Name: native cell membrane nanoparticles system for membrane protein-protein interaction analysis
Uploaded: 2020-07-16T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Native Cell Membrane Nanoparticles System for Membrane Protein-Protein Interaction Analysis at JoVE.com

Cette recherche a été soutenue par le fonds de démarrage VCU (à Y.G.) et l’Institut national des sciences médicales générales des National Institutes of Health sous le numéro de prix R01GM132329 (à Y.G.) Le contenu est uniquement de la responsabilité des auteurs et ne représente pas nécessairement les vues officielles des Instituts nationaux de la santé. Nous remercions Montserrat Samso et Kevin McRoberts pour leur généreux soutien à l’enregistrement vidéo.

1. Expression protéique
<ol><li>Inoculer 15 mL de bouillon formidable (TB) médias avec des antibiotiques spécifiques aux plasmides avec BL21 (DE3) cellules pLysS contenant l’AcrB exprimant des plasmides dans des tubes de 50 mL pendant la nuit à 37 °C avec secousse à 250 rpm.</li>
	<li>Vérifiez la densité optique de la culture nocturne à 600 nm (OD600) et assurez-vous qu’elle est de plus de 2,0.</li>
	<li>Diluer 5 mL de culture cellulaire en 1 L de médias antituberculeux contenant des antibiotiq...

<ol>
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(90), e51087 (2014).</li><li>Lee, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+detergent-free+isolation+of+membrane+proteins+in+their+local+lipid+environment.">A method for detergent-free isolation of membrane proteins in their local lipid environment.</a> Nature Protocols. 11 (7), 1149-1162 (2016).</li><li>Hall, S. C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+acid-compatible+co-polymer+for+the+solubilization+of+membranes+and+proteins+into+lipid+bilayer-containing+nanoparticles.">An acid-compatible co-polymer for the solubilization of membranes and proteins into lipid bilayer-containing nanoparticles.</a> Nanoscale. 10 (22), 10609-10619 (2018).</li><li>Oluwole, A. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solubilization+of+Membrane+Proteins+into+Functional+Lipid-Bilayer+Nanodiscs+Using+a+Diisobutylene/Maleic+Acid+Copolymer.">Solubilization of Membrane Proteins into Functional Lipid-Bilayer Nanodiscs Using a Diisobutylene/Maleic Acid Copolymer.</a> Angewandte Chemie International Edition England. 56 (7), 1919-1924 (2017).</li></ol>

Les interactions protéine-protéine sont importantes pour l’intégrité de la structure et de la fonction des protéines membranaires. De nombreuses approches ont été développées pour étudier les interactions protéines-protéines. Par rapport aux protéines solubles, les protéines membranaires et leurs IPP sont plus difficiles à étudier en raison des propriétés intrinsèques uniques des protéines membranaires. Cette difficulté provient principalement de l’exigence de protéines membranaires à intégrer...

Les interactions protéine-protéine (IPP) jouent un rôle central tout au long de la biologie, depuis le maintien de la structure et de la fonction des protéines jusqu’à la régulation de systèmes entiers. Les IPP se sous de nombreuses formes différentes peuvent être classés en fonction des types d’interactions qu’ils forment. L’une de ces catégorisations est homooligomérique ou hétérooligomérique, selon que les interactions sont entre des sous-unités identiques ou différentes protéines agissant sous-units. Une autre catégorisation est basée sur la force de l’interaction si les interactions conduit à la formation de complexes stables ou d’états complexes transitoires. L’information structurelle sur les IPP entre les protéines est cruciale pour comprendre le mécanisme par lequel les protéines effectuent leur fonction. On estime que plus de 80 % des protéines reposent sur une formation complexe pour s’acquitter de leurs rôles fonctionnels1. Étant donné le pourcentage de protéines observées comme dépendant des IPP pour un bon fonctionnement inné, leur importance en biologie est évidente, mais être en mesure d’étudier correctement les protéines qui s’engagent dans ces interactions est resté difficile en raison des limitations dans les techniques disponibles pour observer expérimentalement lorsque les protéines forment des IPP.
Il y a un degré élevé de désaccord entre les résultats pour beaucoup d’IPP expérimentalement déterminés en raison de la quantité élevée de bruit, de faux positifs, et de faux négatifs qui sont dérivés de beaucoup des techniques de détermination actuellement disponibles de PPI. C’est particulièrement le cas pour le système de levure à deux hybrides (Y2H), la spectrométrie de purification de masse d’affinité en tandem (TAP-MS) et le transfert d’énergie par résonance fluorescence (FRET), qui représentent trois des méthodes les plus couramment utilisées pour la détermination PPI2,3,4,5,6,7. En comparaison, les techniques de biologie structurale protéique, telles que la résonance magnétique nucléaire (RM), la cristallographie aux rayons X et la microscopie électronique (EM), peuvent être utilisées pour obtenir des informations structurelles à haute résolution sur les interactions protéine-protéine jusqu’au niveau atomique et permettre la confirmation visuelle directe des interactions se produisant pour une protéine cible d’intérêt. Toutes les techniques de recherche non fondées sur la structure actuellement disponibles (p. ex., Y2H, TAP-MS et FRET) n’ont pas cette capacité et souffrent en outre de la difficulté à identifier les interactions faibles et transitoires entre les protéines5. Ces lacunes sont encore améliorées lors de l’étude des protéines membranaires en raison de la complexité supplémentaire provoquée par la variable supplémentaire de l’environnement lipidique qui influence la formation d’une structure quaternaire appropriée et d’un assemblage complexe hétéromérique.
Les protéines membranaires composent une grande partie du protéome et sont connues pour jouer de nombreux rôles cruciaux dans le bon fonctionnement cellulaire dans tous les organismes vivants. Malgré le fait que les protéines membranaires représentent 27 % du génome humain et constituent environ 60 % de toutes les cibles actuelles en matière demédicaments,il existe une anomalie majeure dans le nombre de modèles résolus pour les protéines membranaires qui ne représentent que ~2,2 % de toutes les structuresprotéiques publiées 8,9,10. La principale cause de l’écart dans la disponibilité de l’information structurelle réside dans les propriétés intrinsèques des protéines membranaires elles-mêmes. En raison de leur faible solubilité, de leur dépendance à l’égard des interactions avec un environnement lipidique pour maintenir la structure et la fonction indigènes, et des diverses propriétés physicochimiques de la membrane lipidique elle-même, les protéines membranaires continuent de représenter un problème important lors de la mise en œuvre de techniques de biologie structurelle pour les étudier. De ces propriétés intrinsèques, la plus importante pour obtenir des informations structurelles précises est l’exigence d’avoir des interactions avec leur environnement lipidique naturel pour qu’ils maintiennent leur structure et leur fonction indigènes. L’environnement lipidique fait tellement partie intégrante de la structure et de la fonction des protéines membranaires que le concept de mémtéine (une combinaison des mots membrane et protéine) a été proposé comme unité fondamentale de la structure membranaire-protéique et de lafonction 11. Malgré l’importance des interactions lipidiques-protéines, les techniques de détermination de l’IPP basées sur la structure actuellement disponibles exigent souvent que les protéines étudiées soient solubles ou solubilisées avec des détergents. L’exposition à des détergents durs peut dénaturer les protéines ou causer de faux positifs et négatifs dus à la délipidation, qui peut induire l’agrégation, la dénaturation des protéines, la dissociation des interactions non covalentes et la formation d’états oligomériques artificiels. En raison de la nécessité de maintenir un environnement lipidique naturel pour la détermination précise de l’état oligomérique indigène des protéines membranaires, nous avons développé un système de nanoparticules de membrane cellulaire indigène (NCMNs)12 basé sur les particules de lipides mâles mâles (SMALP) précédemment rapportées (SMALP)13 méthode.
SMALP utilise le copolymère acide masculin styrène comme polymère actif membranaire pour extraire et solubiliser les protéines membranaires. Poly (Styrene-co-Maleic Acid) (SMA) est un polymère amphiphilique unique en raison de sa mastic styrène hydrophobe et diamétralement opposée à la moiety acide masculin hydrophilique. Il forme des nanoparticules en adsorber, déstabilisant et perturbant la membrane cellulaire dans un mécanisme dépendant du pH14. Cette activité fonctionnelle de SMA est ce qui lui permet d’être utilisé comme un système sans détergent pour l’extraction des protéines membranaires et la solubilisation. Le système NCMN est distinct du système SMALP à plusieurs égards. La caractéristique la plus unique du système NCMN est qu’il dispose d’une bibliothèque de polymères actifs membranaires avec une multitude de polymères qui ont des propriétés uniques qui les rendent adaptés à l’isolement de nombreuses protéines membranaires différentes qui nécessitent des conditions différentes pour la stabilité et le fonctionnement natif. Le système NCMN a également des protocoles différents par rapport à la méthode SMALP quand il s’agit de préparer les nanoparticules. Un tel exemple est que les NCMN utilisent une purification de colonne d’affinité de nickel en une seule étape pour la détermination de la structure à haute résolution; l’effet de ces différents protocoles peut être observé lors de la comparaison du protocole NCMNs, qui a généré 3.2 et 3.0 Å cryo-EM AcrB structures, avec une étude similaire utilisant la méthode SMALP, qui a abouti à une structure cryo-EM AcrB à une résolution 8.8 Å12,15. Ces caractéristiques uniques du système NCMN sont les améliorations apportées à la méthode SMALP précédemment établie et en font un candidat idéal pour l’étude des IPP.
Le transporteur multidrogue efflux AcrB existe en tant qu’homotrimère fonctionnel dans E. coli12. Une analyse mutagène a suggéré qu’une mutation unique de point de P223G, située sur une boucle qui est responsable de la stabilité du trimer d’AcrB, déstabilise l’état de trimer et donne un monomère d’AcrB une fois préparé avec le DDM détergent, qui pourrait être détecté avec l’électrophoresis bleu indigène de gel16. Cependant, l’analyse fret du mutant AcrB-P223G a suggéré que lorsque dans l’environnement de la bicouche lipidique de la membrane cellulaire indigène, la majorité des mutants AcrB-P223G existaient encore en tant que trimer et que les niveaux d’expression pour les deux types sauvages AcrB et AcrB-P223G sont similaires. Pourtant, malgré les résultats de l’analyse fret, un essai d’activité pour le transporteur mutant a montré que l’activité a considérablement diminué par rapport au typesauvage 16. Bien que la technologie FRET ait été populairement utilisée pour l’analyse des interactions protéines-protéines, la recherche a montré qu’elle peut souvent donner de faux positifs17,18,19,20.
Récemment, des structures cryo-EM à haute résolution du trimer AcrB ont été déterminées qui ont montré l’interaction de l’AcrB avec sa bicouche lipidique de membrane cellulaire indigène associée par l’utilisation des NCMNs12. En principe, les NCMN peuvent facilement être utilisés pour l’analyse des interactions protéine-protéine trouvées sur la membrane cellulaire indigène. Lors d’un test de ce système, des expériences ont été menées pour observer directement l’état oligomérique de l’AcrB-P223G avec l’utilisation de nanoparticules de membrane cellulaire indigène et de microscopie électronique colorante négative. Afin de comparer avec les nanoparticules sauvages de type AcrB, nous avons utilisé le même polymère actif membranaire (SMA2000 fabriqué dans notre laboratoire, qui est indexé comme NCMNP1-1 dans la bibliothèque NCMN) utilisé pour la détermination de la structure cryo-EM à haute résolution de l’AcrB et des polymères alternatifs trouvés dans la bibliothèquenCMNs 12. D’après les résultats précédemment rapportés, on s’attendait à ce que la majorité du mutant AcrB-P223G existe sous forme de nanoparticules de membrane cellulaire indigène trimeric21. Cependant, aucun trimers AcrB n’a été trouvé présent dans l’échantillon, comme ceux qui ont été observés avec le type sauvage AcrB. Ceci suggère que la majorité d’AcrB-P223G ne forme pas de garnitures sur la membrane cellulaire indigène comme précédemment suggéré.
Ici, nous rapportons une analyse détaillée du mutant E. coli AcrB-P223G dans une comparaison avec le type sauvage E. coli AcrB en utilisant les NCMN. Cette étude de cas de l’AcrB suggère que les NCMN sont un bon système pour l’analyse d’interaction protéine-protéine.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30% Acrylamide/BIS SOL (37.5:1)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4x Laemmli Sample Buffer (Loading Buffer)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610747</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid Glacial</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A38S-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Persulfate (APS)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>Goldbio</td>
			<td>C-105-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie Brilliant Blue R-250 protein stain powder</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT (Dithiothreitol) (&#62; 99% pure) Protease free</td>
			<td>Goldbio</td>
			<td>DTT10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>G33-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>BP310-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Affymetrix</td>
			<td>17525 1 KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG</td>
			<td>Goldbio</td>
			<td>I2481C100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin</td>
			<td>Goldbio</td>
			<td>K-120-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride hexahydrate</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AA3622636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A412-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N-dimethylethylenediamine (EDTA)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>8.03779.0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NCMNS-P5-2</td>
			<td>Not commercially available yet</td>
			<td>Submit request for obtaining to corresponding author</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision Plus Protein Dual Color Standard</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0374</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS (Sodium Dodecyl Sulfate)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SMA2000</td>
			<td>Cray Valley</td>
			<td>Submit request for obtaining to corresponding author</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>S271-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCEP-HCl</td>
			<td>Goldbio</td>
			<td>TCEP25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Terrific Broth Media</td>
			<td>Affymetrix</td>
			<td>75856 1 KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0719</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl Acetate</td>
			<td>Ambinter</td>
			<td>Amb22348393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avanti J-26S XPI</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>B14538</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avanti JXN-30</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>B34193</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon Electron Microscope Grids (10 nm)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>CF300-Cu-TH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Con-Torque Tissue Homogenizer</td>
			<td>Eberbach</td>
			<td>E7265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning LSE Mini Microcentrifuge</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>07-203-954</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EmulsiFlex-C3</td>
			<td>Avestin</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fraction Collector F9-R</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>29003875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>165-8004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop 2000 Spectrophotometer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>ND-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima L-90K Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>PN LL-IM-12AB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PELCO easiGlow Glow Discharge Cleaning System</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>91000S-230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potter-Elvehjem Safe Grind Tissue Grinder</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td>358013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerPac Basic Power Supply</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>164-5050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razel R99-E Variable Speed Syringe Pump</td>
			<td>Razel Scientific Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superdex 200 Increase 10/300 GL</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>28990944</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tecnai F20 200kV</td>
			<td>FEI</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type 70 Ti Fixed-Angle Rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>General Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 ml Microcentrifuge Tubes</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 ml Amicon Ultra-4 30 kDa</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>UFC803024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AKTA pure 25 L1 FPLC</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>29018225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BL21(DE3)pLysS Cells</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>C606003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 50 ml Conical Centrifuge Tube</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14-959-49A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HisTrap HP 5 ml Column</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>17524802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pET-24a</td>
			<td>EMD Biosciences</td>
			<td>69749-3</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

native cell membrane nanoparticles system for membrane protein-protein interaction analysis

Les interactions protéine-protéine dans les systèmes membranaires cellulaires jouent un rôle crucial dans un large éventail de processus biologiques, des interactions cellule à cellule à la transduction du signal; de la détection des signaux environnementaux à la réponse biologique; de la régulation métabolique au contrôle du développement. Des informations structurelles précises sur les interactions protéine-protéine sont cruciales pour comprendre les mécanismes moléculaires des complexes protéiques membranaires et pour la conception de molécules très spécifiques pour moduler ces protéines. De nombreuses approches in vivo et in vitro ont été développées pour la détection et l’analyse des interactions protéine-protéine. Parmi eux, l’approche de biologie structurelle est unique en ce qu’elle peut fournir des informations structurelles directes sur les interactions protéines-protéines au niveau atomique. Cependant, la biologie structurale des protéines membranaires actuelles est encore largement limitée aux méthodes à base de détergent. L’inconvénient majeur des méthodes à base de détergent est qu’elles dissocient ou dnaturent souvent les complexes protéiques membranaires une fois que leur environnement de bicouche lipidique indigène est éliminé par des molécules détergentes. Nous avons développé un système de nanoparticules de membrane cellulaire indigène pour la biologie structurale de protéine de membrane. Ici, nous démontrons l’utilisation de ce système dans l’analyse des interactions protéine-protéine sur la membrane cellulaire avec une étude de cas de l’état oligomérique de l’AcrB.

À l’aide des procédures présentées ici, des échantillons de type sauvage E. coli AcrB et de mutant e. coli AcrB-P223G ont été purifiés. Les échantillons ont ensuite été adsorbés à des grilles de microscopie électronique tache négative de carbone et tachés à l’aide d’acétate d’uranyle avec la méthode de ballonnementlatéral 22. Des images négatives de tache ont été rassemblées utilisant la microscopie électronique de transmission. L’image de tache...

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Native Cell Membrane Nanoparticles System for Membrane Protein-Protein Interaction Analysis

Présenté ici est un protocole pour la détermination de l’état oligomérique des protéines membranaires qui utilise un système de nanoparticules de membrane cellulaire indigène en conjonction avec la microscopie électronique.

Système de nanoparticules de membrane cellulaire indigène pour l’analyse d’interaction protéine-protéine de membrane

Protein-protein interactions in cell membrane systems play crucial roles in a wide range of biological processes- from cell-to-cell interactions to signal ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Method for Identifying Small Molecule Inhibitors of the Protein-protein Interaction Between HCN1 and TRIP8b

Procédé pour l&#39;identification d&#39;inhibiteurs de petites molécules de l&#39;interaction protéine-protéine entre HCN1 et TRIP8b

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the ...

Recherche

Biochimie

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

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Utilisation de Scaffold Liposomes à Reconstituer interactions protéine-protéine Lipid-proximal<em&gt; In vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

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