Name: native cell membrane nanoparticles system for membrane protein-protein interaction analysis
Uploaded: 2020-07-16T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Native Cell Membrane Nanoparticles System for Membrane Protein-Protein Interaction Analysis at JoVE.com

Denne forskningen ble støttet av VCU oppstartsfond (til Y.G.) og National Institute Of General Medical Sciences ved National Institutes of Health under Award Number R01GM132329 (til Y.G.) Innholdet er utelukkende forfatternes ansvar og representerer ikke nødvendigvis de offisielle synspunktene til National Institutes of Health. Vi takker Montserrat Samso og Kevin McRoberts for deres sjenerøse støtte til videoopptak.

1. Proteinuttrykk
<ol><li>Inokuler 15 ml Terrific Broth (TB) medier med antibiotika som er spesifikke for plasmider med BL21 (DE3) pLysS-celler som inneholder AcrB som uttrykker plasmider i 50 ml rør over natten ved 37 °C med risting ved 250 o/min.</li>
	<li>Kontroller den optiske tettheten til overnattingskulturen ved 600 nm (OD600) og kontroller at den er over 2,0.</li>
	<li>Fortynn 5 ml cellekultur i 1 L TB-medier som inneholder antibiotika som er spesifikke for plasmider og inkuber ved 37 °C med risti...

<ol>
	<li>Berggard, T., Linse, S., James, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+the+detection+and+analysis+of+protein-protein+interactions.">Methods for the detection and analysis of protein-protein interactions.</a> Proteomics. 7 (16), 2833-2842 (2007).</li><li>Huang, H., Bader, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precision+and+recall+estimates+for+two-hybrid+screens.">Precision and recall estimates for two-hybrid screens.</a> Bioinformatics. 25 (3), 372-378 (2009).</li><li>Serebriiskii, I. G., Golemis, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-hybrid+system+and+false+positives.+Approaches+to+detection+and+elimination.">Two-hybrid system and false positives. Approaches to detection and elimination.</a> Methods in Molecular Biology. 177, 123-134 (2001).</li><li>Gingras, A. C., Gstaiger, M., Raught, B., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+protein+complexes+using+mass+spectrometry.">Analysis of protein complexes using mass spectrometry.</a> Nature Reviews in Molecular Cell Biology. 8 (8), 645-654 (2007).</li><li>Ngounou Wetie, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigation+of+stable+and+transient+protein-protein+interactions:+Past,+present,+and+future.">Investigation of stable and transient protein-protein interactions: Past, present, and future.</a> Proteomics. 13 (3-4), 538-557 (2013).</li><li>Schaufele, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maximizing+the+quantitative+accuracy+and+reproducibility+of+Forster+resonance+energy+transfer+measurement+for+screening+by+high+throughput+widefield+microscopy.">Maximizing the quantitative accuracy and reproducibility of Forster resonance energy transfer measurement for screening by high throughput widefield microscopy.</a> Methods. 66 (2), 188-199 (2014).</li><li>Berney, C., Danuser, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FRET+or+no+FRET:+a+quantitative+comparison.">FRET or no FRET: a quantitative comparison.</a> Biophysical Journal. 84 (6), 3992-4010 (2003).</li><li>Almen, M. S., Nordstrom, K. J., Fredriksson, R., Schioth, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+the+human+membrane+proteome:+a+majority+of+the+human+membrane+proteins+can+be+classified+according+to+function+and+evolutionary+origin.">Mapping the human membrane proteome: a majority of the human membrane proteins can be classified according to function and evolutionary origin.</a> BMC Biology. 7, 50 (2009).</li><li>Overington, J. P., Al-Lazikani, B., Hopkins, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+many+drug+targets+are+there.">How many drug targets are there.</a> Nature Reviews in Drug Discovery. 5 (12), 993-996 (2006).</li><li>Berman, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Protein+Data+Bank.">The Protein Data Bank.</a> Nucleic Acids Research. 28 (1), 235-242 (2000).</li><li>Overduin, M., Esmaili, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Memtein:+The+fundamental+unit+of+membrane-protein+structure+and+function.">Memtein: The fundamental unit of membrane-protein structure and function.</a> Chemistry and Physics of Lipids. 218, 73-84 (2019).</li><li>Qiu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+activity+of+lipid+bilayer+within+a+membrane-protein+transporter.">Structure and activity of lipid bilayer within a membrane-protein transporter.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 115 (51), 12985-12990 (2018).</li><li>Knowles, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+proteins+solubilized+intact+in+lipid+containing+nanoparticles+bounded+by+styrene+maleic+acid+copolymer.">Membrane proteins solubilized intact in lipid containing nanoparticles bounded by styrene maleic acid copolymer.</a> Journal of the American Chemical Society. 131 (22), 7484-7485 (2009).</li><li>Xue, M., Cheng, L., Faustino, I., Guo, W., Marrink, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Mechanism+of+Lipid+Nanodisk+Formation+by+Styrene-Maleic+Acid+Copolymers.">Molecular Mechanism of Lipid Nanodisk Formation by Styrene-Maleic Acid Copolymers.</a> Biophysical Journal. 115 (3), 494-502 (2018).</li><li>Parmar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+a+SMALP+platform+to+determine+a+sub-nm+single+particle+cryo-EM+membrane+protein+structure.">Using a SMALP platform to determine a sub-nm single particle cryo-EM membrane protein structure.</a> Biochimica and Biophysica Acta Biomembrames. 1860 (2), 378-383 (2018).</li><li>Yu, L., Lu, W., Wei, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AcrB+trimer+stability+and+efflux+activity,+insight+from+mutagenesis+studies.">AcrB trimer stability and efflux activity, insight from mutagenesis studies.</a> PLoS One. 6 (12), 28390 (2011).</li><li>Broussard, J. A., Rappaz, B., Webb, D. J., Brown, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+resonance+energy+transfer+microscopy+as+demonstrated+by+measuring+the+activation+of+the+serine/threonine+kinase+Akt.">Fluorescence resonance energy transfer microscopy as demonstrated by measuring the activation of the serine/threonine kinase Akt.</a> Nature Protocols. 8 (2), 265-281 (2013).</li><li>Ma, L., Yang, F., Zheng, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+fluorescence+resonance+energy+transfer+in+protein+studies.">Application of fluorescence resonance energy transfer in protein studies.</a> Journal of Molecular Structure. 1077, 87-100 (2014).</li><li>Sachl, R., Humpolickova, J., Stefl, M., Johansson, L. B., Hof, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limitations+of+electronic+energy+transfer+in+the+determination+of+lipid+nanodomain+sizes.">Limitations of electronic energy transfer in the determination of lipid nanodomain sizes.</a> Biophysical Journal. 101 (11), 60-62 (2011).</li><li>Woehler, A., Wlodarczyk, J., Neher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signal/noise+analysis+of+FRET-based+sensors.">Signal/noise analysis of FRET-based sensors.</a> Biophysical Journal. 99 (7), 2344-2354 (2010).</li><li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+in+vitro+and+in+vivo+oligomeric+states+of+a+wild+type+and+mutant+trimeric+inner+membrane+multidrug+transporter.">Comparison of in vitro and in vivo oligomeric states of a wild type and mutant trimeric inner membrane multidrug transporter.</a> Biochemical and Biophysical Reports. 16, 122-129 (2018).</li><li>Scarff, C. A., Fuller, M. J. G., Thompson, R. F., Iadaza, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variations+on+Negative+Stain+Electron+Microscopy+Methods:+Tools+for+Tackling+Challenging+Systems.">Variations on Negative Stain Electron Microscopy Methods: Tools for Tackling Challenging Systems.</a> Journal of Visualized Experiments. (132), e57199 (2018).</li><li>Lu, W., Zhong, M., Wei, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Folding+of+AcrB+Subunit+Precedes+Trimerization.">Folding of AcrB Subunit Precedes Trimerization.</a> Journal of Molecular Biology. 411 (1), 264-274 (2011).</li><li>Lebon, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Structure and Function of GPCRs. , 229-230 (2019).</li><li>Rames, M., Yu, Y., Ren, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+negative+staining:+a+high-throughput+protocol+for+examining+small+and+asymmetric+protein+structure+by+electron+microscopy.">Optimized negative staining: a high-throughput protocol for examining small and asymmetric protein structure by electron microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. (90), e51087 (2014).</li><li>Lee, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+detergent-free+isolation+of+membrane+proteins+in+their+local+lipid+environment.">A method for detergent-free isolation of membrane proteins in their local lipid environment.</a> Nature Protocols. 11 (7), 1149-1162 (2016).</li><li>Hall, S. C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+acid-compatible+co-polymer+for+the+solubilization+of+membranes+and+proteins+into+lipid+bilayer-containing+nanoparticles.">An acid-compatible co-polymer for the solubilization of membranes and proteins into lipid bilayer-containing nanoparticles.</a> Nanoscale. 10 (22), 10609-10619 (2018).</li><li>Oluwole, A. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solubilization+of+Membrane+Proteins+into+Functional+Lipid-Bilayer+Nanodiscs+Using+a+Diisobutylene/Maleic+Acid+Copolymer.">Solubilization of Membrane Proteins into Functional Lipid-Bilayer Nanodiscs Using a Diisobutylene/Maleic Acid Copolymer.</a> Angewandte Chemie International Edition England. 56 (7), 1919-1924 (2017).</li></ol>

Protein-protein interaksjoner er viktig for integriteten til strukturen og funksjonen av membranproteiner. Mange tilnærminger er utviklet for å undersøke protein-protein interaksjoner. Sammenlignet med løselige proteiner er membranproteiner og deres PPI vanskeligere å studere på grunn av de unike indre egenskapene til membranproteiner. Denne vanskeligheten kommer hovedsakelig fra kravet om membranproteiner som skal bygges inn i et innfødt lipid bilayer miljø for strukturell stabilitet og funksjonalitet. Dette bli...

Protein-protein interaksjoner (PPI) spille avgjørende roller i hele biologi, fra vedlikehold av strukturen og funksjonen av proteiner til regulering av hele systemer. PPIer kommer i mange forskjellige former og kan kategoriseres basert på hvilke typer samhandlinger de danner. En slik kategorisering er homooligomerisk eller heterooligomerisk, basert på om interaksjonene er mellom identiske underenheter eller forskjellige proteiner som fungerer som underenheter. En annen kategorisering er basert på styrken av samspillet hvis interaksjonene fører til dannelse av stabile komplekser eller forbigående komplekse tilstander. Strukturell informasjon om PPIer mellom proteiner er avgjørende for å forstå mekanismen som proteiner utfører sin funksjon. Det har blitt anslått at over 80% av proteinene er avhengige av kompleks dannelse for å utføre sine funksjonelle roller1. Gitt prosentandelen av proteiner observert å være avhengig av PPI for riktig medfødt funksjon deres betydning i biologi er lett tydelig, men å kunne undersøke proteinene som engasjerer seg i disse interaksjonene har vært utfordrende på grunn av begrensninger i teknikkene som er tilgjengelige for å eksperimentelt observere når proteiner danner PPIer.
Det er en høy grad av uenighet mellom resultatene for mange eksperimentelt bestemte PPIer på grunn av den høye mengden støy, falske positiver og falske negativer som er avledet fra mange av de tilgjengelige PPI-bestemmeteknikkene. Dette er spesielt så for gjær to-hybrid (Y2H) system, tandem affinitet rensing-masse spektrometri (TAP-MS), og fluorescens resonans energioverføring (FRET), som representerer tre av de mest brukte metodene for PPI bestemmelse2,3,4,5,6,7. Til sammenligning kan proteinstrukturelle biologiteknikker, som kjernemagnetisk resonans (NMR), røntgenkrystallografi og elektronmikroskopi (EM), brukes til å få høyoppløsnings strukturell informasjon om proteinproteininteraksjoner ned til atomnivået og tillate direkte visuell bekreftelse av interaksjonene som oppstår for et målprotein av interesse. Alle tilgjengelige ikke-strukturbaserte PPI-bestemmende forskningsteknikker (f.eks. Y2H, TAP-MS og FRET) mangler denne evnen og lider i tillegg av problemer med å identifisere svake og forbigående interaksjoner mellom proteiner5. Disse manglene forsterkes ytterligere når man studerer membranproteiner på grunn av den ekstra kompleksiteten forårsaket av den ekstra variabelen av lipidmiljøet som påvirker dannelsen av riktig kvartær struktur og heteromerisk kompleks montering.
Membranproteiner utgjør en stor del av proteomet og er kjent for å spille mange avgjørende roller i riktig cellefunksjon i alle levende organismer. Til tross for at membranproteiner anslås å utgjøre 27% av det menneskelige genomet og utgjør ~ 60% av alle nåværende legemiddelmål, er det en stor anomali i antall løste modeller for membranproteiner som bare utgjør ~ 2,2% av alle publiserte proteinstrukturer8,9,10. Den primære årsaken til avviket i tilgjengeligheten av strukturell informasjon ligger i de indre egenskapene til membranproteiner selv. På grunn av deres dårlige løselighet, avhengighet av interaksjoner med et lipidmiljø for å opprettholde innfødt struktur og funksjon, og ulike fysikalske egenskaper av lipidmembranen selv, fortsetter membranproteiner å representere et betydelig problem når de implementerer strukturelle biologiteknikker for å studere dem. Av disse iboende egenskapene er det viktigste for å oppnå nøyaktig strukturell informasjon kravet om å ha interaksjoner med deres naturlige lipidmiljø for dem å opprettholde sin opprinnelige struktur og funksjon. Lipidmiljøet er en så integrert del av strukturen og funksjonen til membranproteiner at begrepet memtein (en kombinasjon av ordene membran og protein) har blitt foreslått som den grunnleggende enheten av membran-proteinstruktur ogfunksjon 11. Til tross for viktigheten av lipid-protein interaksjoner den tilgjengelige strukturbaserte PPI bestemmelse teknikker krever ofte at proteiner som studeres være løselig eller løses med vaskemidler. Eksponering for harde vaskemidler kan fornedre proteinene eller forårsake falske positiver og negativer på grunn av delipidering, noe som kan indusere aggregering, denning av protein, dissosiasjon av ikke-kovalente interaksjoner og dannelse av kunstige oligomeriske tilstander. På grunn av nødvendigheten av å opprettholde et naturlig lipidmiljø for nøyaktig bestemmelse av den opprinnelige oligomeriske tilstanden til membranproteiner har vi utviklet et native cell membran nanopartikler system (NCMNs)12 basert på tidligere rapporterte Styrene Maleic Acid Lipid Particles (SMALP)13 metode.
SMALP bruker styrenmalsyrekopolymer som en membranaktiv polymer for å trekke ut og løse membranproteiner. Poly(Styrene-co-Maleic Acid) (SMA) er en unik amfifil polymer på grunn av sin hydrofobe styrenmoety og diametralt motstridende hydrofile malesyremoaety. Det danner nanopartikler ved å adsorbere til, destabilisere og forstyrre cellemembranen i en pH-avhengigmekanisme 14. Denne funksjonelle aktiviteten til SMA er det som gjør at den kan brukes som et vaskemiddelfritt system for membranproteinutvinning og solubilisering. NCMN-systemet skiller seg fra SMALP-systemet i flere aspekter. Det mest unike ved NCMN-systemet er at det har et membran aktivt polymerbibliotek med en rekke polymerer som har unike egenskaper som gjør dem egnet for isolering av mange forskjellige membranproteiner som krever forskjellige forhold for stabilitet og innfødt funksjon. NCMN-systemet har også forskjellige protokoller sammenlignet med SMALP-metoden når det gjelder å forberede nanopartiklene. Et slikt eksempel er at NCMNer bruker en etttrinns nikkel affinitet kolonne rensing for høyoppløselig struktur bestemmelse; effekten av disse forskjellige protokollene kan observeres når man sammenligner NCMNs-protokollen, som genererte 3.2 og 3.0 Å cryo-EM AcrB strukturer, med en lignende studie ved hjelp av SMALP-metoden, som resulterte i en cryo-EM AcrB struktur på en 8,8 Å oppløsning12,15. Disse unike egenskapene til NCMN-systemet er forbedringene som er gjort på den tidligere etablerte SMALP-metoden og gjør den til en ideell kandidat for studiet av PPIer.
Multidrug efflux transporter AcrB eksisterer som funksjonell homotrimer i E. coli12. En mutagent analyse antydet at en enkelt P223G-punktmutasjon, som ligger på en løkke som er ansvarlig for stabiliteten til AcrB-trimeren, destabiliserer trimertilstanden og gir en AcrB-monomer når den er tilberedt med vaskemiddelet DDM, som kan oppdages med innfødt blå gelelektroforese16. Imidlertid foreslo FRET-analysen av AcrB-P223G mutert at når de var i det innfødte cellemembranen lipid bilayer-miljøet, eksisterte flertallet av mutert AcrB-P223G fortsatt som en trimer, og at uttrykksnivåene for både villtype AcrB og AcrB-P223G er like. Men til tross for FRET-analyseresultatene viste en aktivitetsanalyse for mutanttransportøren at aktiviteten gikk dramatisk ned sammenlignet med villtype16. Selv om FRET-teknologi har blitt populært brukt til analyse av protein-protein interaksjoner, forskning har vist at det ofte kan gi falskepositiver 17,18,19,20.
Nylig ble høyoppløselige cryo-EM strukturer av AcrB trimer bestemt som viste samspillet mellom AcrB med sin tilknyttede innfødte cellemembran lipid bilayer gjennom bruk av NCMNs12. I prinsippet kan NCMNer lett benyttes til analyse av protein-protein interaksjoner som finnes på den innfødte cellemembranen. I en test av dette systemet ble eksperimenter utført for å observere den oligomeriske tilstanden acrB-P223G ved bruk av innfødte cellemembrannanopartikler og negativ farging elektronmikroskopi. For å sammenligne med den ville typen AcrB nanopartikler, brukte vi den samme membranaktiv polymer (SMA2000 laget i vårt laboratorium, som er indeksert som NCMNP1-1 i NCMN-biblioteket) som brukes til høyoppløselig kryo-EM strukturbestemmelse av AcrB og alternative polymerer som finnes i NCMNs bibliotek12. Basert på tidligere rapporterte resultater, var det forventet at flertallet av AcrB-P223G mutant ville eksistere i form av trimeric innfødte celle membran nanopartikler21. Imidlertid ble ingen AcrB trimere funnet til stede i prøven, for eksempel de som ble observert med den ville typen AcrB. Dette tyder på at flertallet av AcrB-P223G ikke danner trimere på den innfødte cellemembranen som tidligere antydet.
Her rapporterer vi en detaljert analyse av mutant E. coli AcrB-P223G i en sammenligning med villtypen E. coli AcrB ved hjelp av NCMNs. Denne case-studien av AcrB antyder at NCMNer er et godt system for protein-proteininteraksjonsanalyse.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30% Acrylamide/BIS SOL (37.5:1)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4x Laemmli Sample Buffer (Loading Buffer)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610747</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid Glacial</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A38S-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Persulfate (APS)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>Goldbio</td>
			<td>C-105-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie Brilliant Blue R-250 protein stain powder</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT (Dithiothreitol) (&#62; 99% pure) Protease free</td>
			<td>Goldbio</td>
			<td>DTT10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>G33-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>BP310-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Affymetrix</td>
			<td>17525 1 KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG</td>
			<td>Goldbio</td>
			<td>I2481C100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin</td>
			<td>Goldbio</td>
			<td>K-120-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride hexahydrate</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AA3622636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A412-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N-dimethylethylenediamine (EDTA)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>8.03779.0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NCMNS-P5-2</td>
			<td>Not commercially available yet</td>
			<td>Submit request for obtaining to corresponding author</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision Plus Protein Dual Color Standard</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0374</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS (Sodium Dodecyl Sulfate)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SMA2000</td>
			<td>Cray Valley</td>
			<td>Submit request for obtaining to corresponding author</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>S271-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCEP-HCl</td>
			<td>Goldbio</td>
			<td>TCEP25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Terrific Broth Media</td>
			<td>Affymetrix</td>
			<td>75856 1 KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0719</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl Acetate</td>
			<td>Ambinter</td>
			<td>Amb22348393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avanti J-26S XPI</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>B14538</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avanti JXN-30</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>B34193</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon Electron Microscope Grids (10 nm)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>CF300-Cu-TH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Con-Torque Tissue Homogenizer</td>
			<td>Eberbach</td>
			<td>E7265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning LSE Mini Microcentrifuge</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>07-203-954</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EmulsiFlex-C3</td>
			<td>Avestin</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fraction Collector F9-R</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>29003875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>165-8004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop 2000 Spectrophotometer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>ND-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima L-90K Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>PN LL-IM-12AB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PELCO easiGlow Glow Discharge Cleaning System</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>91000S-230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potter-Elvehjem Safe Grind Tissue Grinder</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td>358013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerPac Basic Power Supply</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>164-5050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razel R99-E Variable Speed Syringe Pump</td>
			<td>Razel Scientific Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superdex 200 Increase 10/300 GL</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>28990944</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tecnai F20 200kV</td>
			<td>FEI</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type 70 Ti Fixed-Angle Rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>General Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 ml Microcentrifuge Tubes</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 ml Amicon Ultra-4 30 kDa</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>UFC803024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AKTA pure 25 L1 FPLC</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>29018225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BL21(DE3)pLysS Cells</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>C606003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 50 ml Conical Centrifuge Tube</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14-959-49A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HisTrap HP 5 ml Column</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>17524802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pET-24a</td>
			<td>EMD Biosciences</td>
			<td>69749-3</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

native cell membrane nanoparticles system for membrane protein-protein interaction analysis

Protein-protein interaksjoner i cellemembransystemer spiller avgjørende roller i et bredt spekter av biologiske prosesser- fra celle-til-celle interaksjoner for å signalisere transduksjon; fra sensing miljøsignaler til biologisk respons; fra metabolsk regulering til utviklingskontroll. Nøyaktig strukturell informasjon om protein-protein interaksjoner er avgjørende for å forstå molekylære mekanismer av membran protein komplekser og for utformingen av svært spesifikke molekyler for å modulere disse proteinene. Mange in vivo- og in vitro-tilnærminger er utviklet for påvisning og analyse av protein-proteininteraksjoner. Blant dem er den strukturelle biologitilnærmingen unik ved at den kan gi direkte strukturell informasjon om protein-proteininteraksjoner på atomnivå. Imidlertid er dagens membranproteinstrukturell biologi fortsatt i stor grad begrenset til vaskemiddelbaserte metoder. Den store ulempen med vaskemiddelbaserte metoder er at de ofte dissosierer eller denatur membranproteinkomplekser når deres innfødte lipid bilayer miljø er fjernet av vaskemiddelmolekyler. Vi har utviklet et innfødt cellemembran nanopartikkelsystem for membranproteinstrukturell biologi. Her demonstrerer vi bruken av dette systemet i analysen av protein-proteininteraksjoner på cellemembranen med en case-studie av den oligomeriske tilstanden acrb.

Ved hjelp av prosedyrene som presenteres her, ble prøver av E. coli AcrB villtype og E. coli mutert AcrB-P223G renset. Prøvene ble deretter adsorrisert til karbonnegative flekkeelektronmikroskopigitter og farget ved hjelp av uranylacetat med sideblottingmetoden22. Negative flekkbilder ble samlet inn ved hjelp av transmisjonselektronmikroskopi. Det negative flekkbildet for AcrB wild type prøve renset med DDM avslører en homogen løsning av monodispede partikler med proteinet s...

Watch this Scientific Journal Video about Native Cell Membrane Nanoparticles System for Membrane Protein-Protein Interaction Analysis at JoVE.com

Native Cell Membrane Nanoparticles System for Membrane Protein-Protein Interaction Analysis

Presentert her er en protokoll for bestemmelse av oligomerisk tilstand av membranproteiner som benytter et innfødt cellemembran nanopartikkelsystem i forbindelse med elektronmikroskopi.

Native Cell Membran Nanopartikler System for membran Protein-Protein Interaksjon Analyse

Protein-protein interactions in cell membrane systems play crucial roles in a wide range of biological processes- from cell-to-cell interactions to signal ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Method for Identifying Small Molecule Inhibitors of the Protein-protein Interaction Between HCN1 and TRIP8b

Metode for å identifisere lavmolekylære inhibitorer av protein-protein samhandling mellom HCN1 og TRIP8b

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the ...

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Bruke Stillas liposomer for å rekonstituere Lipid-proksimale Protein-protein interaksjoner<em&gt; In Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

High Precision FRET at Single-molecule Level for Biomolecule Structure Determination

Høy presisjon FRET ved enkeltmolekylivå for biomolekylstrukturbestemmelse

A protocol on how to perform high-precision interdye distance measurements using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) at the single-molecule ...

A Modified Yeast-one Hybrid System for Heteromeric Protein Complex-DNA Interaction Studies

Et modifisert gjær-ett hybrid system for Heteromer Proteinkompleks-DNA-interaksjonsstudier

Over the years, the yeast one-hybrid assay has proven to be an important technique for the identification and validation of physical interactions between ...

Analysis of Thylakoid Membrane Protein Complexes by Blue Native Gel Electrophoresis

Analyse av Thylakoid membran Protein komplekser av blå innfødt Gel geleelektroforese

Photosynthetic electron transfer chain (ETC) converts solar energy to chemical energy in the form of NADPH and ATP. Four large protein complexes embedded ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

En fluorescens svingninger spektroskopi analysen av Protein-Protein interaksjoner i celle-celle kontakter

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

Evaluation of Protein&#8211;Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

Evaluation of ProteinÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â‚¬Å“Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

Evaluering av protein-protein interaksjoner ved hjelp av en on-membran fordøyelsen Technique

Numerous intracellular proteins physically interact in accordance with their intracellular and extracellular circumstances. Indeed, cellular functions ...

Characterization of Membrane Transporters by Heterologous Expression in E. coli and Production of Membrane Vesicles

Characterization of Membrane Transporters by Heterologous Expression in E. coli and Production of Membrane Vesicles

Karakterisering av membran transportører av Heterologous uttrykk i E. coli og produksjon av membran blemmer

Several methods have been developed to functionally characterize novel membrane transporters. Polyamines are ubiquitous in all organisms, but polyamine ...

Screening for Thermotoga maritima Membrane-Bound Pyrophosphatase Inhibitors

Screening for Thermotoga maritima Membrane-Bound Pyrophosphatase Inhibitors

Screening for Thermotoga Maritima membran bundne Pyrophosphatase hemmere

Membrane-bound pyrophosphatases (mPPases) are dimeric enzymes that occur in bacteria, archaea, plants, and protist parasites. These proteins cleave ...

A Model Membrane Platform for Reconstituting Mitochondrial Membrane Dynamics

En modell membran plattform for rekonstituere mitokondrie membran dynamikk

Mitochondrial dynamics is essential for the organelle&#8217;s diverse functions and cellular responses. The crowded, spatially complex, mitochondrial ...