Name: paper-based preconcentration and isolation of microvesicles and exosomes
Uploaded: 2020-04-29T15:00:00
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Este estudio fue apoyado por la National Research Foundation of Korea, Grant NRF-2018R1D1A1A090840444. J. H. Lee fue apoyado por una beca de investigación de la Universidad de Kwangwoon en 2019. Hyerin Kim recibió el apoyo del "Programa de Desarrollo de Competencias para Especialistas en Industria" del Ministerio de Comercio, Industria y Energía de Corea (MOTIE), operado por el Instituto Coreano para el Avance de la Tecnología (KIAT) (No. P0002397, programa HRD para la convergencia industrial de dispositivos inteligentes portátiles).

1. Fabricación de dispositivos
<ol><li>Defina la región que se va a imprimir en papel utilizando el software de impresora (Tabla de materiales). NOTA: El diseño tiene 12 capas con patrón de cera en las que los diámetros de las áreas circulares de la muestra se estrechan gradualmente de 5 mm a 2 mm(Figura 1A).</li>
	<li>Imprima cera hidrófoba en las regiones designadas a ambos lados del papel de celulosa (Tabla de materiales) utilizando una impres...

<ol>
	<li>Edgar, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Q+&amp;+A:+What+are+exosomes,+exactly.">Q &amp; A: What are exosomes, exactly.</a> BMC Biology. 14 (1), 1-7 (2016).</li><li>Contreras-Naranjo, J. C., Wu, H. J., Ugaz, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics+for+exosome+isolation+and+analysis:+Enabling+liquid+biopsy+for+personalized+medicine.">Microfluidics for exosome isolation and analysis: Enabling liquid biopsy for personalized medicine.</a> Lab on a Chip. 17 (21), 3558-3577 (2017).</li><li>Simons, M., Raposo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+-+vesicular+carriers+for+intercellular+communication.">Exosomes - vesicular carriers for intercellular communication.</a> Current Opinion in Cell Biology. 21 (4), 575-581 (2009).</li><li>St&#229;hl, A. L., Johansson, K., Mossberg, M., Kahn, R., Karpman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+and+microvesicles+in+normal+physiology,+pathophysiology,+and+renal+diseases.">Exosomes and microvesicles in normal physiology, pathophysiology, and renal diseases.</a> Pediatric Nephrology. 34 (1), 11-30 (2019).</li><li>Chen, C., Lin, B. R., Hsu, M. Y., Cheng, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paper-based+devices+for+isolation+and+characterization+of+extracellular+vesicles.">Paper-based devices for isolation and characterization of extracellular vesicles.</a> Journal of Visualized Experiments. (98), e52722 (2015).</li><li>Kim, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origami-paper-based+device+for+microvesicle/exosome+preconcentration+and+isolation.">Origami-paper-based device for microvesicle/exosome preconcentration and isolation.</a> Lab on a Chip. 19 (23), 3917-3921 (2019).</li><li>Raposo, G., Stoorvogel, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles:+Exosomes,+microvesicles,+and+friends.">Extracellular vesicles: Exosomes, microvesicles, and friends.</a> Journal of Cell Biology. 200 (4), 373-383 (2013).</li><li>Lee, Y., El Andaloussi, S., Wood, M. J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+and+microvesicles:+Extracellular+vesicles+for+genetic+information+transfer+and+gene+therapy.">Exosomes and microvesicles: Extracellular vesicles for genetic information transfer and gene therapy.</a> Human Molecular Genetics. 21, 125-134 (2012).</li><li>Liu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Field-Free+Isolation+of+Exosomes+from+Extracellular+Vesicles+by+Microfluidic+Viscoelastic+Flows.">Field-Free Isolation of Exosomes from Extracellular Vesicles by Microfluidic Viscoelastic Flows.</a> ACS Nano. 11 (7), 6968-6976 (2017).</li><li>Marczak, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+isolation+and+preconcentration+of+exosomes+by+ion+concentration+polarization.">Simultaneous isolation and preconcentration of exosomes by ion concentration polarization.</a> Electrophoresis. 39 (15), 2029-2038 (2018).</li><li>Livshts, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+exosomes+by+differential+centrifugation:+Theoretical+analysis+of+a+commonly+used+protocol.">Isolation of exosomes by differential centrifugation: Theoretical analysis of a commonly used protocol.</a> Scientific Reports. 5, 1-14 (2015).</li><li>Chiriac&#242;, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lab-on-chip+for+exosomes+and+microvesicles+detection+and+characterization.">Lab-on-chip for exosomes and microvesicles detection and characterization.</a> Sensors. 18 (10), 3175 (2018).</li><li>Lobb, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+exosome+isolation+protocol+for+cell+culture+supernatant+and+human+plasma.">Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 4 (1), 1-11 (2015).</li><li>Taylor, D. D., Shah, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+of+isolating+extracellular+vesicles+impact+down-stream+analyses+of+their+cargoes.">Methods of isolating extracellular vesicles impact down-stream analyses of their cargoes.</a> Methods. 87, 3-10 (2015).</li><li>Han, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrokinetic+size-based+spatial+separation+of+micro/nanospheres+using+paper-based+3d+origami+preconcentrator.">Electrokinetic size-based spatial separation of micro/nanospheres using paper-based 3d origami preconcentrator.</a> Analytical Chemistry. 91 (16), 10744-10749 (2019).</li><li>Yeh, S. H., Chou, K. H., Yang, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sample+pre-concentration+with+high+enrichment+factors+at+a+fixed+location+in+paper-based+microfluidic+devices.">Sample pre-concentration with high enrichment factors at a fixed location in paper-based microfluidic devices.</a> Lab on a Chip. 16 (5), 925-931 (2016).</li></ol>

Aunque el Exo-PAD se utilizó con éxito para el enriquecimiento y aislamiento de microvesículas y exosomas, se deben considerar cuidadosamente varios puntos críticos: 1) el tiempo y la temperatura de incubación del horno durante la preparación del dispositivo, 2) el tiempo de procesamiento, 3) la aplicación de voltaje con diferentes números de capa y diámetros de área de muestra, y 4) la aplicabilidad a las muestras clínicas.
El tiempo de incubación y la temperatura indicados en el ...

Las microvesículas y los exosomas son vesículas de membrana pequeñas que miden 0,2 a 1 m y 30 a 200 nm, respectivamente. Son secretados en el entorno extracelular por varios tipos de células diferentes1,2,3,4,5. Contienen información de células parentales en forma de subconjuntos de ADN, ARNm, MIRNA, proteínas y lípidos, y circulan por todo el cuerpo a través de diversos fluidos corporales como suero, plasma, orina, líquido cefalorraquídeo, líquido amniótico y saliva6,7,8,9. Por lo tanto, las técnicas para el aislamiento eficiente de microvesículas y exosomas de fluidos biológicos pueden proporcionar amplias oportunidades en los campos del diagnóstico, pronóstico y monitoreo en tiempo real de la enfermedad, así como en el desarrollo de nuevas terapias.
Sin embargo, el método de aislamiento convencional para microvesículas y exosomas basados en la ultracentrifugación consume mucho tiempo y causa una pérdida y contaminación significativas de la muestra. Esto se debe a que implica varios pasos de pipeteo y carga engorrosos y el descarte de varios reactivos con ultracentrifugación repetida5,6,10,11,12. Por otra parte, la alta tensión de cizallamiento inducida por la ultracentrifugación (100.000 x g)puede causar la lysis física de microvesículas y exosomas, produciendo tasas de recuperación deficientes (5-23%)6,,13,,14. Por lo tanto, se debe desarrollar una técnica de aislamiento altamente eficiente y discreta para microvesículas y exosomas para reducir el daño y la pérdida, logrando así mayores tasas de recuperación.
Un dispositivo basado en papel de origami (Exo-PAD) fue desarrollado para un aislamiento más simple, suave y altamente eficiente de microvesículas y exosomas6. El diseño del Exo-PAD es un papel multiplicizado con áreas de muestra conectadas en serie que disminuyen gradualmente de diámetro. La técnica de polarización de la concentración de iones (ICP), que es un fenómeno nanoelectrocinético que preconcentra biomoléculas cargadas, se integró con este diseño único. El uso del Exo-PAD dio como resultado un enriquecimiento quintuplicado de las microvesículas y exosomas en capas específicas y su aislamiento simplemente desplegando el dispositivo. Este artículo describe el Exo-PAD en detalle, desde la fabricación y operación general del dispositivo hasta el análisis de su uso, para ilustrar el método y mostrar resultados representativos6.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1356px;" width="1355">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:397px;">Ag/AgCl electrodes</td>
			<td style="width:207px;">A-M Systems, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">531500</td>
			<td style="width:633px;">0.15&#34; diameter</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Albumin from Bovine Serum (BSA), Alexa Fluor 594 conjugate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A13101</td>
			<td>BSA conjugated with Alexa Fluor 594 (Ex/Em: 590/617 nm)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Carbonate-Bicarbonate Buffer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C3041-50CAP</td>
			<td>Carbonate buffer</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">CorelDraw software (Coral Co., Canada)</td>
			<td>Corel Corporation</td>
			<td></td>
			<td>Printer software to define wax printing region</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ColorQube 8870</td>
			<td>Xerox Corporation</td>
			<td></td>
			<td>Wax printer</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Chromatography paper grade 1</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>3001-861</td>
			<td>Cellulose paper, dimension: 20 * 20 cm</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fluorescent-labeled exosome standards</td>
			<td>HansaBioMed Life Sciences, Ltd.</td>
			<td>HBM-F-PEP-100</td>
			<td>Exosome labeled with FITC (Ex/Em: 490/520 nm)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Keithley 2410 current/voltage source-meter</td>
			<td>Keithley Instruments, Inc.</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Current&#8211;voltage source measurement system</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Nafion perfluorinated resin solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>31175-20-9</td>
			<td>Permselective membrane, 20 wt.% in the mixture of lower aliphatic alcohols and water; contains 34% water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NanoSight LM10</td>
			<td>NanoSight Technology</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Nanoparticle tracking analysis (NTA) machine</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphate-buffered saline (PBS, pH7.4)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10010001</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

paper-based preconcentration and isolation of microvesicles and exosomes

Las microvesículas y exosomas son pequeñas vesículas membranosas liberadas al ambiente extracelular y circulan por todo el cuerpo. Debido a que contienen varias biomoléculas derivadas de células parentales como ADN, ARNm, miRNA, proteínas y lípidos, su enriquecimiento y aislamiento son pasos críticos para su explotación como biomarcadores potenciales para aplicaciones clínicas. Sin embargo, los métodos de aislamiento convencionales (por ejemplo, ultracentrifugación) causan pérdidas significativas y daños a microvesículas y exosomas. Estos métodos también requieren múltiples pasos repetitivos de ultracentrifugación, carga y desgaste de reactivos. Este artículo describe un método detallado para fabricar un dispositivo basado en papel de origami (Exo-PAD) diseñado para el enriquecimiento y aislamiento efectivos de microvesículas y exosomas de una manera sencilla. El diseño único del Exo-PAD, que consiste en capas multidobladas similares al acordeón con áreas de muestra convergentes, se integra con la técnica de polarización de concentración de iones, lo que permite un enriquecimiento quintuplicado de las microvesículas y exosomas en capas específicas. Además, las microvesículas y exosomas enriquecidos se aíslan simplemente desplegando el Exo-PAD.

El tiempo de operación debe optimizarse para lograr el máximo rendimiento de recuperación de las microvesículas y exosomas enriquecidos. El tiempo insuficiente no permite una migración suficiente de las microvesículas y exosomas, lo que disminuye el enriquecimiento, mientras que el tiempo excesivo deteriora el enfoque espacial y por lo tanto dispersa las microvesículas y exosomas. Así, a través del paso de optimización del tiempo, se puede identificar el factor máximo de preconcentración de microvesículas y ...

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Paper-Based Preconcentration and Isolation of Microvesicles and Exosomes

Presentado es un protocolo para fabricar un dispositivo basado en papel para el enriquecimiento y aislamiento efectivos de microvesículas y exosomas.

Preconcentración basada en papel y aislamiento de microvesículas y exosomas

Microvesicles and exosomes are small membranous vesicles released to the extracellular environment and circulated throughout the body. Because they ...

En este protocolo, describimos un método simple para fabricar un dispositivo basado en papel llamado XO Pad, que está diseñado para el enriquecimiento efectivo en aislamiento de vesículas extracelulares. El XO Pad es un dispositivo simple que puede precontratar y aislar la vesícula extracelular sin el uso de productos químicos o máquinas de trabajo, mientras que muestra tasas de recuperación más altas que los métodos convencionales. Comience definiendo la región que se imprimirán con el software de la impresora.El diseño debe tener 12 capas con patrón de cera en las que los diámetros de las áreas circulares de la muestra se estrechan gradualmente de cinco a dos milímetros. A continuación, imprima cera hidrófoba en las regiones designadas a ambos lados del papel de celulosa. Coloque el papel impreso en cera en un horno de laboratorio durante 80 segundos a 120 grados Centígrados, luego corte el papel impreso en cera con un cortador para fabricar dispositivos XO Pad individuales.Suelte un cinco y dos microlitros de membrana selectiva de perm en las áreas de la muestra en la mayoría izquierda y la derecha de la mayoría de las capas, respectivamente. Coloque las capas codificadas con la membrana selectiva perm en una placa caliente a 70 grados Celsius durante 30 minutos para evaporar el disolvente. A continuación, selle la superficie más externa de la capa recubierta frente a la solución tampón con cinta sensible a la presión, dejando un pequeño agujero.Doble el dispositivo XO Pad de un lado a otro a lo largo de las líneas blancas para conectar convergentemente todas las áreas de muestra. Pipetear 15 microlitros de la microvesícula y la muestra de exosoma en las áreas convergentes de la muestra y esperar unos segundos para asegurar la humectación completa. Coloque dos cámaras de acrílico en ambos extremos de la XO Pad y fíjela firmemente con pequeños clips de aglutinante para evitar que se desdoblen.Llene las cámaras con 110 microlitros de 0.1X PBS e inserte dos electrodos de plata. A continuación, utilice un sistema de medición de fuente de voltaje de corriente para aplicar 30 voltios a los electrodos durante 20 minutos. Para aislar las microvesículas y exosomas enriquecidos, separe el XO Pad plegado de las cámaras de acrílico y desdoble el dispositivo para aislar las partículas enriquecidas de las otras capas.Perforar las áreas de muestra en las capas ocho y nueve donde las microvesículas y exosomas se enriquecen para el análisis posterior. Se realizó un ensayo de migración de lapso de tiempo de microvesículas y exosomas con etiqueta fluorescente con el fin de optimizar el tiempo de operación para la máxima recuperación de las partículas enriquecidas. Las intensidades de fluorescencia en todas las áreas de muestra se cuantificaron con el software ImageJ.Antes del proceso de enriquecimiento, las microvesículas y los exosomas se dispersaron en todas las áreas de la muestra con una disminución gradual de la intensidad. Después de 10 minutos de procesamiento, las partículas migraron electro-fíneticamente y un enchufe de pre-concentración instantánea apareció en la capa siete. Cuando el tiempo llegó a los 20 minutos, las microvesículas y los exosomas se centraban fuertemente en las capas ocho y nueve y enriquecían cinco veces en función de las intensidades de fluorescencia.La integridad de las microvesículas y exosomas enriquecidos en la capa ocho se investigó con SEM. Sem. Se observaron significativamente más partículas no dañadas después del proceso de enriquecimiento. También se analizó la distribución del tamaño de las microvesículas y exosomas enriquecidos.Posteriormente, se analizó la concentración real de las microvesículas y exosomas enriquecidos en las áreas de muestra en las capas seis, ocho y 10. En la capa ocho, las microvesículas y los exosomas fueron preconcentrados por un factor de 5,58, pero no se observó ninguna preconcentración notable en las otras capas. Para garantizar la reproducibilidad de este procedimiento, siguió con precisión el protocolo para el tiempo y la temperatura de incubación del horno durante la verificación del dispositivo y el tiempo de funcionamiento del dispositivo, ya que esas son las condiciones optimizadas.El XO Pad también se puede utilizar para separar y aislar la vesícula extracelular de muestras ricas en proteínas, como suero o plasma, mediante el uso de tampón de carbonato. Este protocolo puede proporcionar una herramienta de preparación eficiente y sencilla, con sus capacidades de pre-concentración y aislamiento necesarias para la investigación clínica, como el diagnóstico, la administración de medicamentos, la inmunoterapia y otras terapias.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Identification of Plant Ice-binding Proteins Through Assessment of Ice-recrystallization Inhibition and Isolation Using Ice-affinity Purification

Identificación de proteínas vegetales de hielo de unión a través de la evaluación de la inhibición de hielo-recristalización y Aislamiento Uso de purificación de hielo-afinidad

Ice-binding proteins (IBPs) belong to a family of stress-induced proteins that are synthesized by certain organisms exposed to subzero temperatures. In ...

Investigación

Bioquímica

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Aislamiento y medidas respiratoria de las mitocondrias de Arabidopsis thaliana

Mitochondria are essential organelles involved in numerous metabolic pathways in plants, most notably the production of adenosine triphosphate (ATP) from ...

Protein Digestion, Ultrafiltration, and Size Exclusion Chromatography to Optimize the Isolation of Exosomes from Human Blood Plasma and Serum

Digestión de proteínas, ultrafiltración y cromatografía por exclusión de tamaño para optimizar el aislamiento de exosomas de suero y Plasma de sangre humana

Exosomes, a type of nanovesicle released from all cell types, can be isolated from any bodily fluid. The contents of exosomes, including proteins and ...

Rapid Isolation of the Mitoribosome from HEK Cells

Aislamiento rápido de la Mitoribosome de las células HEK

The human mitochondria possess a dedicated set of ribosomes (mitoribosomes) that translate 13 essential protein components of the oxidative ...

Detection and Isolation of Apoptotic Bodies to High Purity

Detección y aislamiento de cuerpos apoptóticos de alta pureza

Apoptotic bodies (ApoBDs), microvesicles and exosomes are the key members of the extracellular vesicle family, with ApoBDs being one of the largest type. ...

Isolation of Physiologically Active Thylakoids and Their Use in Energy-Dependent Protein Transport Assays

Aislamiento de tilacoides fisiológicamente activos y su uso en ensayos de transporte dependiente de energía

Chloroplasts are the organelles in green plants responsible for carrying out numerous essential metabolic pathways, most notably photosynthesis. Within ...

Isolation of Glomeruli and In Vivo Labeling of Glomerular Cell Surface Proteins

Isolation of Glomeruli and In Vivo Labeling of Glomerular Cell Surface Proteins

Aislamiento de glomérulos y en Vivo de etiquetado de proteínas de la superficie celular Glomerular

Proteinuria results from the disruption of the glomerular filter that is composed of the fenestrated endothelium, glomerular basement membrane, and ...

Looking Outwards: Isolation of Cyanobacterial Released Carbohydrate Polymers and Proteins

Mirando hacia afuera: Aislamiento de polímeros y proteínas de carbohidratos liberados de cianobacteria

Cyanobacteria can actively secrete a wide range of biomolecules into the extracellular environment, such as heteropolysaccharides and proteins. The ...

Isolation and Analysis of Plasma Lipoproteins by Ultracentrifugation

Aislamiento y análisis de lipoproteínas plasmáticas por ultracentrifugación

Analysis of plasma lipoproteins and apolipoproteins is an essential part for the diagnosis of dyslipidemia and studies of lipid metabolism and ...

Isolation of Active Caenorhabditis elegans Nuclear Extract and Reconstitution for In Vitro Transcription

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Aislamiento del extracto nuclear activo de Caenorhabditis elegans y reconstitución para la transcripción in vitro

Caenorhabditis elegans has been an important model system for biological research since it was introduced in 1963. However, C. elegans has not been fully ...