Name: native cell membrane nanoparticles system for membrane protein-protein interaction analysis
Uploaded: 2020-07-16T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Native Cell Membrane Nanoparticles System for Membrane Protein-Protein Interaction Analysis at JoVE.com

Это исследование было поддержано VCU стартовый фонд (для YG) и Национальный институт общих медицинских наук Национальных институтов здравоохранения под номером премии R01GM132329 (к YG) Содержание является исключительно ответственностью авторов и не обязательно отражает официальные взгляды Национальных институтов здравоохранения. Мы благодарим Монтсеррат Самсо и Кевина МакРоберта за их щедрую поддержку видеозаписи.

1. Выражение белка
<ol><li>Прививка 15 мл потрясающий бульон (ТБ) СМИ с антибиотиками, специфичные для плазмидов с BL21(DE3) pLysS клеток, содержащих AcrB экспрессии плазмидов в 50 мл трубки ночь при 37 градусов по Цельсию с встряхивания при 250 об/мин.</li>
	<li>Проверьте оптическую плотность ночной культур?...

<ol>
	<li>Berggard, T., Linse, S., James, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+the+detection+and+analysis+of+protein-protein+interactions.">Methods for the detection and analysis of protein-protein interactions.</a> Proteomics. 7 (16), 2833-2842 (2007).</li><li>Huang, H., Bader, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precision+and+recall+estimates+for+two-hybrid+screens.">Precision and recall estimates for two-hybrid screens.</a> Bioinformatics. 25 (3), 372-378 (2009).</li><li>Serebriiskii, I. G., Golemis, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-hybrid+system+and+false+positives.+Approaches+to+detection+and+elimination.">Two-hybrid system and false positives. Approaches to detection and elimination.</a> Methods in Molecular Biology. 177, 123-134 (2001).</li><li>Gingras, A. C., Gstaiger, M., Raught, B., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+protein+complexes+using+mass+spectrometry.">Analysis of protein complexes using mass spectrometry.</a> Nature Reviews in Molecular Cell Biology. 8 (8), 645-654 (2007).</li><li>Ngounou Wetie, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigation+of+stable+and+transient+protein-protein+interactions:+Past,+present,+and+future.">Investigation of stable and transient protein-protein interactions: Past, present, and future.</a> Proteomics. 13 (3-4), 538-557 (2013).</li><li>Schaufele, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maximizing+the+quantitative+accuracy+and+reproducibility+of+Forster+resonance+energy+transfer+measurement+for+screening+by+high+throughput+widefield+microscopy.">Maximizing the quantitative accuracy and reproducibility of Forster resonance energy transfer measurement for screening by high throughput widefield microscopy.</a> Methods. 66 (2), 188-199 (2014).</li><li>Berney, C., Danuser, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FRET+or+no+FRET:+a+quantitative+comparison.">FRET or no FRET: a quantitative comparison.</a> Biophysical Journal. 84 (6), 3992-4010 (2003).</li><li>Almen, M. S., Nordstrom, K. J., Fredriksson, R., Schioth, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+the+human+membrane+proteome:+a+majority+of+the+human+membrane+proteins+can+be+classified+according+to+function+and+evolutionary+origin.">Mapping the human membrane proteome: a majority of the human membrane proteins can be classified according to function and evolutionary origin.</a> BMC Biology. 7, 50 (2009).</li><li>Overington, J. P., Al-Lazikani, B., Hopkins, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+many+drug+targets+are+there.">How many drug targets are there.</a> Nature Reviews in Drug Discovery. 5 (12), 993-996 (2006).</li><li>Berman, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Protein+Data+Bank.">The Protein Data Bank.</a> Nucleic Acids Research. 28 (1), 235-242 (2000).</li><li>Overduin, M., Esmaili, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Memtein:+The+fundamental+unit+of+membrane-protein+structure+and+function.">Memtein: The fundamental unit of membrane-protein structure and function.</a> Chemistry and Physics of Lipids. 218, 73-84 (2019).</li><li>Qiu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+activity+of+lipid+bilayer+within+a+membrane-protein+transporter.">Structure and activity of lipid bilayer within a membrane-protein transporter.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 115 (51), 12985-12990 (2018).</li><li>Knowles, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+proteins+solubilized+intact+in+lipid+containing+nanoparticles+bounded+by+styrene+maleic+acid+copolymer.">Membrane proteins solubilized intact in lipid containing nanoparticles bounded by styrene maleic acid copolymer.</a> Journal of the American Chemical Society. 131 (22), 7484-7485 (2009).</li><li>Xue, M., Cheng, L., Faustino, I., Guo, W., Marrink, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Mechanism+of+Lipid+Nanodisk+Formation+by+Styrene-Maleic+Acid+Copolymers.">Molecular Mechanism of Lipid Nanodisk Formation by Styrene-Maleic Acid Copolymers.</a> Biophysical Journal. 115 (3), 494-502 (2018).</li><li>Parmar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+a+SMALP+platform+to+determine+a+sub-nm+single+particle+cryo-EM+membrane+protein+structure.">Using a SMALP platform to determine a sub-nm single particle cryo-EM membrane protein structure.</a> Biochimica and Biophysica Acta Biomembrames. 1860 (2), 378-383 (2018).</li><li>Yu, L., Lu, W., Wei, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AcrB+trimer+stability+and+efflux+activity,+insight+from+mutagenesis+studies.">AcrB trimer stability and efflux activity, insight from mutagenesis studies.</a> PLoS One. 6 (12), 28390 (2011).</li><li>Broussard, J. A., Rappaz, B., Webb, D. J., Brown, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+resonance+energy+transfer+microscopy+as+demonstrated+by+measuring+the+activation+of+the+serine/threonine+kinase+Akt.">Fluorescence resonance energy transfer microscopy as demonstrated by measuring the activation of the serine/threonine kinase Akt.</a> Nature Protocols. 8 (2), 265-281 (2013).</li><li>Ma, L., Yang, F., Zheng, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+fluorescence+resonance+energy+transfer+in+protein+studies.">Application of fluorescence resonance energy transfer in protein studies.</a> Journal of Molecular Structure. 1077, 87-100 (2014).</li><li>Sachl, R., Humpolickova, J., Stefl, M., Johansson, L. B., Hof, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limitations+of+electronic+energy+transfer+in+the+determination+of+lipid+nanodomain+sizes.">Limitations of electronic energy transfer in the determination of lipid nanodomain sizes.</a> Biophysical Journal. 101 (11), 60-62 (2011).</li><li>Woehler, A., Wlodarczyk, J., Neher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signal/noise+analysis+of+FRET-based+sensors.">Signal/noise analysis of FRET-based sensors.</a> Biophysical Journal. 99 (7), 2344-2354 (2010).</li><li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+in+vitro+and+in+vivo+oligomeric+states+of+a+wild+type+and+mutant+trimeric+inner+membrane+multidrug+transporter.">Comparison of in vitro and in vivo oligomeric states of a wild type and mutant trimeric inner membrane multidrug transporter.</a> Biochemical and Biophysical Reports. 16, 122-129 (2018).</li><li>Scarff, C. A., Fuller, M. J. G., Thompson, R. F., Iadaza, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variations+on+Negative+Stain+Electron+Microscopy+Methods:+Tools+for+Tackling+Challenging+Systems.">Variations on Negative Stain Electron Microscopy Methods: Tools for Tackling Challenging Systems.</a> Journal of Visualized Experiments. (132), e57199 (2018).</li><li>Lu, W., Zhong, M., Wei, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Folding+of+AcrB+Subunit+Precedes+Trimerization.">Folding of AcrB Subunit Precedes Trimerization.</a> Journal of Molecular Biology. 411 (1), 264-274 (2011).</li><li>Lebon, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Structure and Function of GPCRs. , 229-230 (2019).</li><li>Rames, M., Yu, Y., Ren, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+negative+staining:+a+high-throughput+protocol+for+examining+small+and+asymmetric+protein+structure+by+electron+microscopy.">Optimized negative staining: a high-throughput protocol for examining small and asymmetric protein structure by electron microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. (90), e51087 (2014).</li><li>Lee, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+detergent-free+isolation+of+membrane+proteins+in+their+local+lipid+environment.">A method for detergent-free isolation of membrane proteins in their local lipid environment.</a> Nature Protocols. 11 (7), 1149-1162 (2016).</li><li>Hall, S. C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+acid-compatible+co-polymer+for+the+solubilization+of+membranes+and+proteins+into+lipid+bilayer-containing+nanoparticles.">An acid-compatible co-polymer for the solubilization of membranes and proteins into lipid bilayer-containing nanoparticles.</a> Nanoscale. 10 (22), 10609-10619 (2018).</li><li>Oluwole, A. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solubilization+of+Membrane+Proteins+into+Functional+Lipid-Bilayer+Nanodiscs+Using+a+Diisobutylene/Maleic+Acid+Copolymer.">Solubilization of Membrane Proteins into Functional Lipid-Bilayer Nanodiscs Using a Diisobutylene/Maleic Acid Copolymer.</a> Angewandte Chemie International Edition England. 56 (7), 1919-1924 (2017).</li></ol>

Белково-белковые взаимодействия важны для целостности структуры и функции мембранных белков. Многие подходы были разработаны для исследования белково-белковых взаимодействий. По сравнению с растворимыми белками мембранные белки и их ИЦП труднее изучать из-за уникальных внутренних с...

Белково-белковые взаимодействия (ИЦП) играют ключевую роль на протяжении всей биологии, от поддержания структуры и функции белков до регуляции целых систем. ИЦП бывают разных форм и могут быть классифицированы в зависимости от того, какие типы взаимодействий они формируют. Одной из таких категоризации является гомоолигомерная или гетероолигомерная, основанная на том, находятся ли взаимодействия между идентичными субъединицами или различными белками, действующими в качестве субъедилентов. Другая категоризация основана на силе взаимодействия, если взаимодействия приводят к формированию стабильных комплексов или переходных сложных состояний. Структурная информация о ИЦП между белками имеет решающее значение для понимания механизма, с помощью которого белки выполняют свою функцию. Было подсчитано, что более 80% белков полагаются на сложное образование для того, чтобы выполнять свои функциональные функции1. Учитывая процент белков наблюдается полагаться на ИЦП для надлежащего врожденного функционирования их значение в биологии является очевидным, но возможность правильно исследовать белки, которые участвуют в этих взаимодействий остается сложной задачей из-за ограничений в методах, доступных для экспериментального наблюдения, когда белки формируют ИЦП.
Существует высокая степень разногласий между результатами для многих экспериментально определенных ИЦП из-за большого количества шума, ложных срабатываний и ложных негативов, которые являются производными от многих из имеющихся в настоящее время методов определения ИЦП. Это особенно актуально для дрожжей двух-гибридной (Y2H) системы, тандем сродства очистки массы спектрометрии (TAP-MS), и флуоресценции резонансной передачи энергии (FRET), которые представляют собой три изнаиболее часто используемых методов дляопределения ИЦП 2,3,4,5,6,7. Для сравнения, методы структурной биологии белка, такие как ядерный магнитный резонанс (NMR), рентгеновская кристаллография и электронная микроскопия (EM), могут быть использованы для получения структурной информации высокого разрешения о белково-белковых взаимодействиях вплоть до атомного уровня и позволяют прямое визуальное подтверждение взаимодействий, происходящих для целевого белка интереса. Все имеющиеся в настоящее время неконституции на основе ИЦП определения методов исследования (например, Y2H, TAP-MS, и FRET) не имеют этой способности и дополнительно страдают от трудностей в выявлении слабых и переходных взаимодействий междубелками 5. Эти недостатки еще больше усиливаются при изучении мембранных белков из-за дополнительной сложности, вызванной дополнительной переменной липидной среды, которая влияет на формирование надлежащей четвертичных структур и гетеромерной сложной сборки.
Мембранные белки составляют большую часть протеома и, как известно, играют важную роль в надлежащем функционировании клеток во всех живых организмах. Несмотря на то, что мембранные белки, по оценкам, составляют 27% генома человека и составляют 60% от всех текущих целей наркотиков есть серьезная аномалия в количестве решенных моделей мембранных белков, которые составляют лишь 2,2% от всех опубликованныхбелковых структур 8,9,10. Основная причина расхождения в доступности структурной информации заключается в внутренних свойствах самих мембранных белков. Из-за их плохой solubility, опоры на взаимодействия с липидной средой для поддержания родной структуры и функции, и различные физико-химические свойства самой липидной мембраны, мембранные белки продолжают представлять собой существенную проблему при реализации структурных методов биологии для их изучения. Из этих свойств, наиболее важным для получения точной структурной информации является требование иметь взаимодействия с их естественной липидной среды для них, чтобы сохранить свою родную структуру и функцию. Липидная среда является такой неотъемлемой частью структуры и функции мембранных белков, что концепция memtein (сочетание слов мембраны и белка) была предложена в качестве основной единицы мембраны-белковой структуры ифункции 11. Несмотря на важность липидно-белковых взаимодействий, имеющиеся в настоящее время методы определения ИЦП на основе структуры часто требуют, чтобы изучаемые белки были растворимыми или растворялись моющими средствами. Воздействие суровых моющих средств может денатурировать белки или вызвать ложные срабатывания и негативы из-за делипидации, которые могут вызвать агрегацию, денатурацию белка, диссоциацию нековалентных взаимодействий и образование искусственных олигомерных состояний. В связи с необходимостью поддержания естественной липидной среды для точного определения родного олигомерного состояния мембранных белков мы разработали систему наночастиц коренных клеток Membrane (NCMNs)12 на основе ранее зарегистрированного метода Styrene Maleic Acid Lipid Particles (SMALP)13.
SMALP использует стирола мужской кислоты кополитера в качестве мембраны активного полимера для извлечения и solubilize мембранных белков. Поли (Styrene-co-Maleic Acid) (SMA) является уникальным амфифилическим полимером из-за его гидрофобного стирола moiety и диаметрально противоположных гидрофильных мужских кислот moiety. Он образует наночастицы путем адсорбирования, дестабилизации и нарушения клеточной мембраны в рН-зависимом механизме14. Эта функциональная деятельность SMA является то, что позволяет использовать его в качестве моющего средства свободной системы для извлечения мембранного белка и solubilization. Система NCMN отличается от системы SMALP по нескольким аспектам. Самой уникальной особенностью системы NCMN является то, что она имеет мембранную активную полимерную библиотеку с множеством полимеров, которые имеют уникальные свойства, которые делают их пригодными для изоляции различных мембранных белков, которые требуют различных условий для стабильности и постоянного функционирования. Система NCMN также имеет различные протоколы по сравнению с методом SMALP, когда дело доходит до подготовки наночастиц. Одним из таких примеров является то, что NCMNs используют одноступенчатую очистку столбца сродства никеля для определения структуры с высоким разрешением; эффект этих различных протоколов можно наблюдать при сравнении протокола NCMNs, который генерируется 3,2 и 3,0 кро-EM AcrB структур, с аналогичным исследованием с использованием метода SMALP, в результате чего крио-EM AcrB структуры на 8,8й разрешение 12,15. Эти уникальные особенности системы NCMN являются улучшения, сделанные на ранее установленный метод SMALP и сделать его идеальным кандидатом для изучения ИЦП.
Многоразовой эффлюкс транспортер AcrB существует как функциональный гомотример в кишечной палочке12. Мутагеничный анализ показал, что одна мутация точки P223G, расположенная на петле, которая отвечает за стабильность тримера AcrB, дестабилизирует состояние тримера и дает мономер AcrB при приготовлении с моющим средством DDM, который может быть обнаружен с помощью родного синегогеля электрофорез 16. Тем не менее, анализ FRET мутанта AcrB-P223G показал, что, когда в среде липидного бислойного облизываемых клеток, большинство мутантов AcrB-P223G все еще существовали как тример и что уровни экспрессии как для дикого типа AcrB, так и для AcrB-P223G похожи. Тем не менее, несмотря на результаты анализа FRET, анализ активности для мутантного транспортера показал, что активность резко снизилась по сравнению с диким типом16. Хотя технология FRET широко используется для анализа белково-белковых взаимодействий, исследования показали, что она часто может давать ложныесрабатывания 17,18,19,20.
Недавно были определены крио-ЭМ-структуры тримера AcrB, которые показали взаимодействие AcrB с связанным с ним липидным бислойным бислойным липидным бислоем изместных клетокс помощью NCMNs 12 . В принципе, NCMNs можно охотно использовать для анализа взаимодействий протеин-протеина найденных на родной мембране клетки. В ходе испытания этой системы были проведены эксперименты по непосредственному наблюдаю за олигомерным состоянием AcrB-P223G с использованием наночастиц наночастиц на мембраны родных клеток и отрицательной окрашивающей электронной микроскопией. Для сравнения с наночастицами дикого типа AcrB мы использовали тот же мембранный активный полимер (SMA2000, сделанный в нашей лаборатории, который индексирован как NCMNP1-1 в библиотеке NCMN), используемый для определения структуры AcrB с высоким разрешением и альтернативных полимеров, найденных в библиотеке NCMNs12. Основываясь на ранее сообщенных результатах, ожидалось, что большинство мутантов AcrB-P223G будет существовать в виде тримерных наночастицнаночастиц на мембраны родной клетки 21. Тем не менее, не AcrB тримеры были найдены присутствующих в образце, таких, как те, которые наблюдались с диким типом AcrB. Это говорит о том, что большинство AcrB-P223G не формирует тримеры на мембране родной клетки, как предполагалось ранее.
Здесь мы сообщаем подробный анализ мутанта E. coli AcrB-P223G в сравнении с диким типом E. coli AcrB с использованием NCMNs. Это исследование AcrB предполагает, что NCMNs является хорошей системой для анализа взаимодействия белка и белка.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30% Acrylamide/BIS SOL (37.5:1)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4x Laemmli Sample Buffer (Loading Buffer)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610747</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid Glacial</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A38S-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Persulfate (APS)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>Goldbio</td>
			<td>C-105-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie Brilliant Blue R-250 protein stain powder</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT (Dithiothreitol) (&#62; 99% pure) Protease free</td>
			<td>Goldbio</td>
			<td>DTT10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>G33-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>BP310-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Affymetrix</td>
			<td>17525 1 KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG</td>
			<td>Goldbio</td>
			<td>I2481C100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin</td>
			<td>Goldbio</td>
			<td>K-120-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride hexahydrate</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AA3622636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A412-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N-dimethylethylenediamine (EDTA)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>8.03779.0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NCMNS-P5-2</td>
			<td>Not commercially available yet</td>
			<td>Submit request for obtaining to corresponding author</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision Plus Protein Dual Color Standard</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0374</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS (Sodium Dodecyl Sulfate)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SMA2000</td>
			<td>Cray Valley</td>
			<td>Submit request for obtaining to corresponding author</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>S271-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCEP-HCl</td>
			<td>Goldbio</td>
			<td>TCEP25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Terrific Broth Media</td>
			<td>Affymetrix</td>
			<td>75856 1 KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0719</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl Acetate</td>
			<td>Ambinter</td>
			<td>Amb22348393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avanti J-26S XPI</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>B14538</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avanti JXN-30</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>B34193</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon Electron Microscope Grids (10 nm)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>CF300-Cu-TH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Con-Torque Tissue Homogenizer</td>
			<td>Eberbach</td>
			<td>E7265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning LSE Mini Microcentrifuge</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>07-203-954</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EmulsiFlex-C3</td>
			<td>Avestin</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fraction Collector F9-R</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>29003875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>165-8004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop 2000 Spectrophotometer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>ND-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima L-90K Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>PN LL-IM-12AB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PELCO easiGlow Glow Discharge Cleaning System</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>91000S-230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potter-Elvehjem Safe Grind Tissue Grinder</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td>358013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerPac Basic Power Supply</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>164-5050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razel R99-E Variable Speed Syringe Pump</td>
			<td>Razel Scientific Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superdex 200 Increase 10/300 GL</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>28990944</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tecnai F20 200kV</td>
			<td>FEI</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type 70 Ti Fixed-Angle Rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>General Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 ml Microcentrifuge Tubes</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 ml Amicon Ultra-4 30 kDa</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>UFC803024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AKTA pure 25 L1 FPLC</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>29018225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BL21(DE3)pLysS Cells</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>C606003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 50 ml Conical Centrifuge Tube</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14-959-49A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HisTrap HP 5 ml Column</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>17524802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pET-24a</td>
			<td>EMD Biosciences</td>
			<td>69749-3</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

native cell membrane nanoparticles system for membrane protein-protein interaction analysis

Белково-белковые взаимодействия в клеточных мембранных системах играют решающую роль в широком диапазоне биологических процессов - от взаимодействия клеток к клетке до трансдукции сигнала; от зондирования экологических сигналов до биологической реакции; от метаболической регуляции до контроля развития. Точная структурная информация белково-белковых взаимодействий имеет решающее значение для понимания молекулярных механизмов мембранных белковых комплексов и для разработки высокоспецифических молекул для модулирования этих белков. Для обнаружения и анализа белково-белковых взаимодействий были разработаны многие подходы in vivo и in vitro. Среди них структурный подход биологии уникален тем, что он может обеспечить прямую структурную информацию белково-белковых взаимодействий на атомном уровне. Тем не менее, текущая мембрана белка структурной биологии по-прежнему в значительной степени ограничивается моющих средств на основе методов. Основным недостатком моющих средств на основе методов является то, что они часто диссоциируют или денатурации мембраны белковых комплексов, как только их родной липидный двуслой окружающей среды удаляется моющих средств молекул. Мы разрабатываем родная клеточная мембранная наночастица системы мембранного белка структурной биологии. Здесь мы демонстрируем использование этой системы в анализе белково-белковых взаимодействий на клеточной мембране с помощью исследования олигомерного состояния AcrB.

Используя представленные здесь процедуры, были очищены образцы дикого типа E. coli AcrB и мутанта E. coli AcrB-P223G. Образцы были затем адсорбированы до углеродного отрицательного пятна электронной микроскопии сетки и окрашенных с помощью уранил ацетата с боковойметодом blotting 2...

Watch this Scientific Journal Video about Native Cell Membrane Nanoparticles System for Membrane Protein-Protein Interaction Analysis at JoVE.com

Native Cell Membrane Nanoparticles System for Membrane Protein-Protein Interaction Analysis

Здесь представлен протокол для определения олигомерного состояния мембранных белков, который использует наночастицу родной клеточной мембраны в сочетании с электронной микроскопией.

Родная клеточная мембрана наночастицы системы membrane белка-белкового взаимодействия анализа

Protein-protein interactions in cell membrane systems play crucial roles in a wide range of biological processes- from cell-to-cell interactions to signal ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Method for Identifying Small Molecule Inhibitors of the Protein-protein Interaction Between HCN1 and TRIP8b

Способ идентификации низкомолекулярных соединений ингибиторов белок-белкового взаимодействия между HCN1 и TRIP8b

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the ...

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Используя строительные леса, липосом Развести липидами проксимальный белок-белковых взаимодействий<em&gt; In Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

High Precision FRET at Single-molecule Level for Biomolecule Structure Determination

Высокая точность FRET на уровне одиночной молекулы для определения структуры биомолекулы

A protocol on how to perform high-precision interdye distance measurements using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) at the single-molecule ...

A Modified Yeast-one Hybrid System for Heteromeric Protein Complex-DNA Interaction Studies

Модифицированная дрожжевая гибридная система для исследований комплексных ДНК-гетерогенных белков

Over the years, the yeast one-hybrid assay has proven to be an important technique for the identification and validation of physical interactions between ...

Analysis of Thylakoid Membrane Protein Complexes by Blue Native Gel Electrophoresis

Анализ тилакоидной мембраны белковых комплексов, синий родной гель-электрофорез

Photosynthetic electron transfer chain (ETC) converts solar energy to chemical energy in the form of NADPH and ATP. Four large protein complexes embedded ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

Флуоресценции колебания спектроскопии Assay белок белковых взаимодействий в ячейке контакты

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

Evaluation of Protein&#8211;Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

Evaluation of ProteinÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â‚¬Å“Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

Оценка взаимодействия белкови-белков с использованием метода пищеварения On-Membrane

Numerous intracellular proteins physically interact in accordance with their intracellular and extracellular circumstances. Indeed, cellular functions ...

Characterization of Membrane Transporters by Heterologous Expression in E. coli and Production of Membrane Vesicles

Characterization of Membrane Transporters by Heterologous Expression in E. coli and Production of Membrane Vesicles

Характеристика Мембранных Транспортеров по гетерологусному выражению в кишечной палочке и производству Мембранных Весиклей

Several methods have been developed to functionally characterize novel membrane transporters. Polyamines are ubiquitous in all organisms, but polyamine ...

Screening for Thermotoga maritima Membrane-Bound Pyrophosphatase Inhibitors

Screening for Thermotoga maritima Membrane-Bound Pyrophosphatase Inhibitors

Скрининг для Термотога маритима Мембрана-Связанные пирофосфаза ингибиторы

Membrane-bound pyrophosphatases (mPPases) are dimeric enzymes that occur in bacteria, archaea, plants, and protist parasites. These proteins cleave ...

A Model Membrane Platform for Reconstituting Mitochondrial Membrane Dynamics

Модель Мембранная платформа для восстановления митохондриальной динамики мембран

Mitochondrial dynamics is essential for the organelle&#8217;s diverse functions and cellular responses. The crowded, spatially complex, mitochondrial ...