Name: native cell membrane nanoparticles system for membrane protein-protein interaction analysis
Uploaded: 2020-07-16T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Native Cell Membrane Nanoparticles System for Membrane Protein-Protein Interaction Analysis at JoVE.com

Diese Forschung wurde vom VCU Startup Fund (zu Y.G.) und dem National Institute of General Medical Sciences der National Institutes of Health unter der Award-Nummer R01GM132329 (zu Y.G.) unterstützt. Der Inhalt liegt allein in der Verantwortung der Autoren und stellt nicht unbedingt die offizielle Meinung der National Institutes of Health dar. Wir danken Montserrat Samso und Kevin McRoberts für ihre großzügige Unterstützung bei der Videoaufnahme.

1. Proteinexpression
<ol><li>Impfung von 15 ml Terrific Broth (TB) Medien mit plasmidspezifischen Antibiotika mit BL21(DE3) pLysS-Zellen, die die AcrB-Exzids in 50 ml-Röhrchen über Nacht bei 37 °C mit Schütteln bei 250 U/min exemitenken.</li>
	<li>Überprüfen Sie die optische Dichte der Nachtkultur bei 600 nm (OD600) und stellen Sie sicher, dass sie über 2,0 liegt.</li>
	<li>5 ml Zellkultur in 1 L TB-Medien verdünnen, die plasmidspezifische Antibiotika enthalten, und bei 37 °C mit Schütteln bis OD<s...

<ol>
	<li>Berggard, T., Linse, S., James, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+the+detection+and+analysis+of+protein-protein+interactions.">Methods for the detection and analysis of protein-protein interactions.</a> Proteomics. 7 (16), 2833-2842 (2007).</li><li>Huang, H., Bader, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precision+and+recall+estimates+for+two-hybrid+screens.">Precision and recall estimates for two-hybrid screens.</a> Bioinformatics. 25 (3), 372-378 (2009).</li><li>Serebriiskii, I. G., Golemis, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-hybrid+system+and+false+positives.+Approaches+to+detection+and+elimination.">Two-hybrid system and false positives. Approaches to detection and elimination.</a> Methods in Molecular Biology. 177, 123-134 (2001).</li><li>Gingras, A. C., Gstaiger, M., Raught, B., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+protein+complexes+using+mass+spectrometry.">Analysis of protein complexes using mass spectrometry.</a> Nature Reviews in Molecular Cell Biology. 8 (8), 645-654 (2007).</li><li>Ngounou Wetie, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigation+of+stable+and+transient+protein-protein+interactions:+Past,+present,+and+future.">Investigation of stable and transient protein-protein interactions: Past, present, and future.</a> Proteomics. 13 (3-4), 538-557 (2013).</li><li>Schaufele, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maximizing+the+quantitative+accuracy+and+reproducibility+of+Forster+resonance+energy+transfer+measurement+for+screening+by+high+throughput+widefield+microscopy.">Maximizing the quantitative accuracy and reproducibility of Forster resonance energy transfer measurement for screening by high throughput widefield microscopy.</a> Methods. 66 (2), 188-199 (2014).</li><li>Berney, C., Danuser, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FRET+or+no+FRET:+a+quantitative+comparison.">FRET or no FRET: a quantitative comparison.</a> Biophysical Journal. 84 (6), 3992-4010 (2003).</li><li>Almen, M. 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(90), e51087 (2014).</li><li>Lee, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+detergent-free+isolation+of+membrane+proteins+in+their+local+lipid+environment.">A method for detergent-free isolation of membrane proteins in their local lipid environment.</a> Nature Protocols. 11 (7), 1149-1162 (2016).</li><li>Hall, S. C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+acid-compatible+co-polymer+for+the+solubilization+of+membranes+and+proteins+into+lipid+bilayer-containing+nanoparticles.">An acid-compatible co-polymer for the solubilization of membranes and proteins into lipid bilayer-containing nanoparticles.</a> Nanoscale. 10 (22), 10609-10619 (2018).</li><li>Oluwole, A. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solubilization+of+Membrane+Proteins+into+Functional+Lipid-Bilayer+Nanodiscs+Using+a+Diisobutylene/Maleic+Acid+Copolymer.">Solubilization of Membrane Proteins into Functional Lipid-Bilayer Nanodiscs Using a Diisobutylene/Maleic Acid Copolymer.</a> Angewandte Chemie International Edition England. 56 (7), 1919-1924 (2017).</li></ol>

Protein-Protein-Wechselwirkungen sind wichtig für die Integrität der Struktur und Funktion von Membranproteinen. Viele Ansätze wurden entwickelt, um Protein-Protein-Wechselwirkungen zu untersuchen. Im Vergleich zu löslichen Proteinen sind Membranproteine und ihre PPI aufgrund der einzigartigen intrinsischen Eigenschaften von Membranproteinen schwieriger zu untersuchen. Diese Schwierigkeit ergibt sich vor allem aus der Anforderung von Membranproteinen, die in eine native Lipid-Bilayer-Umgebung eingebettet werden müss...

Protein-Protein-Wechselwirkungen (PPI) spielen in der gesamten Biologie eine zentrale Rolle, von der Aufrechterhaltung der Struktur und Funktion von Proteinen bis hin zur Regulierung ganzer Systeme. PPIs gibt es in vielen verschiedenen Formen und können basierend auf den Arten von Interaktionen kategorisiert werden, die sie bilden. Eine solche Kategorisierung ist homooligomer oder heterooligomer, je nach, ob die Wechselwirkungen zwischen identischen Untereinheiten oder verschiedenen Proteinen, die als Untereinheiten wirken, bestehen. Eine weitere Kategorisierung basiert auf der Stärke der Wechselwirkung, wenn die Wechselwirkungen zur Bildung stabiler Komplexe oder transienter komplexer Zustände führen. Strukturelle Informationen über die PPI zwischen Proteinen sind entscheidend für das Verständnis des Mechanismus, mit dem Proteine ihre Funktion erfüllen. Es wurde geschätzt, dass über 80% der Proteine auf komplexe Bildung angewiesen sind, um ihre funktionellen Rollen durchzuführen1. Angesichts des Prozentsatzes der Proteine, die für eine ordnungsgemäße angeborene Funktion auf PPI angewiesen sind, ist ihre Bedeutung in der Biologie leicht erkennbar, aber die Fähigkeit, die Proteine, die an diesen Wechselwirkungen teilnehmen, richtig untersuchen zu können, ist aufgrund der Beschränkungen der Techniken, die zur experimentellen Beobachtung zur Verfügung stehen, um zu beobachten, wann Proteine PPI bilden, eine Herausforderung geblieben.
Es gibt ein hohes Maß an Uneinigkeit zwischen den Ergebnissen für viele experimentell ermittelte PPI aufgrund der hohen Menge an Rauschen, falsch positive und falsche Negative, die von vielen der derzeit verfügbaren PPI-Bestimmungstechniken abgeleitet werden. Dies gilt insbesondere für das Hefe-Zwei-Hybrid-System (Y2H), die Tandem-Affinitätsreinigungs-Massenspektrometrie (TAP-MS) und die Fluoreszenzresonanz-Energieübertragung (FRET), die drei der am häufigsten verwendeten Methoden zur PPI-Bestimmung2,3,4,5,6,7darstellen. Im Vergleich dazu können proteinstrukturbiologische Techniken wie Kernspinresonanz (NMR), Röntgenkristallographie und Elektronenmikroskopie (EM) verwendet werden, um hochauflösende Strukturinformationen über Protein-Protein-Wechselwirkungen bis auf atomare Ebene zu gewinnen und eine direkte visuelle Bestätigung der Wechselwirkungen zu ermöglichen, die für ein Zielprotein von Interesse auftreten. Alle derzeit verfügbaren nicht-strukturbasierten PPI-bestimmenden Forschungstechniken (z. B. Y2H, TAP-MS und FRET) haben diese Fähigkeit und leiden zusätzlich unter Schwierigkeiten bei der Identifizierung schwacher und vorübergehender Wechselwirkungen zwischen Proteinen5. Diese Unzulänglichkeiten werden bei der Untersuchung von Membranproteinen aufgrund der zusätzlichen Komplexität, die durch die zusätzliche Variable der Lipidumgebung, die die Bildung einer richtigen quaternären Struktur und heteromeren komplexen Montage beeinflusst, noch verstärkt.
Membranproteine machen einen großen Teil des Proteoms aus und sind dafür bekannt, viele entscheidende Rollen bei der ordnungsgemäßen Zellfunktion in allen lebenden Organismen zu spielen. Trotz der Tatsache, dass Membranproteine schätzungsweise 27 % des menschlichen Genoms ausmachen und 60 % aller aktuellen Wirkstoffziele ausmachen, gibt es eine große Anomalie in der Anzahl der gelösten Modelle für Membranproteine, die nur 2,2 % aller veröffentlichten Proteinstrukturenausmachen 8,9,10. Die Hauptursache für die Diskrepanz bei der Verfügbarkeit von Strukturinformationen liegt in den intrinsischen Eigenschaften von Membranproteinen selbst. Aufgrund ihrer schlechten Löslichkeit, der Abhängigkeit von Wechselwirkungen mit einer Lipidumgebung zur Aufrechterhaltung der einheimischen Struktur und Funktion und der verschiedenen physikalisch-chemischen Eigenschaften der Lipidmembran selbst stellen Membranproteine weiterhin ein wesentliches Problem bei der Implementierung strukturbiologischer Techniken zur Untersuchung dar. Von diesen intrinsischen Eigenschaften ist die wichtigste für die Beschaffung genauer struktureller Informationen die Anforderung, Wechselwirkungen mit ihrer natürlichen Lipidumgebung zu haben, damit sie ihre native Struktur und Funktion erhalten. Die Lipidumgebung ist ein so integraler Bestandteil der Struktur und Funktion von Membranproteinen, dass das Konzept von Memtein (eine Kombination der Wörter Membran und Protein) als grundlegende Einheit der Membran-Protein-Struktur und Funktion vorgeschlagen wurde11. Trotz der Bedeutung von Lipid-Protein-Wechselwirkungen erfordern die derzeit verfügbaren strukturbasierten PPI-Bestimmungstechniken oft, dass die untersuchten Proteine löslich sind oder mit Reinigungsmitteln löslich sind. Die Exposition gegenüber harten Waschmitteln kann die Proteine denaturiert oder falsche Positiv- und Negative aufgrund von Delipidation verursachen, die Aggregation, Denaturierung von Protein, Dissoziation nicht-kovalenter Wechselwirkungen und Bildung künstlicher oligomerer Zustände induzieren können. Aufgrund der Notwendigkeit, eine natürliche Lipidumgebung für die genaue Bestimmung des nativen oligomeren Zustands von Membranproteinen zu erhalten, haben wir ein Native Cell Membrane Nanoparticles System (NCMNs)12 auf Basis der zuvor berichteten Styrol Maleic Acid Lipid Particles (SMALP)13 Methode entwickelt.
SMALP verwendet Styrol-Maleinsäure-Copolymer als membranaktives Polymer, um Membranproteine zu extrahieren und zu löslich. Poly (Styrene-Co-Maleic Acid) (SMA) ist ein einzigartiges amphiphiles Polymer aufgrund seiner hydrophoben Styrol-Moiety und diametral entgegengesetzten hydrophilen Maleinsäure-Moiety. Es bildet Nanopartikel, indem es in einem pH-abhängigen Mechanismus14adsorbiert, destabilisiert und die Zellmembran stört. Diese funktionelle Aktivität von SMA ermöglicht es, als waschmittelfreies System für membranproteinextraktion und Löslichkeit verwendet werden. Das NCMN-System unterscheidet sich in mehreren Aspekten vom SMALP-System. Das einzigartigste Merkmal des NCMN-Systems ist, dass es eine membranaktive Polymerbibliothek mit einer Vielzahl von Polymeren hat, die einzigartige Eigenschaften haben, die sie für die Isolierung vieler verschiedener Membranproteine geeignet machen, die unterschiedliche Bedingungen für Stabilität und native Funktion erfordern. Das NCMN-System hat auch andere Protokolle im Vergleich zur SMALP-Methode, wenn es um die Herstellung der Nanopartikel geht. Ein beispiel dafür ist, dass NCMNs eine einstufige Nickelaffinitätssäulenreinigung für die hochauflösende Strukturbestimmung verwenden. die Wirkung dieser verschiedenen Protokolle kann beim Vergleich des NCMNs-Protokolls, das 3,2 und 3,0 -C-Cryo-EM-AcrB-Strukturen erzeugte, mit einer ähnlichen Studie mit der SMALP-Methode beobachtet werden, die zu einer Kryo-EM-AcrB-Struktur mit einer Auflösung von 8,8 °12,15führte. Diese einzigartigen Merkmale des NCMN-Systems sind die Verbesserungen an der zuvor etablierten SMALP-Methode und machen es zu einem idealen Kandidaten für die Untersuchung von PPI.
Der Multidrug Efflux Transporter AcrB existiert als funktioneller Homotrimer in E. coli12. Eine mutagene Analyse ergab, dass eine einzelne P223G-Punktmutation, die sich auf einer Schleife befindet, die für die Stabilität des AcrB-Trimmers verantwortlich ist, den Trimmerzustand destabilisiert und bei der Herstellung mit dem Waschmittel DDM ein AcrB-Monomer ergibt, das mit nativer Blaugelelektrophorese16nachgewiesen werden konnte. Die FRET-Analyse des AcrB-P223G-Mutanten ergab jedoch, dass in der nativen Zellmembran-Lipid-Bilayer-Umgebung die Mehrheit der mutierten AcrB-P223G noch als Trimmer existierte und dass die Expressionswerte für den Wildtyp AcrB und AcrB-P223G ähnlich sind. Doch trotz der ERGEBNISSE der FRET-Analyse zeigte ein Aktivitätstest für den mutierten Transporter, dass die Aktivität im Vergleich zum Wildtyp16dramatisch zurückging. Obwohl die FRET-Technologie im Volksmund für die Analyse von Protein-Protein-Wechselwirkungen verwendet wurde, hat die Forschung gezeigt, dass sie häufig falsch positive Ergebnisse geben kann17,18,19,20.
Kürzlich wurden hochauflösende Kryo-EM-Strukturen des AcrB-Trimers bestimmt, die die Wechselwirkung von AcrB mit der zugehörigen nativen Zellmembran Lipid-Bilayer durch den Einsatz der NCMNs12zeigten. Grundsätzlich können die NCMNs problemlos für die Analyse von Protein-Protein-Wechselwirkungen auf der nativen Zellmembran verwendet werden. In einem Test dieses Systems wurden Experimente durchgeführt, um den oligomeren Zustand von AcrB-P223G mit nativen Zellmembran-Nanopartikeln und negativer Färbeelektronenmikroskopie direkt zu beobachten. Um mit den wilden AcrB-Nanopartikeln zu vergleichen, verwendeten wir das gleiche membranaktive Polymer (SMA2000 made in our laboratory, which is indexed as NCMNP1-1 in the NCMN library), das für die hochauflösende Kryo-EM-Strukturbestimmung von AcrB und alternativen Polymeren verwendet wird, die in der NCMNs-Bibliothek gefunden werden12. Basierend auf den zuvor berichteten Ergebnissen wurde erwartet, dass die Mehrheit der AcrB-P223G-Mutation in Form von trimernativen Zellmembran-Nanopartikeln21existieren würde. Es wurden jedoch keine AcrB-Trimmer in der Stichprobe gefunden, wie z. B. diejenigen, die mit dem wilden Typ AcrB beobachtet wurden. Dies deutet darauf hin, dass die Mehrheit der AcrB-P223G nicht Trimmer auf der nativen Zellmembran bildet, wie zuvor vorgeschlagen.
Hier berichten wir über eine detaillierte Analyse des mutierten E. coli AcrB-P223G im Vergleich mit dem Wildtyp E. coli AcrB mit den NCMNs. Diese Fallstudie von AcrB legt nahe, dass NCMNs ein gutes System für die Protein-Protein-Interaktionsanalyse ist.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30% Acrylamide/BIS SOL (37.5:1)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4x Laemmli Sample Buffer (Loading Buffer)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610747</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid Glacial</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A38S-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Persulfate (APS)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>Goldbio</td>
			<td>C-105-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie Brilliant Blue R-250 protein stain powder</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT (Dithiothreitol) (&#62; 99% pure) Protease free</td>
			<td>Goldbio</td>
			<td>DTT10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>G33-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>BP310-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Affymetrix</td>
			<td>17525 1 KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG</td>
			<td>Goldbio</td>
			<td>I2481C100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin</td>
			<td>Goldbio</td>
			<td>K-120-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride hexahydrate</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AA3622636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A412-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N-dimethylethylenediamine (EDTA)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>8.03779.0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NCMNS-P5-2</td>
			<td>Not commercially available yet</td>
			<td>Submit request for obtaining to corresponding author</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision Plus Protein Dual Color Standard</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0374</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS (Sodium Dodecyl Sulfate)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SMA2000</td>
			<td>Cray Valley</td>
			<td>Submit request for obtaining to corresponding author</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>S271-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCEP-HCl</td>
			<td>Goldbio</td>
			<td>TCEP25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Terrific Broth Media</td>
			<td>Affymetrix</td>
			<td>75856 1 KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0719</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl Acetate</td>
			<td>Ambinter</td>
			<td>Amb22348393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avanti J-26S XPI</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>B14538</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avanti JXN-30</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>B34193</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon Electron Microscope Grids (10 nm)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>CF300-Cu-TH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Con-Torque Tissue Homogenizer</td>
			<td>Eberbach</td>
			<td>E7265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning LSE Mini Microcentrifuge</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>07-203-954</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EmulsiFlex-C3</td>
			<td>Avestin</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fraction Collector F9-R</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>29003875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>165-8004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop 2000 Spectrophotometer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>ND-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima L-90K Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>PN LL-IM-12AB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PELCO easiGlow Glow Discharge Cleaning System</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>91000S-230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potter-Elvehjem Safe Grind Tissue Grinder</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td>358013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerPac Basic Power Supply</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>164-5050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razel R99-E Variable Speed Syringe Pump</td>
			<td>Razel Scientific Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superdex 200 Increase 10/300 GL</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>28990944</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tecnai F20 200kV</td>
			<td>FEI</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type 70 Ti Fixed-Angle Rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>General Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 ml Microcentrifuge Tubes</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 ml Amicon Ultra-4 30 kDa</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>UFC803024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AKTA pure 25 L1 FPLC</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>29018225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BL21(DE3)pLysS Cells</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>C606003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 50 ml Conical Centrifuge Tube</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14-959-49A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HisTrap HP 5 ml Column</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>17524802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pET-24a</td>
			<td>EMD Biosciences</td>
			<td>69749-3</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

native cell membrane nanoparticles system for membrane protein-protein interaction analysis

Protein-Protein-Wechselwirkungen in Zellmembransystemen spielen eine entscheidende Rolle in einer Vielzahl biologischer Prozesse - von Zell-zu-Zell-Interaktionen bis hin zur Signaltransduktion; von der Erfassung von Umweltsignalen bis hin zur biologischen Reaktion; von der metabolischen Regulierung bis zur Entwicklungskontrolle. Genaue strukturelle Informationen über Protein-Protein-Wechselwirkungen sind entscheidend für das Verständnis der molekularen Mechanismen von Membranproteinkomplexen und für die Entwicklung hochspezifischer Moleküle zur Modulation dieser Proteine. Für den Nachweis und die Analyse von Protein-Protein-Wechselwirkungen wurden zahlreiche In-vivo- und In-vitro-Ansätze entwickelt. Unter ihnen ist der strukturbiologische Ansatz insofern einzigartig, als er direkte strukturelle Informationen über Protein-Protein-Wechselwirkungen auf atomarer Ebene liefern kann. Die derzeitige Membranproteinstrukturbiologie beschränkt sich jedoch noch weitgehend auf Waschmittel-basierte Methoden. Der Hauptnachteil von Waschmittel-basierten Methoden ist, dass sie oft Membranproteinkomplexe dissoziieren oder denaturieren, sobald ihre native Lipid-Doppelschichtumgebung durch Waschmittelmoleküle entfernt wird. Wir haben ein natives Zellmembran-Nanopartikelsystem für die Strukturbiologie von Membranproteinen entwickelt. Hier zeigen wir den Einsatz dieses Systems bei der Analyse von Protein-Protein-Wechselwirkungen auf der Zellmembran mit einer Fallstudie des oligomeren Zustands von AcrB.

Mit den hier vorgestellten Verfahren wurden Proben des Wildtyps E. coli AcrB und des E. coli-Mutanten AcrB-P223G gereinigt. Die Proben wurden dann auf kohlenstoffnegative Fleckenelektronenmikroskopiegitter adsorbiert und mit Uranylacetat mit der Side Blotting Methode22gebeizt. Negative Fleckenbilder wurden mittels Transmissionselektronenmikroskopie gesammelt. Das negative Fleckenbild für die mit DDM gereinigte AcrB-Wild-Musterprobe zeigt eine homogene Lösung monodisperser Parti...

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Native Cell Membrane Nanoparticles System for Membrane Protein-Protein Interaction Analysis

Hier wird ein Protokoll zur Bestimmung des oligomeren Zustands von Membranproteinen vorgestellt, das ein natives Zellmembran-Nanopartikelsystem in Verbindung mit der Elektronenmikroskopie nutzt.

Native Cell Membrane Nanoparticles System für Membran-Protein-Protein-Interaktionsanalyse

Protein-protein interactions in cell membrane systems play crucial roles in a wide range of biological processes- from cell-to-cell interactions to signal ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Method for Identifying Small Molecule Inhibitors of the Protein-protein Interaction Between HCN1 and TRIP8b

Verfahren zur Identifizierung von niedermolekularen Inhibitoren des Protein-Protein-Wechselwirkung zwischen HCN1- und TRIP8b

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the ...

Forschung

Biochemie

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Scaffold Liposomen zu rekonstituieren Lipid-proximalen Protein-Protein-Wechselwirkungen<em&gt; In Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

High Precision FRET at Single-molecule Level for Biomolecule Structure Determination

Hochpräzisions-FRET auf Einzelmolekül-Niveau für die Bestimmung der Biomolekülstruktur

A protocol on how to perform high-precision interdye distance measurements using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) at the single-molecule ...

A Modified Yeast-one Hybrid System for Heteromeric Protein Complex-DNA Interaction Studies

Ein modifiziertes Hefe-ein-Hybrid-System für Heteromere Protein-Komplex-DNA-Interaktionsstudien

Over the years, the yeast one-hybrid assay has proven to be an important technique for the identification and validation of physical interactions between ...

Analysis of Thylakoid Membrane Protein Complexes by Blue Native Gel Electrophoresis

Analyse der Thylakoidmembran Membran-Protein-komplexe durch blaue Native Gelelektrophorese

Photosynthetic electron transfer chain (ETC) converts solar energy to chemical energy in the form of NADPH and ATP. Four large protein complexes embedded ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

Eine Fluoreszenz Fluktuation Spektroskopie Assay von Protein-Protein-Wechselwirkungen an den Zell-Zell-Kontakten

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

Evaluation of Protein&#8211;Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

Evaluation of ProteinÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â‚¬Å“Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

Bewertung von Protein-Protein-Wechselwirkungen mit einer On-Membrane-Verdauungstechnik

Numerous intracellular proteins physically interact in accordance with their intracellular and extracellular circumstances. Indeed, cellular functions ...

Characterization of Membrane Transporters by Heterologous Expression in E. coli and Production of Membrane Vesicles

Characterization of Membrane Transporters by Heterologous Expression in E. coli and Production of Membrane Vesicles

Charakterisierung von Membrantransportern durch heterologen Ausdruck in E. coli und Herstellung von Membranvesikeln

Several methods have been developed to functionally characterize novel membrane transporters. Polyamines are ubiquitous in all organisms, but polyamine ...

Screening for Thermotoga maritima Membrane-Bound Pyrophosphatase Inhibitors

Screening for Thermotoga maritima Membrane-Bound Pyrophosphatase Inhibitors

Screening auf Thermotoga maritima Membrane-Bound Pyrophosphatase Inhibitoren

Membrane-bound pyrophosphatases (mPPases) are dimeric enzymes that occur in bacteria, archaea, plants, and protist parasites. These proteins cleave ...

A Model Membrane Platform for Reconstituting Mitochondrial Membrane Dynamics

Eine Modellmembranplattform zur Rekonstituierung der mitochondrialen Membrandynamik

Mitochondrial dynamics is essential for the organelle&#8217;s diverse functions and cellular responses. The crowded, spatially complex, mitochondrial ...