Name: paper-based preconcentration and isolation of microvesicles and exosomes
Uploaded: 2020-04-29T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Paper-Based Preconcentration and Isolation of Microvesicles and Exosomes at JoVE.com

Denna studie stöddes av National Research Foundation of Korea, Grant NRF-2018R1D1A1A09084044. J. H. Lee fick stöd av ett forskningsanslag från Kwangwoon University 2019. Hyerin Kim stöddes av "Kompetensutvecklingsprogrammet för industrispecialister" vid det koreanska ministeriet för handel, industri och energi (MOTIE), som drivs av Korea Institute for Advancement of Technology (KIAT) (Nr. P0002397, HRD-program för industriell konvergens av bärbara smarta enheter).

1. Tillverkning av anordningar
<ol><li>Definiera den region som ska skrivas ut på papper med hjälp av skrivarprogramvara (Tabell över material). OBS: Konstruktionen har 12 vaxmönstrerade skikt där diametern på de cirkulära provområdena gradvis smalnar från 5 mm till 2 mm (figur 1A).</li>
	<li>Skriv ut hydrofoba vax på de angivna områdena på båda sidor av cellulosapapperet(Tabell över material)med hjälp av ett tryckerier för handelsvax (<...

<ol>
	<li>Edgar, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Q+&amp;+A:+What+are+exosomes,+exactly.">Q &amp; A: What are exosomes, exactly.</a> BMC Biology. 14 (1), 1-7 (2016).</li><li>Contreras-Naranjo, J. C., Wu, H. J., Ugaz, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics+for+exosome+isolation+and+analysis:+Enabling+liquid+biopsy+for+personalized+medicine.">Microfluidics for exosome isolation and analysis: Enabling liquid biopsy for personalized medicine.</a> Lab on a Chip. 17 (21), 3558-3577 (2017).</li><li>Simons, M., Raposo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+-+vesicular+carriers+for+intercellular+communication.">Exosomes - vesicular carriers for intercellular communication.</a> Current Opinion in Cell Biology. 21 (4), 575-581 (2009).</li><li>St&#229;hl, A. L., Johansson, K., Mossberg, M., Kahn, R., Karpman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+and+microvesicles+in+normal+physiology,+pathophysiology,+and+renal+diseases.">Exosomes and microvesicles in normal physiology, pathophysiology, and renal diseases.</a> Pediatric Nephrology. 34 (1), 11-30 (2019).</li><li>Chen, C., Lin, B. R., Hsu, M. Y., Cheng, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paper-based+devices+for+isolation+and+characterization+of+extracellular+vesicles.">Paper-based devices for isolation and characterization of extracellular vesicles.</a> Journal of Visualized Experiments. (98), e52722 (2015).</li><li>Kim, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origami-paper-based+device+for+microvesicle/exosome+preconcentration+and+isolation.">Origami-paper-based device for microvesicle/exosome preconcentration and isolation.</a> Lab on a Chip. 19 (23), 3917-3921 (2019).</li><li>Raposo, G., Stoorvogel, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles:+Exosomes,+microvesicles,+and+friends.">Extracellular vesicles: Exosomes, microvesicles, and friends.</a> Journal of Cell Biology. 200 (4), 373-383 (2013).</li><li>Lee, Y., El Andaloussi, S., Wood, M. J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+and+microvesicles:+Extracellular+vesicles+for+genetic+information+transfer+and+gene+therapy.">Exosomes and microvesicles: Extracellular vesicles for genetic information transfer and gene therapy.</a> Human Molecular Genetics. 21, 125-134 (2012).</li><li>Liu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Field-Free+Isolation+of+Exosomes+from+Extracellular+Vesicles+by+Microfluidic+Viscoelastic+Flows.">Field-Free Isolation of Exosomes from Extracellular Vesicles by Microfluidic Viscoelastic Flows.</a> ACS Nano. 11 (7), 6968-6976 (2017).</li><li>Marczak, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+isolation+and+preconcentration+of+exosomes+by+ion+concentration+polarization.">Simultaneous isolation and preconcentration of exosomes by ion concentration polarization.</a> Electrophoresis. 39 (15), 2029-2038 (2018).</li><li>Livshts, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+exosomes+by+differential+centrifugation:+Theoretical+analysis+of+a+commonly+used+protocol.">Isolation of exosomes by differential centrifugation: Theoretical analysis of a commonly used protocol.</a> Scientific Reports. 5, 1-14 (2015).</li><li>Chiriac&#242;, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lab-on-chip+for+exosomes+and+microvesicles+detection+and+characterization.">Lab-on-chip for exosomes and microvesicles detection and characterization.</a> Sensors. 18 (10), 3175 (2018).</li><li>Lobb, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+exosome+isolation+protocol+for+cell+culture+supernatant+and+human+plasma.">Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 4 (1), 1-11 (2015).</li><li>Taylor, D. D., Shah, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+of+isolating+extracellular+vesicles+impact+down-stream+analyses+of+their+cargoes.">Methods of isolating extracellular vesicles impact down-stream analyses of their cargoes.</a> Methods. 87, 3-10 (2015).</li><li>Han, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrokinetic+size-based+spatial+separation+of+micro/nanospheres+using+paper-based+3d+origami+preconcentrator.">Electrokinetic size-based spatial separation of micro/nanospheres using paper-based 3d origami preconcentrator.</a> Analytical Chemistry. 91 (16), 10744-10749 (2019).</li><li>Yeh, S. H., Chou, K. H., Yang, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sample+pre-concentration+with+high+enrichment+factors+at+a+fixed+location+in+paper-based+microfluidic+devices.">Sample pre-concentration with high enrichment factors at a fixed location in paper-based microfluidic devices.</a> Lab on a Chip. 16 (5), 925-931 (2016).</li></ol>

Även om Exo-PAD användes framgångsrikt för anrikning och isolering av mikrovessicles och exosomer, bör flera kritiska punkter noga övervägas: 1) ugnen inkubationstid och temperatur under enheten beredning, 2) bearbetningstid, 3) tillämpning av spänning med varierande skikt nummer och prov områdesdiametrar, och 4) tillämplighet på kliniska prover.
Inkubationstiden och temperaturen som anges i protokollet är optimerade förhållanden för att tillverka en tillförlitlig enhet. Läng...

Mikrovesiklar och exosomer är små membranblåsor som mäter 0,2−1 μm respektive 30−200 nm. De utsöndras i den extracellulära miljön med flera olika celltyper1,,2,,3,,4,5. De innehåller föräldrarnas cellinformation i form av delmängder av DNA, mRNA, miRNA, proteiner och lipider, och cirkulerar i hela kroppen via olika kroppsvätskor såsom serum, plasma, urin, ryggmärgsvätska, fostervatten och saliv6,,7,,8,9. Således kan tekniker för effektiv isolering av mikrovessicles och exosomer från biologiska vätskor ge omfattande möjligheter inom områdena diagnos, prognos och realtidsövervakning av sjukdomar, samt i utvecklingen av nya terapier.
Den konventionella isoleringsmetoden för mikrovessicles och exosomer baserade på ultracentrifugering är dock extremt tidskrävande och orsakar betydande förlust och kontaminering av provet. Detta beror på att det innebär flera besvärliga pipettering och lastning steg och kasta olika reagenser med upprepade ultracentrifugering5,6,10,11,12. Dessutom kan den höga skjuvspänning som orsakas av ultracentrifugering (~100 000 x g) orsaka fysisk lys av mikrovessicles och exosomer, vilket ger dålig återhämtning (5−23%)6,13,14. Därför måste en mycket effektiv, diskret isoleringsteknik för mikrovesicles och exosomer utvecklas för att minska skador och förluster, vilket uppnår högre återvinningsgrad.
En origami-papper-baserad enhet (Exo-PAD) har utvecklats för enklare, mildare och mycket effektiv isolering av mikrovesiklar och exosomer6. Exo-PAD är ett flerfaldigt papper med seriekopplade provområden som gradvis minskar i diameter. Jonkoncentrationspolariseringstekniken (ICP), som är ett nanoelektroniskt fenomen som prekoncentrerar laddade biomolekyler, integrerades med denna unika design. Med hjälp av Exo-PAD resulterade i femfaldig anrikning av mikrovesiklar och exosomer i specifika lager och deras isolering genom att helt enkelt fälla ut enheten. I den här artikeln beskrivs Exo-PAD i detalj, från den övergripande enheten tillverkning och drift till analys av dess användning, för att illustrera metoden och visa representativa resultat6.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1356px;" width="1355">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:397px;">Ag/AgCl electrodes</td>
			<td style="width:207px;">A-M Systems, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">531500</td>
			<td style="width:633px;">0.15&#34; diameter</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Albumin from Bovine Serum (BSA), Alexa Fluor 594 conjugate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A13101</td>
			<td>BSA conjugated with Alexa Fluor 594 (Ex/Em: 590/617 nm)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Carbonate-Bicarbonate Buffer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C3041-50CAP</td>
			<td>Carbonate buffer</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">CorelDraw software (Coral Co., Canada)</td>
			<td>Corel Corporation</td>
			<td></td>
			<td>Printer software to define wax printing region</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ColorQube 8870</td>
			<td>Xerox Corporation</td>
			<td></td>
			<td>Wax printer</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Chromatography paper grade 1</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>3001-861</td>
			<td>Cellulose paper, dimension: 20 * 20 cm</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fluorescent-labeled exosome standards</td>
			<td>HansaBioMed Life Sciences, Ltd.</td>
			<td>HBM-F-PEP-100</td>
			<td>Exosome labeled with FITC (Ex/Em: 490/520 nm)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Keithley 2410 current/voltage source-meter</td>
			<td>Keithley Instruments, Inc.</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Current&#8211;voltage source measurement system</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Nafion perfluorinated resin solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>31175-20-9</td>
			<td>Permselective membrane, 20 wt.% in the mixture of lower aliphatic alcohols and water; contains 34% water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NanoSight LM10</td>
			<td>NanoSight Technology</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Nanoparticle tracking analysis (NTA) machine</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphate-buffered saline (PBS, pH7.4)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10010001</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

paper-based preconcentration and isolation of microvesicles and exosomes

Microvesicles och exosomer är små membranösa blåsor släpps till den extracellulära miljön och cirkulerade i hela kroppen. Eftersom de innehåller olika föräldracell-härledda biomolekyler såsom DNA, mRNA, miRNA, proteiner och lipider, deras anrikning och isolering är avgörande steg för deras utnyttjande som potentiella biomarkörer för kliniska tillämpningar. Konventionella isoleringsmetoder (t.ex. ultracentrifugering) orsakar dock betydande förlust och skador på mikrovesicles och exosomer. Dessa metoder kräver också flera repetitiva steg av ultracentrifugering, lastning och slöseri med reagenser. I den här artikeln beskrivs en detaljerad metod för att tillverka en origami-pappersbaserad enhet (Exo-PAD) avsedd för effektiv anrikning och isolering av mikrovesiklar och exosomer på ett enkelt sätt. Exo-PAD:s unika design, som består av dragspelsliknande multifolded-lager med konvergenta provområden, är integrerad med jonkoncentrationspolariseringstekniken, vilket möjliggör femdubbling av mikrovesiklarna och exosomer på specifika lager. Dessutom är de berikade mikrovesicles och exosomer isolerade genom att helt enkelt veckla ut Exo-PAD.

Drifttiden måste optimeras för att uppnå maximal återhämtningsutbyte för de berikade mikrovesierna och exosomer. Otillräcklig tid tillåter inte tillräcklig migration av mikrovesiklar och exosomer, vilket minskar anrikningen, medan överdriven tid försämrar den rumsliga fokuseringen och därmed sprider mikrovesiklar och exosomer. Således, genom tid optimering steg, den maximala preconcentration faktor av mikrovesicles och exosomer och den slutliga platsen där mikrovesicles och exosomer är mest berikade kan i...

Watch this Scientific Journal Video about Paper-Based Preconcentration and Isolation of Microvesicles and Exosomes at JoVE.com

Paper-Based Preconcentration and Isolation of Microvesicles and Exosomes

Presenteras är ett protokoll för att tillverka en pappersbaserad enhet för effektiv anrikning och isolering av mikrovesicles och exosomer.

Pappersbaserad förkoncentration och isolering av mikrovesiklar och exosomer

Microvesicles and exosomes are small membranous vesicles released to the extracellular environment and circulated throughout the body. Because they ...

I detta protokoll beskriver vi en enkel metod för att fabricera en pappersbaserad enhet som kallas XO Pad, som är utformad för effektiv anrikning i isolering av extracellulära vesiklar. XO Pad är en enkel apparat som kan förkoncentrera och isolera extracellulär vesikel utan användning av några kemikalier eller arbetsmaskiner, samtidigt som den visar högre återvinningsgrad än konventionella metoder. Börja med att definiera den region som ska skrivas ut med skrivarprogram.Konstruktionen bör ha 12 vaxmönstrade lager där diametern på de cirkulära provområdena gradvis smalnar av fem till två millimeter. Tryck sedan hydrofoba vax på de angivna regionerna på båda sidor av cellulosapapperet. Placera vaxet tryckt papper i ett laboratorium ugn i 80 sekunder vid 120 grader Celsius, sedan skär vax tryckt papper med en fräs för att göra enskilda XO Pad enheter.Släpp en fem och två microliters av perm selektiva membran på provet områden i vänster mest och höger de flesta skikt, respektive. Placera lagren kodade med perm selektiva membran på en värmeplatta vid 70 grader Celsius i 30 minuter för att avdunsta lösningsmedlet. Sedan försegla yttersta ytan av belagda lagret inför buffertlösningen med tryckkänslig tejp, lämnar ett litet hål.Vik XO Pad enheten fram och tillbaka längs de vita linjerna för att konvergent ansluta alla provområden. Pipett 15 mikroliter av mikrovesikel- och exosomprovet i de konvergenta provområdena och vänta några sekunder för att säkerställa fullständig vätning. Placera två akrylkammare i båda ändar av XO Pad och kläm fast den säkert med små bindemedelsclips för att förhindra utfällning.Fyll kamrarna med 110 mikroliter på 0,1X PBS och sätt in två silverelektroder. Använd sedan ett strömspänningskällamätningssystem för att applicera 30 volt på elektroderna i 20 minuter. För att isolera de berikade mikrovesiklar och exosomer, separera den vikta XO Pad från akrylkamrarna och veckla ut enheten för att isolera de berikade partiklarna från de andra skikten.Stansa ut provområdena i lager åtta och nio där mikrovesiklar och exosomer är berikade för nedströmsanalys. En time-lapse migration analys av fluorescerande märkt mikrovesicles och exosomes utfördes i syfte att optimera driftstiden för maximal återvinning av de berikade partiklarna. Fluorescensintensiteterna i alla provområden kvantifierades med ImageJ-programvara.Innan anrikningsprocessen var mikrovesicles och exosomer spridda i alla provområden med en gradvis minskning av intensiteten. Efter 10 minuters bearbetning, migrerade partiklarna elektro-kinetiskt och en omedelbar pre-koncentration plugg dök upp på lager sju. När tiden nådde 20 minuter, microvesicles och exosomes var starkt inriktad på lager åtta och nio och berikade fem gånger baserat på fluorescens intensiteter.Integriteten hos de berikade mikrovesicles och exosomer i lager åtta undersöktes med SEM. Betydligt mer icke-skadade partiklar observerades efter anrikningsprocessen. Storleksfördelningen av de berikade mikrovesiclesna och exosomesna analyserades också.Därefter den faktiska koncentrationen av de berikade mikrovesicles och exosomes på provområdena i lager sex, åtta och 10 analyserades. I lager åtta var mikrovesiklar och exosomer pre-koncentrerade med en faktor 5,58, men ingen märkbar pre-koncentration observerades i de andra skikten. För att säkerställa reproducerbarheten av detta förfarande, exakt följt protokollet för ugn inkubationstid och temperatur under enhetens verifiering och enhetens drifttid eftersom det är de optimerade förhållandena.XO Pad kan också användas för att separera och isolera extracellulär vesikel från proteinrika prover, såsom serum eller plasma, genom att använda karbonatbuffert. Detta protokoll kan ge ett effektivt, enkelt förberedelseverktyg, med dess pre-koncentrera och isolera kapacitet som krävs för klinisk forskning, såsom diagnos, läkemedelsleverans, immunterapi och andra therapeutics.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Identification of Plant Ice-binding Proteins Through Assessment of Ice-recrystallization Inhibition and Isolation Using Ice-affinity Purification

Identifiering av växtisbindande proteiner genom bedömning av iskristallisationshämning och isolering med användning av isaffinitetsrening

Ice-binding proteins (IBPs) belong to a family of stress-induced proteins that are synthesized by certain organisms exposed to subzero temperatures. In ...

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Isolering och respiratoriska mätningar av mitokondrier från Arabidopsis thaliana.

Mitochondria are essential organelles involved in numerous metabolic pathways in plants, most notably the production of adenosine triphosphate (ATP) from ...

Protein Digestion, Ultrafiltration, and Size Exclusion Chromatography to Optimize the Isolation of Exosomes from Human Blood Plasma and Serum

Protein matsmältningen, ultrafiltrering och storlek utslagning kromatografi att optimera isolering av Exosomes från mänsklig blodplasma och Serum

Exosomes, a type of nanovesicle released from all cell types, can be isolated from any bodily fluid. The contents of exosomes, including proteins and ...

Rapid Isolation of the Mitoribosome from HEK Cells

Snabb isolering av Mitoribosome från HEK celler

The human mitochondria possess a dedicated set of ribosomes (mitoribosomes) that translate 13 essential protein components of the oxidative ...

Detection and Isolation of Apoptotic Bodies to High Purity

Upptäckt och isolering av apoptotiska kroppar till hög renhet

Apoptotic bodies (ApoBDs), microvesicles and exosomes are the key members of the extracellular vesicle family, with ApoBDs being one of the largest type. ...

Isolation of Physiologically Active Thylakoids and Their Use in Energy-Dependent Protein Transport Assays

Isolering av fysiologiskt aktiva Thylakoids och deras användning i energi-beroende Protein Transport analyser

Chloroplasts are the organelles in green plants responsible for carrying out numerous essential metabolic pathways, most notably photosynthesis. Within ...

Isolation of Glomeruli and In Vivo Labeling of Glomerular Cell Surface Proteins

Isolation of Glomeruli and In Vivo Labeling of Glomerular Cell Surface Proteins

Isolering av Glomeruli och In Vivo märkning av glomerulär Cell ytproteiner

Proteinuria results from the disruption of the glomerular filter that is composed of the fenestrated endothelium, glomerular basement membrane, and ...

Looking Outwards: Isolation of Cyanobacterial Released Carbohydrate Polymers and Proteins

Ser utåt: isolering av Cyanobakterial släppt kolhydrat polymerer och proteiner

Cyanobacteria can actively secrete a wide range of biomolecules into the extracellular environment, such as heteropolysaccharides and proteins. The ...

Isolation and Analysis of Plasma Lipoproteins by Ultracentrifugation

Isolering och analys av plasma lipoproteiner genom ultracentrifugation

Analysis of plasma lipoproteins and apolipoproteins is an essential part for the diagnosis of dyslipidemia and studies of lipid metabolism and ...

Isolation of Active Caenorhabditis elegans Nuclear Extract and Reconstitution for In Vitro Transcription

Isolation of Active Caenorhabditis elegans Nuclear Extract and Reconstitution for In Vitro Transcription

Isolering av aktiv caenorhabditis elegans kärnextrakt och rekonstitution för in vitro-transkription

Caenorhabditis elegans has been an important model system for biological research since it was introduced in 1963. However, C. elegans has not been fully ...