результатов6.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1356px;" width="1355">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:397px;">Ag/AgCl electrodes</td>
			<td style="width:207px;">A-M Systems, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">531500</td>
			<td style="width:633px;">0.15&#34; diameter</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Albumin from Bovine Serum (BSA), Alexa Fluor 594 conjugate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A13101</td>
			<td>BSA conjugated with Alexa Fluor 594 (Ex/Em: 590/617 nm)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Carbonate-Bicarbonate Buffer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C3041-50CAP</td>
			<td>Carbonate buffer</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">CorelDraw software (Coral Co., Canada)</td>
			<td>Corel Corporation</td>
			<td></td>
			<td>Printer software to define wax printing region</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ColorQube 8870</td>
			<td>Xerox Corporation</td>
			<td></td>
			<td>Wax printer</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Chromatography paper grade 1</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>3001-861</td>
			<td>Cellulose paper, dimension: 20 * 20 cm</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fluorescent-labeled exosome standards</td>
			<td>HansaBioMed Life Sciences, Ltd.</td>
			<td>HBM-F-PEP-100</td>
			<td>Exosome labeled with FITC (Ex/Em: 490/520 nm)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Keithley 2410 current/voltage source-meter</td>
			<td>Keithley Instruments, Inc.</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Current&#8211;voltage source measurement system</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Nafion perfluorinated resin solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>31175-20-9</td>
			<td>Permselective membrane, 20 wt.% in the mixture of lower aliphatic alcohols and water; contains 34% water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NanoSight LM10</td>
			<td>NanoSight Technology</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Nanoparticle tracking analysis (NTA) machine</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphate-buffered saline (PBS, pH7.4)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10010001</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

paper-based preconcentration and isolation of microvesicles and exosomes

Микровесицы и экзосомы являются небольшими membranous везикулы выпущен в внеклеточной среде и циркулирует по всему телу. Поскольку они содержат различные родительские клетки, полученные биомолекулы, такие как ДНК, мРНК, миРНК, белки и липиды, их обогащение и изоляция являются важными шагами для их эксплуатации в качестве потенциальных биомаркеров для клинических применений. Однако обычные методы изоляции (например, ультрацентрарифизация) приводят к значительным потерям и повреждению микровесичек и экзосом. Эти методы также требуют нескольких повторяющихся шагов ультрацентрифугации, загрузки и расточительства реагентов. В этой статье описывается подробный метод изготовления оригами-бумажного устройства (Exo-PAD), предназначенного для эффективного обогащения и изоляции микровесий и экзосом простым способом. Уникальный дизайн Exo-PAD, состоящий из аккордеонных многослойных с конвергентных образных областей, интегрирован с техникой поляризации концентрации иона, что позволяет пятикратное обогащение микровесий и экзосом на конкретных слоях. Кроме того, обогащенные микровесицы и экзосомы изолированы, просто разворачивая Exo-PAD.

Время работы должно быть оптимизировано для достижения максимального выхода на восстановление обогащенных микровесий и экзосом. Недостаточное время не позволяет достаточной миграции микровесицы и экзосомы, что уменьшает обогащение, в то время как чрезмерное время ухудшает простран?...

Watch this Scientific Journal Video about Paper-Based Preconcentration and Isolation of Microvesicles and Exosomes at JoVE.com

Paper-Based Preconcentration and Isolation of Microvesicles and Exosomes

Представлен протокол для изготовления бумажного устройства для эффективного обогащения и изоляции микровесий и экзосом.

Предконцентрация и изоляция микровесикул и экзосом на бумажной основе

Microvesicles and exosomes are small membranous vesicles released to the extracellular environment and circulated throughout the body. Because they ...

В этом протоколе мы описываем простой метод изготовления бумажного устройства под названием XO Pad, которое предназначено для эффективного обогащения в изоляции внеклеточных пузырьков. XO Pad является простым устройством, которое может предварительно сконцентрировать и изолировать внеклеточные пузырьки без использования каких-либо химических веществ или рабочих машин, показывая при этом более высокие темпы восстановления, чем обычные методы. Начните с определения региона, который будет напечатан с помощью программного обеспечения принтера.Конструкция должна иметь 12 восковых узорчатых слоев, в которых диаметры круглых участков образца постепенно сужаются от пяти до двух миллиметров. Затем напечатайте гидрофобный воск на обозначенных регионах по обе стороны целлюлозной бумаги. Поместите воск печатной бумаги в лабораторной печи в течение 80 секунд при температуре 120 градусов по Цельсию, а затем сократить воск печатной бумаги с резаком, чтобы сделать отдельные устройства XO Pad.Бросьте пять и два микролитера пермяки селективной мембраны на выборочные области в левом и правом большинстве слоев, соответственно. Поместите слои, закодированные с завивкой селективной мембраны на горячей пластине при 70 градусов по Цельсию в течение 30 минут, чтобы испарять растворитель. Затем запечатай внешнюю поверхность покрытого слоя лицом к буферу раствор чувствительной лентой, оставив небольшое отверстие.Сложите устройство XO Pad взад и вперед вдоль белых линий, чтобы конвергентно соединить все области выборки. Pipette 15 микролитров микрозвука и экзосомы образца в конвергентных областях образца и ждать несколько секунд, чтобы обеспечить полное смачивания. Поместите две акриловые камеры на обоих концах XO Pad и зажим его надежно с небольшими зажимами связующего, чтобы предотвратить развертывание.Заполните камеры 110 микролитров 0.1X PBS и вставьте два серебряных электрода. Затем используйте систему измерения источника напряжения, чтобы применить 30 вольт к электродам в течение 20 минут. Чтобы изолировать обогащенные микровезолы и экзосомы, отделить сложенный XO Pad от акриловых камер и развернуть устройство, чтобы изолировать обогащенные частицы от других слоев.Удар из образцов областях в слоях восемь и девять, где микровеся и экзосомы обогащаются для анализа вниз по течению. Для оптимизации времени работы по максимальному восстановлению обогащенных частиц был проведен анализ замедленной миграции флуоресцентно помеченных микровезикул и экзосом. Флуоресценция интенсивности во всех областях выборки были количественно с ImageJ программного обеспечения.Перед процессом обогащения микровезикулы и экзосомы рассеивались во всех выборочных областях с постепенным снижением интенсивности. После 10 минут обработки частицы мигрировали электрокинетически, и на слою 7 появилась мгновенная предприемная вилка. Когда время достигало 20 минут, микровеся и экзосомы были сильно сосредоточены на слоях восемь и девять и обогащены пять раз на основе интенсивности флуоресценции.Целостность обогащенных микровезиков и экзосом в восьмом слое была исследована с помощью SEM. Значительно больше не поврежденных частиц наблюдалось после процесса обогащения. Было также проанализировано распределение размеров обогащенных микровесикул и экзосом.Впоследствии была проанализирована фактическая концентрация обогащенных микровесикул и экзосом на участках образца в слоях 6, 8 и 10. В восьмом слое микровезикулы и экзосомы были предварительно сконцентрированы в 5,58, однако в других слоях не наблюдалось заметной предварительной концентрации. Чтобы обеспечить воспроизводимость этой процедуры, точно следовал протоколу для инкубации печи времени и температуры во время проверки устройства и времени работы устройства, потому что это оптимизированные условия.XO Pad также может быть использован для отделять и изолировать внеклеточные пузырьки от богатых белком образцов, таких как сыворотка или плазма, с помощью карбонатного буфера. Этот протокол может обеспечить эффективный, простой инструмент подготовки, с его предварительной концентрации и изоляции возможностей, необходимых для клинических исследований, таких как диагностика, доставка лекарств, иммунотерапия, и другие терапевтические средства.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Identification of Plant Ice-binding Proteins Through Assessment of Ice-recrystallization Inhibition and Isolation Using Ice-affinity Purification

Идентификация растений ледово-связывающих белков путем оценки льда рекристаллизации ингибирования и выделение с помощью льда-аффинной очистки

Ice-binding proteins (IBPs) belong to a family of stress-induced proteins that are synthesized by certain organisms exposed to subzero temperatures. In ...

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Изоляция и дыхательных измерения митохондрий от Резуховидка Таля

Mitochondria are essential organelles involved in numerous metabolic pathways in plants, most notably the production of adenosine triphosphate (ATP) from ...

Protein Digestion, Ultrafiltration, and Size Exclusion Chromatography to Optimize the Isolation of Exosomes from Human Blood Plasma and Serum

Переваривание белков, ультрафильтрации и гель-проникающей хроматографии размер для оптимизации изоляции Exosomes из человеческой плазмы крови и сыворотки

Exosomes, a type of nanovesicle released from all cell types, can be isolated from any bodily fluid. The contents of exosomes, including proteins and ...

Rapid Isolation of the Mitoribosome from HEK Cells

Быстрая изоляция Mitoribosome из клеток ГЭС

The human mitochondria possess a dedicated set of ribosomes (mitoribosomes) that translate 13 essential protein components of the oxidative ...

Detection and Isolation of Apoptotic Bodies to High Purity

Обнаружение и изоляция Apoptotic тел с высокой чистоты

Apoptotic bodies (ApoBDs), microvesicles and exosomes are the key members of the extracellular vesicle family, with ApoBDs being one of the largest type. ...

Isolation of Physiologically Active Thylakoids and Their Use in Energy-Dependent Protein Transport Assays

Изоляция физиологически активных тилакоидов и их использования в энергии зависимых белков транспорт анализов

Chloroplasts are the organelles in green plants responsible for carrying out numerous essential metabolic pathways, most notably photosynthesis. Within ...

Isolation of Glomeruli and In Vivo Labeling of Glomerular Cell Surface Proteins

Isolation of Glomeruli and In Vivo Labeling of Glomerular Cell Surface Proteins

Изоляция клубочков и в естественных условиях маркировки клубочковых клеток поверхности белков

Proteinuria results from the disruption of the glomerular filter that is composed of the fenestrated endothelium, glomerular basement membrane, and ...

Looking Outwards: Isolation of Cyanobacterial Released Carbohydrate Polymers and Proteins

Взгляд наружу: Изоляция цианобактериальных высвобождаемых углеводных полимеров и белков

Cyanobacteria can actively secrete a wide range of biomolecules into the extracellular environment, such as heteropolysaccharides and proteins. The ...

Isolation and Analysis of Plasma Lipoproteins by Ultracentrifugation

Изоляция и анализ плазменных липопротеинов с помощью ультрацентрифугации

Analysis of plasma lipoproteins and apolipoproteins is an essential part for the diagnosis of dyslipidemia and studies of lipid metabolism and ...

Isolation of Active Caenorhabditis elegans Nuclear Extract and Reconstitution for In Vitro Transcription

Isolation of Active Caenorhabditis elegans Nuclear Extract and Reconstitution for In Vitro Transcription

Выделение активного caenorhabditis elegans Nuclear Extract и восстановление для транскрипции in vitro

Caenorhabditis elegans has been an important model system for biological research since it was introduced in 1963. However, C. elegans has not been fully ...