Name: native cell membrane nanoparticles system for membrane protein-protein interaction analysis
Uploaded: 2020-07-16T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Native Cell Membrane Nanoparticles System for Membrane Protein-Protein Interaction Analysis at JoVE.com

Denna forskning stöddes av VCU startup fund (till Y.G.) och National Institute Of General Medical Sciences of the National Institutes of Health under Award Number R01GM132329 (till Y.G.) Innehållet är enbart författarnas ansvar och representerar inte nödvändigtvis de nationella hälsoinstitutens officiella åsikter. Vi tackar Montserrat Samso och Kevin McRoberts för deras generösa stöd för videoinspelning.

1. Proteinuttryck
<ol><li>Inokulera 15 ml Fantastic Broth (TB) media med antibiotika som är specifika för plasmider med BL21 (DE3) pLysS-celler som innehåller AcrB som uttrycker plasmider i 50 ml-rör över natten vid 37 °C med skakningar vid 250 varv/min.</li>
	<li>Kontrollera den optiska densiteten hos nattkulturen vid 600 nm (OD600)och se till att den är över 2,0.</li>
	<li>Späd 5 ml cellkultur till 1 L TB-medier som innehåller antibiotika som är specifika för plasmider och inkubera vid 37 °C m...

<ol>
	<li>Berggard, T., Linse, S., James, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+the+detection+and+analysis+of+protein-protein+interactions.">Methods for the detection and analysis of protein-protein interactions.</a> Proteomics. 7 (16), 2833-2842 (2007).</li><li>Huang, H., Bader, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precision+and+recall+estimates+for+two-hybrid+screens.">Precision and recall estimates for two-hybrid screens.</a> Bioinformatics. 25 (3), 372-378 (2009).</li><li>Serebriiskii, I. G., Golemis, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-hybrid+system+and+false+positives.+Approaches+to+detection+and+elimination.">Two-hybrid system and false positives. Approaches to detection and elimination.</a> Methods in Molecular Biology. 177, 123-134 (2001).</li><li>Gingras, A. C., Gstaiger, M., Raught, B., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+protein+complexes+using+mass+spectrometry.">Analysis of protein complexes using mass spectrometry.</a> Nature Reviews in Molecular Cell Biology. 8 (8), 645-654 (2007).</li><li>Ngounou Wetie, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigation+of+stable+and+transient+protein-protein+interactions:+Past,+present,+and+future.">Investigation of stable and transient protein-protein interactions: Past, present, and future.</a> Proteomics. 13 (3-4), 538-557 (2013).</li><li>Schaufele, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maximizing+the+quantitative+accuracy+and+reproducibility+of+Forster+resonance+energy+transfer+measurement+for+screening+by+high+throughput+widefield+microscopy.">Maximizing the quantitative accuracy and reproducibility of Forster resonance energy transfer measurement for screening by high throughput widefield microscopy.</a> Methods. 66 (2), 188-199 (2014).</li><li>Berney, C., Danuser, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FRET+or+no+FRET:+a+quantitative+comparison.">FRET or no FRET: a quantitative comparison.</a> Biophysical Journal. 84 (6), 3992-4010 (2003).</li><li>Almen, M. S., Nordstrom, K. J., Fredriksson, R., Schioth, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+the+human+membrane+proteome:+a+majority+of+the+human+membrane+proteins+can+be+classified+according+to+function+and+evolutionary+origin.">Mapping the human membrane proteome: a majority of the human membrane proteins can be classified according to function and evolutionary origin.</a> BMC Biology. 7, 50 (2009).</li><li>Overington, J. P., Al-Lazikani, B., Hopkins, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+many+drug+targets+are+there.">How many drug targets are there.</a> Nature Reviews in Drug Discovery. 5 (12), 993-996 (2006).</li><li>Berman, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Protein+Data+Bank.">The Protein Data Bank.</a> Nucleic Acids Research. 28 (1), 235-242 (2000).</li><li>Overduin, M., Esmaili, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Memtein:+The+fundamental+unit+of+membrane-protein+structure+and+function.">Memtein: The fundamental unit of membrane-protein structure and function.</a> Chemistry and Physics of Lipids. 218, 73-84 (2019).</li><li>Qiu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+activity+of+lipid+bilayer+within+a+membrane-protein+transporter.">Structure and activity of lipid bilayer within a membrane-protein transporter.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 115 (51), 12985-12990 (2018).</li><li>Knowles, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+proteins+solubilized+intact+in+lipid+containing+nanoparticles+bounded+by+styrene+maleic+acid+copolymer.">Membrane proteins solubilized intact in lipid containing nanoparticles bounded by styrene maleic acid copolymer.</a> Journal of the American Chemical Society. 131 (22), 7484-7485 (2009).</li><li>Xue, M., Cheng, L., Faustino, I., Guo, W., Marrink, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Mechanism+of+Lipid+Nanodisk+Formation+by+Styrene-Maleic+Acid+Copolymers.">Molecular Mechanism of Lipid Nanodisk Formation by Styrene-Maleic Acid Copolymers.</a> Biophysical Journal. 115 (3), 494-502 (2018).</li><li>Parmar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+a+SMALP+platform+to+determine+a+sub-nm+single+particle+cryo-EM+membrane+protein+structure.">Using a SMALP platform to determine a sub-nm single particle cryo-EM membrane protein structure.</a> Biochimica and Biophysica Acta Biomembrames. 1860 (2), 378-383 (2018).</li><li>Yu, L., Lu, W., Wei, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AcrB+trimer+stability+and+efflux+activity,+insight+from+mutagenesis+studies.">AcrB trimer stability and efflux activity, insight from mutagenesis studies.</a> PLoS One. 6 (12), 28390 (2011).</li><li>Broussard, J. A., Rappaz, B., Webb, D. J., Brown, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+resonance+energy+transfer+microscopy+as+demonstrated+by+measuring+the+activation+of+the+serine/threonine+kinase+Akt.">Fluorescence resonance energy transfer microscopy as demonstrated by measuring the activation of the serine/threonine kinase Akt.</a> Nature Protocols. 8 (2), 265-281 (2013).</li><li>Ma, L., Yang, F., Zheng, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+fluorescence+resonance+energy+transfer+in+protein+studies.">Application of fluorescence resonance energy transfer in protein studies.</a> Journal of Molecular Structure. 1077, 87-100 (2014).</li><li>Sachl, R., Humpolickova, J., Stefl, M., Johansson, L. B., Hof, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limitations+of+electronic+energy+transfer+in+the+determination+of+lipid+nanodomain+sizes.">Limitations of electronic energy transfer in the determination of lipid nanodomain sizes.</a> Biophysical Journal. 101 (11), 60-62 (2011).</li><li>Woehler, A., Wlodarczyk, J., Neher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signal/noise+analysis+of+FRET-based+sensors.">Signal/noise analysis of FRET-based sensors.</a> Biophysical Journal. 99 (7), 2344-2354 (2010).</li><li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+in+vitro+and+in+vivo+oligomeric+states+of+a+wild+type+and+mutant+trimeric+inner+membrane+multidrug+transporter.">Comparison of in vitro and in vivo oligomeric states of a wild type and mutant trimeric inner membrane multidrug transporter.</a> Biochemical and Biophysical Reports. 16, 122-129 (2018).</li><li>Scarff, C. A., Fuller, M. J. G., Thompson, R. F., Iadaza, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variations+on+Negative+Stain+Electron+Microscopy+Methods:+Tools+for+Tackling+Challenging+Systems.">Variations on Negative Stain Electron Microscopy Methods: Tools for Tackling Challenging Systems.</a> Journal of Visualized Experiments. (132), e57199 (2018).</li><li>Lu, W., Zhong, M., Wei, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Folding+of+AcrB+Subunit+Precedes+Trimerization.">Folding of AcrB Subunit Precedes Trimerization.</a> Journal of Molecular Biology. 411 (1), 264-274 (2011).</li><li>Lebon, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Structure and Function of GPCRs. , 229-230 (2019).</li><li>Rames, M., Yu, Y., Ren, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+negative+staining:+a+high-throughput+protocol+for+examining+small+and+asymmetric+protein+structure+by+electron+microscopy.">Optimized negative staining: a high-throughput protocol for examining small and asymmetric protein structure by electron microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. (90), e51087 (2014).</li><li>Lee, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+detergent-free+isolation+of+membrane+proteins+in+their+local+lipid+environment.">A method for detergent-free isolation of membrane proteins in their local lipid environment.</a> Nature Protocols. 11 (7), 1149-1162 (2016).</li><li>Hall, S. C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+acid-compatible+co-polymer+for+the+solubilization+of+membranes+and+proteins+into+lipid+bilayer-containing+nanoparticles.">An acid-compatible co-polymer for the solubilization of membranes and proteins into lipid bilayer-containing nanoparticles.</a> Nanoscale. 10 (22), 10609-10619 (2018).</li><li>Oluwole, A. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solubilization+of+Membrane+Proteins+into+Functional+Lipid-Bilayer+Nanodiscs+Using+a+Diisobutylene/Maleic+Acid+Copolymer.">Solubilization of Membrane Proteins into Functional Lipid-Bilayer Nanodiscs Using a Diisobutylene/Maleic Acid Copolymer.</a> Angewandte Chemie International Edition England. 56 (7), 1919-1924 (2017).</li></ol>

Proteinproteininteraktioner är viktiga för membranproteinernas struktur och funktion. Många metoder har utvecklats för att undersöka proteinproteininteraktioner. Jämfört med lösliga proteiner är membranproteiner och deras protonpumpshämmare svårare att studera på grund av de unika inneboende egenskaperna hos membranproteiner. Denna svårighet kommer främst från kravet på membranproteiner som ska bäddas in i en inhemsk lipid bilayer miljö för strukturell stabilitet och funktionalitet. Detta blir problema...

Proteinproteininteraktioner (PPI) spelar centrala roller genom hela biologin, från upprätthållandet av proteinstrukturen och proteinfunktionen till regleringen av hela system. Protonpumpshämmare finns i många olika former och kan kategoriseras baserat på vilka typer av interaktioner de bildar. En sådan kategorisering är homooligomerisk eller heterooligomerisk, baserat på om interaktionerna är mellan identiska underenheter eller olika proteiner som fungerar som underenheter. En annan kategorisering baseras på interaktionens styrka om interaktionerna leder till bildandet av stabila komplex eller övergående komplexa tillstånd. Strukturell information om protonpumpshämmarna mellan proteiner är avgörande för att förstå den mekanism genom vilken proteiner utför sin funktion. Det har uppskattats att över 80% av proteinerna är beroende av komplex bildning för att utföra sina funktionella roller1. Med tanke på att andelen proteiner som observerats vara beroende av protonpumpshämmare för korrekt medfödd funktion är deras betydelse i biologin lätt uppenbar, men att kunna undersöka de proteiner som deltar i dessa interaktioner på ett korrekt sätt har förblivit utmanande på grund av begränsningar i de tekniker som finns tillgängliga för att experimentellt observera när proteiner bildar protonpumpshämmare.
Det finns en hög grad av oenighet mellan resultaten för många experimentellt fastställda protonpumpshämmare på grund av den höga mängden buller, falska positiva och falska negativ som härrör från många av de för närvarande tillgängliga PPI-bestämningsteknikerna. Detta är särskilt för jäst tvåhybrid (Y2H) systemet, tandem affinitet rening-massa spektrometri (TAP-MS) och fluorescens resonans energiöverföring (FRET), som representerar tre av de vanligaste metoderna för PPI bestämning2,3,4,5,6,7. I jämförelse kan proteinstrukturbiologiska tekniker, såsom kärnmagnetisk resonans (NMR), röntgenkristallografi och elektronmikroskopi (EM), användas för att få högupplöst strukturell information om proteinproteininteraktioner ner till atomnivå och möjliggöra direkt visuell bekräftelse av de interaktioner som uppstår för ett målprotein av intresse. Alla de för närvarande tillgängliga icke-strukturbaserade PPI-bestämmande forskningsteknikerna (t.ex. Y2H, TAP-MS och FRET) saknar denna förmåga och lider dessutom av svårigheter att identifiera svaga och övergående interaktioner mellan proteiner5. Dessa brister förbättras ytterligare när man studerar membranproteiner på grund av den extra komplexiteten som orsakas av den ytterligare variabeln av lipidmiljön som påverkar bildandet av korrekt kvartär struktur och heteromerisk komplex montering.
Membranproteiner utgör en stor del av proteomen och är kända för att spela många avgörande roller i korrekt cellfunktion inom alla levande organismer. Trots det faktum att membranproteiner uppskattas utgöra 27% av det mänskliga genomet och utgör ~ 60% av alla nuvarande läkemedelsmål finns det en stor anomali i antalet lösta modeller för membranproteiner som bara utgör ~ 2,2% av alla publicerade proteinstrukturer8,9,10. Den främsta orsaken till diskrepansen i tillgången på strukturell information ligger i de inneboende egenskaperna hos själva membranproteinerna. På grund av deras dåliga löslighet, beroende av interaktioner med en lipidmiljö för att upprätthålla inhemsk struktur och funktion och olika fysikaliskkemiska egenskaper hos lipidmembranet själv, fortsätter membranproteiner att representera ett betydande problem när man implementerar strukturella biologitekniker för att studera dem. Av dessa inneboende egenskaper är det viktigaste för att få korrekt strukturell information kravet på att ha interaktioner med sin naturliga lipidmiljö för att de ska kunna behålla sin inhemska struktur och funktion. Lipidmiljön är en så integrerad del av membranproteinernas struktur och funktion att begreppet memtein (en kombination av orden membran och protein) har föreslagits som den grundläggande enheten för membranproteinstruktur och funktion11. Trots vikten av lipidproteininteraktioner kräver de för närvarande tillgängliga strukturbaserade PPI-bestämningsteknikerna ofta att de proteiner som studeras är lösliga eller lösliga med tvättmedel. Exponering för hårda tvättmedel kan denaturera proteinerna eller orsaka falska positiva och negativa på grund av delipidation, vilket kan inducera aggregering, denaturering av protein, dissociation av icke-kovamenta interaktioner och bildandet av konstgjorda oligomemetriska tillstånd. På grund av behovet av att upprätthålla en naturlig lipidmiljö för korrekt bestämning av det inhemska oligomemetriska tillståndet hos membranproteiner har vi utvecklat ett inhemskt cellmembrannanopartiklarsystem (NCMNs)12 baserat på den tidigare rapporterade Styren maleinsyra lipidpartiklar (SMALP)13-metoden.
SMALP använder styren maleinsyra copolymer som en membranaktiv polymer för att extrahera och lösliga membranproteiner. Poly (Styrene-co-Maleic Acid) (SMA) är en unik amfifil polymer på grund av dess hydrofoba styren moiety och diametralt motsatt hydrofil maleic syra moiety. Den bildar nanopartiklar genom att adsorbera till, destabilisera och störa cellmembranet i en pH-beroendemekanism 14. Denna funktionella aktivitet hos SMA är det som gör att den kan användas som ett tvättmedelsfritt system för membranproteinutvinning och löslighet. NCMN-systemet skiljer sig från SMALP-systemet i flera avseenden. Det mest unika med NCMN-systemet är att det har ett membranaktivt polymerbibliotek med en mängd polymerer som har unika egenskaper som gör dem lämpliga för isolering av många olika membranproteiner som kräver olika förutsättningar för stabilitet och inhemsk funktion. NCMN-systemet har också olika protokoll jämfört med SMALP-metoden när det gäller att förbereda nanopartiklarna. Ett sådant exempel är att ncmns använder en enstegs nickel affinitetskolonn rening för högupplöst strukturbestämning; effekten av dessa olika protokoll kan observeras när man jämför NCMNs-protokollet, som genererade 3,2 och 3,0 Å cryo-EM AcrB-strukturer, med en liknande studie med SMALP-metoden, vilket resulterade i en cryo-EM AcrB-struktur med en 8,8 Å-upplösning12,15. Dessa unika egenskaper hos NCMN-systemet är de förbättringar som gjorts på den tidigare etablerade SMALP-metoden och gör det till en idealisk kandidat för studier av protonpumpshämmare.
Multidrug efflux transportören AcrB finns som funktionell homotrimer i E. coli12. En mutagena analys föreslog att en enda P223G punkt mutation, ligger på en slinga som är ansvarig för stabiliteten i AcrB trimer, destabiliserar trimer tillstånd och ger en AcrB monomer när den framställs med tvättmedel DDM, som kan detekteras med inhemska blå gel elektrofores16. FRET-analysen av AcrB-P223G mutant föreslog dock att när i den inhemska cellmembran lipid bilayer miljön, majoriteten av mutant AcrB-P223G fortfarande existerade som en trimer och att uttryck nivåer för både vilda typ AcrB och AcrB-P223G är liknande. Men trots FRET-analysresultaten visade en aktivitetsanalys för mutanttransportören att aktiviteten minskade dramatiskt jämfört med den vilda typen16. Även om FRET-teknik har använts populärt för analys av proteinproteininteraktioner, har forskning visat att det ofta kan ge falska positiva17,18,19,20.
Nyligen fastställdes högupplösta cryo-EM strukturer av AcrB trimer som visade interaktionen mellan AcrB med dess tillhörande inhemska cellmembran lipid bilayer genom användning av NCMNs12. I princip kan NCMNs lätt användas för analys av protein-protein interaktioner som finns på det inhemska cellmembranet. I ett test av detta system utfördes experiment för att direkt observera det oligomeriska tillståndet i AcrB-P223G med användning av inhemska cellmembrannanopartiklar och negativ färgning elektronmikroskopi. För att jämföra med den vilda typen AcrB nanopartiklar använde vi samma membranaktiva polymer (SMA2000 tillverkad i vårt laboratorium, som indexeras som NCMNP1-1 i NCMN-biblioteket) som används för högupplöst cryo-EM-strukturbestämning av AcrB och alternativa polymerer som finns i NCMNs bibliotek12. Baserat på de tidigare rapporterade resultaten förväntades majoriteten av AcrB-P223G-mutanten existera i form av trimeriska inhemska cellmembran nanopartiklar21. Det fanns dock inga AcrB-trimrar i provet, såsom de som observerades med den vilda typen AcrB. Detta tyder på att majoriteten av AcrB-P223G inte bildar trimers på det inhemska cellmembranet som tidigare föreslagits.
Här rapporterar vi en detaljerad analys av mutanten E. coli AcrB-P223G i jämförelse med den vilda typen E. coli AcrB med ncmns. Denna fallstudie av AcrB tyder på ncmns är ett bra system för protein-protein interaktion analys.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30% Acrylamide/BIS SOL (37.5:1)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4x Laemmli Sample Buffer (Loading Buffer)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610747</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid Glacial</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A38S-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Persulfate (APS)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>Goldbio</td>
			<td>C-105-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie Brilliant Blue R-250 protein stain powder</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT (Dithiothreitol) (&#62; 99% pure) Protease free</td>
			<td>Goldbio</td>
			<td>DTT10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>G33-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>BP310-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Affymetrix</td>
			<td>17525 1 KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG</td>
			<td>Goldbio</td>
			<td>I2481C100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin</td>
			<td>Goldbio</td>
			<td>K-120-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride hexahydrate</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AA3622636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A412-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N-dimethylethylenediamine (EDTA)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>8.03779.0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NCMNS-P5-2</td>
			<td>Not commercially available yet</td>
			<td>Submit request for obtaining to corresponding author</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision Plus Protein Dual Color Standard</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0374</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS (Sodium Dodecyl Sulfate)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SMA2000</td>
			<td>Cray Valley</td>
			<td>Submit request for obtaining to corresponding author</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>S271-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCEP-HCl</td>
			<td>Goldbio</td>
			<td>TCEP25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Terrific Broth Media</td>
			<td>Affymetrix</td>
			<td>75856 1 KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0719</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl Acetate</td>
			<td>Ambinter</td>
			<td>Amb22348393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avanti J-26S XPI</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>B14538</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avanti JXN-30</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>B34193</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon Electron Microscope Grids (10 nm)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>CF300-Cu-TH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Con-Torque Tissue Homogenizer</td>
			<td>Eberbach</td>
			<td>E7265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning LSE Mini Microcentrifuge</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>07-203-954</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EmulsiFlex-C3</td>
			<td>Avestin</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fraction Collector F9-R</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>29003875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>165-8004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop 2000 Spectrophotometer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>ND-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima L-90K Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>PN LL-IM-12AB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PELCO easiGlow Glow Discharge Cleaning System</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>91000S-230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potter-Elvehjem Safe Grind Tissue Grinder</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td>358013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerPac Basic Power Supply</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>164-5050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razel R99-E Variable Speed Syringe Pump</td>
			<td>Razel Scientific Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superdex 200 Increase 10/300 GL</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>28990944</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tecnai F20 200kV</td>
			<td>FEI</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type 70 Ti Fixed-Angle Rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>General Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 ml Microcentrifuge Tubes</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 ml Amicon Ultra-4 30 kDa</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>UFC803024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AKTA pure 25 L1 FPLC</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>29018225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BL21(DE3)pLysS Cells</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>C606003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 50 ml Conical Centrifuge Tube</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14-959-49A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HisTrap HP 5 ml Column</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>17524802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pET-24a</td>
			<td>EMD Biosciences</td>
			<td>69749-3</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

native cell membrane nanoparticles system for membrane protein-protein interaction analysis

Proteinproteininteraktioner i cellmembransystem spelar avgörande roller i ett brett spektrum av biologiska processer - från cell-till-cell-interaktioner till signaltransduktion; från avkänning av miljösignaler till biologisk respons, från metabolisk reglering till utvecklingsstyrning. Korrekt strukturell information om proteinproteininteraktioner är avgörande för att förstå molekylära mekanismer hos membranproteinkomplex och för utformningen av mycket specifika molekyler för att modulera dessa proteiner. Många in vivo- och in vitro-metoder har utvecklats för detektion och analys av proteinproteininteraktioner. Bland dem är det strukturella biologiska tillvägagångssättet unikt genom att det kan ge direkt strukturell information om proteinproteininteraktioner på atomnivå. Nuvarande membranproteinstrukturbiologi är dock fortfarande till stor del begränsad till tvättmedelsbaserade metoder. Den största nackdelen med tvättmedelsbaserade metoder är att de ofta dissocierar eller denature membranproteinkomplex när deras inhemska lipid bilayer miljö avlägsnas av tvättmedel molekyler. Vi har utvecklat ett inhemskt cellmembran nanopartiklar system för membran protein strukturbiologi. Här visar vi användningen av detta system i analysen av protein-protein interaktioner på cellmembranet med en fallstudie av oligomeric tillstånd acrB.

Med hjälp av de procedurer som presenteras här renades prover av E. coli AcrB vilda typ och E. coli mutant AcrB-P223G. Proverna adsorberades sedan till kolnegativa färgelektronmikroskopinät och färgades med uranylacetat med sidoblottningsmetoden22. Negativa fläck bilder samlades in med hjälp av överföring elektronmikroskopi. Den negativa fläckbilden för acrB-provet av vild typ renat med DDM avslöjar en homogen lösning av monodispersed partiklar med proteinet som visa...

Watch this Scientific Journal Video about Native Cell Membrane Nanoparticles System for Membrane Protein-Protein Interaction Analysis at JoVE.com

Native Cell Membrane Nanoparticles System for Membrane Protein-Protein Interaction Analysis

Presenteras här är ett protokoll för bestämning av oligomeriskt tillstånd av membranproteiner som använder ett inhemskt cellmembran nanopartiklar system i samband med elektronmikroskopi.

Inbyggt cellmembrannanopartiklar system för membranprotein-protein interaktionsanalys

Protein-protein interactions in cell membrane systems play crucial roles in a wide range of biological processes- from cell-to-cell interactions to signal ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Method for Identifying Small Molecule Inhibitors of the Protein-protein Interaction Between HCN1 and TRIP8b

Metod för att identifiera små molekylhämmare av protein-proteininteraktion Mellan HCN1 och TRIP8b

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the ...

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Använda Scaffold Liposomer att återskapa Lipid-proximala protein-proteininteraktioner<em&gt; In Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

High Precision FRET at Single-molecule Level for Biomolecule Structure Determination

Hög precision FRET vid en-molekylnivå för biomolekylstrukturbestämning

A protocol on how to perform high-precision interdye distance measurements using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) at the single-molecule ...

A Modified Yeast-one Hybrid System for Heteromeric Protein Complex-DNA Interaction Studies

Ett modifierat jäst-ett-hybridsystem för studier av heteromerisk proteinkomplex-DNA-interaktion

Over the years, the yeast one-hybrid assay has proven to be an important technique for the identification and validation of physical interactions between ...

Analysis of Thylakoid Membrane Protein Complexes by Blue Native Gel Electrophoresis

Analys av Thylakoid membran proteinkomplex med blå infödda gelelektrofores

Photosynthetic electron transfer chain (ETC) converts solar energy to chemical energy in the form of NADPH and ATP. Four large protein complexes embedded ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

En fluorescens fluktuation spektroskopi haltbestämning av Protein-Protein interaktioner på Cell-Cell kontakter

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

Evaluation of Protein&#8211;Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

Evaluation of ProteinÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â‚¬Å“Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

Utvärdering av protein-proteininteraktioner med hjälp av en on-membran rötnings teknik

Numerous intracellular proteins physically interact in accordance with their intracellular and extracellular circumstances. Indeed, cellular functions ...

Characterization of Membrane Transporters by Heterologous Expression in E. coli and Production of Membrane Vesicles

Characterization of Membrane Transporters by Heterologous Expression in E. coli and Production of Membrane Vesicles

Karakterisering av membran transportörer genom heterologt uttryck i E. coli och produktion av membran blåsor

Several methods have been developed to functionally characterize novel membrane transporters. Polyamines are ubiquitous in all organisms, but polyamine ...

Screening for Thermotoga maritima Membrane-Bound Pyrophosphatase Inhibitors

Screening for Thermotoga maritima Membrane-Bound Pyrophosphatase Inhibitors

Screening för Thermotoga maritima membran-bundna Pyrofosfatashämmare

Membrane-bound pyrophosphatases (mPPases) are dimeric enzymes that occur in bacteria, archaea, plants, and protist parasites. These proteins cleave ...

A Model Membrane Platform for Reconstituting Mitochondrial Membrane Dynamics

En modell membran plattform för rekonstituering mitokondriellt membran Dynamics

Mitochondrial dynamics is essential for the organelle&#8217;s diverse functions and cellular responses. The crowded, spatially complex, mitochondrial ...