Name: guided differentiation of mature kidney podocytes from human induced pluripotent stem cells under chemically defined conditions
Uploaded: 2020-07-02T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Guided Differentiation of Mature Kidney Podocytes from Human Induced Pluripotent Stem Cells Under Chemically Defined Conditions at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי בית הספר פראט להנדסה באוניברסיטת דיוק, המחלקה לנפרולוגיה בבית הספר לרפואה דיוק, פרס מחקר של יו"ר מהמחלקה לרפואה באוניברסיטת דיוק, ופרס מעבר קריירה PDEP של קרן בורוז וולקום ל- S.M. M.B נתמך על ידי תכנית מלגת המחקר לתארים מתקדמים של הקרן הלאומית למדע. אנו מודים למעבדת בורסאק על שסיפקה לנו בנדיבות את קו תאי הגזע DU11, ואת מעבדת ורגזה באוניברסיטת דיוק על שיתוף זמני של מתקן תרבות הרקמות שלהם עם הקבוצה שלנו. פרסום זה מוקדש לפרופ' לורה ל. קסלינג, פרופסור נוברטיס לכימיה במכון הטכנולוגי של מסצ'וסטס, לרגל יום הולדתה ה-60.

1. הכנת ריאגנטים
<ol><li>לדלל 5x hiPS תרבית תאים מדיה (CCM) תוספת במדיום בזלת תרבית התא hiPS כדי להשיג פתרון 1x של hiPS CCM. הערה: תוספת CCM קפואה של 5x hiPS דורשת תהליך הפשרה איטי, באופן אידיאלי ב-4 °C (70°F) למשך הלילה. Aliquots של 1x hiPS CCM ניתן לאחסן עד 6 חודשים ב -20 °C (70 °F).</li>
	<li>הכנת מטריצת קרום המרתף (BM) 1 מצופה צלחות עב?...

<ol>
	<li>Liu, G., David, B. T., Trawczynski, M., Fessler, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+Pluripotent+Stem+Cells:+History,+Mechanisms,+Technologies,+and+Applications.">Advances in Pluripotent Stem Cells: History, Mechanisms, Technologies, and Applications.</a> Stem Cell Reviews and Reports. 16, 3-32 (2020).</li><li>Tabar, V., Studer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pluripotent+stem+cells+in+regenerative+medicine:+challenges+and+recent+progress.">Pluripotent stem cells in regenerative medicine: challenges and recent progress.</a> Nature Reviews Genetics. 15, 82-92 (2014).</li><li>Thomson, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+Stem+Cell+Lines+Derived+from+Human+Blastocysts.">Embryonic Stem Cell Lines Derived from Human Blastocysts.</a> Science. 282, 1145 (1998).</li><li>Takahashi, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+Pluripotent+Stem+Cells+from+Mouse+Embryonic+and+Adult+Fibroblast+Cultures+by+Defined+Factors.">Induction of Pluripotent Stem Cells from Mouse Embryonic and Adult Fibroblast Cultures by Defined Factors.</a> Cell. 126, 663-676 (2006).</li><li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+Pluripotent+Stem+Cells+from+Adult+Human+Fibroblasts+by+Defined+Factors.">Induction of Pluripotent Stem Cells from Adult Human Fibroblasts by Defined Factors.</a> Cell. 131, 861-872 (2007).</li><li>Takasato, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kidney+organoids+from+human+iPS+cells+contain+multiple+lineages+and+model+human+nephrogenesis.">Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis.</a> Nature. 526, 564-568 (2015).</li><li>Morizane, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nephron+organoids+derived+from+human+pluripotent+stem+cells+model+kidney+development+and+injury.">Nephron organoids derived from human pluripotent stem cells model kidney development and injury.</a> Nature Biotechnology. 33, 1193-1200 (2015).</li><li>Musah, S., Dimitrakakis, N., Camacho, D. M., Church, G. M., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+differentiation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+into+mature+kidney+podocytes+and+establishment+of+a+Glomerulus+Chip.">Directed differentiation of human induced pluripotent stem cells into mature kidney podocytes and establishment of a Glomerulus Chip.</a> Nature Protocols. 13, 1662-1685 (2018).</li><li>Pozzi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beta1+integrin+expression+by+podocytes+is+required+to+maintain+glomerular+structural+integrity.">Beta1 integrin expression by podocytes is required to maintain glomerular structural integrity.</a> Developmental Biology. 316, 288-301 (2008).</li><li>Kanasaki, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin+beta1-mediated+matrix+assembly+and+signaling+are+critical+for+the+normal+development+and+function+of+the+kidney+glomerulus.">Integrin beta1-mediated matrix assembly and signaling are critical for the normal development and function of the kidney glomerulus.</a> Developmental Biology. 313, 584-593 (2008).</li><li>Musah, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mature+induced-pluripotent-stem-cell-derived+human+podocytes+reconstitute+kidney+glomerular-capillary-wall+function+on+a+chip.">Mature induced-pluripotent-stem-cell-derived human podocytes reconstitute kidney glomerular-capillary-wall function on a chip.</a> Nature Biomedical Engineering. 1, 0069 (2017).</li><li>Torban, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PAX2+Activates+WNT4+Expression+during+Mammalian+Kidney+Development.">PAX2 Activates WNT4 Expression during Mammalian Kidney Development.</a> Journal of Biological Chemistry. 281, 12705-12712 (2006).</li><li>Reiser, J., Sever, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Podocyte+biology+and+pathogenesis+of+kidney+disease.">Podocyte biology and pathogenesis of kidney disease.</a> Annual Review of Medicine. 64, 357-366 (2013).</li><li>Kuusniemi, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+Expression+of+Nephrin+in+Human+and+Pig.">Tissue Expression of Nephrin in Human and Pig.</a> Pediatric Research. 55, 774-781 (2004).</li><li>Guo, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=WT1+is+a+key+regulator+of+podocyte+function:+reduced+expression+levels+cause+crescentic+glomerulonephritis+and+mesangial+sclerosis.">WT1 is a key regulator of podocyte function: reduced expression levels cause crescentic glomerulonephritis and mesangial sclerosis.</a> Human Molecular Genetics. 11, 651-659 (2002).</li><li>Roselli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Podocin+localizes+in+the+kidney+to+the+slit+diaphragm+area.">Podocin localizes in the kidney to the slit diaphragm area.</a> American Journal of Pathology. 160, 131-139 (2002).</li><li>Shadrin, I. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiopatch+platform+enables+maturation+and+scale-up+of+human+pluripotent+stem+cell-derived+engineered+heart+tissues.">Cardiopatch platform enables maturation and scale-up of human pluripotent stem cell-derived engineered heart tissues.</a> Nature Communications. 8, 1825 (2017).</li><li>Satoh, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=aPKC&#955;+maintains+the+integrity+of+the+glomerular+slit+diaphragm+through+trafficking+of+nephrin+to+the+cell+surface.">aPKC&#955; maintains the integrity of the glomerular slit diaphragm through trafficking of nephrin to the cell surface.</a> The Journal of Biochemistry. 156, 115-128 (2014).</li><li>Mae, S. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+and+robust+induction+of+nephrogenic+intermediate+mesoderm+from+human+pluripotent+stem+cells.">Monitoring and robust induction of nephrogenic intermediate mesoderm from human pluripotent stem cells.</a> Nature Communications. 4, 1367 (2013).</li><li>Reya, T., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt+signalling+in+stem+cells+and+cancer.">Wnt signalling in stem cells and cancer.</a> Nature. 434, 843-850 (2005).</li><li>Clevers, H., Nusse, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt&#946;-Catenin+Signaling+and+Disease.">Wnt&#946;-Catenin Signaling and Disease.</a> Cell. 149, 1192-1205 (2012).</li><li>Ciampi, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+functional+podocytes+from+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Generation of functional podocytes from human induced pluripotent stem cells.</a> Stem Cell Research. 17, 130-139 (2016).</li><li>Fuente Mora, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+Podocyte+and+Proximal+Tubule-Like+Cells+from+a+Mouse+Kidney-Derived+Stem+Cell+Line.">Differentiation of Podocyte and Proximal Tubule-Like Cells from a Mouse Kidney-Derived Stem Cell Line.</a> Stem Cells and Development. 21, 296-307 (2011).</li><li>Chuah, J. K. C., Zink, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell-derived+kidney+cells+and+organoids:+Recent+breakthroughs+and+emerging+applications.">Stem cell-derived kidney cells and organoids: Recent breakthroughs and emerging applications.</a> Biotechnology Advances. 35, 150-167 (2017).</li><li>Becker, G. J., Hewitson, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+chronic+kidney+disease:+useful+but+not+perfect.">Animal models of chronic kidney disease: useful but not perfect.</a> Nephrology Dialysis Transplantation. 28, 2432-2438 (2013).</li></ol>

בדו"ח זה, אנו מתארים פרוטוקול ליצירת פודוקיטים גלומרולריים בכליות מתאי hiPS. הפודוקיטים שמקורם בתא hiPS מציגים תכונות מורפולוגיות ומולקולריות הקשורות לפנוטיפ פודוקיט הכליות הבוגר13. בפרסומים קודמים, הראינו כי פודוקיטים שמקורם בתא hiPS יכולים לחקות את המבנה ואת פונקציית הסינון הסל...

ההתקדמות בתרבית תאי הגזע הפלוריפוטנטיים האנושיים צפויה לחולל מהפכה ברפואה רגנרטיבית, מידול מחלות וסינון תרופות על ידי מתן מקור מתחדש ומדרגי של חומר ביולוגי שניתן להנדס כדי להשיג כמעט כל סוג תא בגוףהאדם 1. אסטרטגיה זו שימושית במיוחד להפקת סוגי תאים מיוחדים ופונקציונליים שאחרת היה קשה להשיג. תאי גזע פלוריפוטנטים (hiPS) הנגרמים על ידי האדם2,3,4,5 הם אטרקטיביים במיוחד בשל מוצא התא הסומטי שלהם ואת הפוטנציאל שהם מייצגים לרפואה מותאמת אישית. עם זאת, פיתוח שיטות לגזור שושלות תאים אחרות מתאי hiPS נשאר מאתגר בשל השימוש התכוף בתנאי תרבות מוגדרים בצורה גרועה אשר מוביל ליעילות נמוכה ודור לא ספציפי של אוכלוסיות תאים הטרוגניים6,7.
מוצג כאן היא שיטה לגירוש של podocytes כליות בוגרות מתאי hiPS עם ספציפיות ויעילות גבוהה בתנאים מוגדרים כימית. על ידי בחינת התפקידים של גורמים מרובים בתוך microenvironment התא, אסטרטגיית בידול תאי גזע פותחה כי מעורבים אופטימיזציה של גורמים מסיסים המוצגים במדיום תרבית התא, כמו גם גורמים בלתי מסיסים, כגון רכיבי מטריצה חוץ תאית או מצעים דבק. בהתחשב בחשיבות האיתות האינקגרי בהתפתחות ובתפקוד של הפודוקיטה, הביטוי של קולטנים integrin על פני התא נבדק בתחילה. β1 integrins באו לידי ביטוי מאוד לא רק בתאי hiPS, אלא גם בנגזרותיהם כולל mesoderm ותאי mesoderm ביניים8,9,10. ניסויים הבאים אישרו כי ליגנדים שנקשרים לאינטגרינים β1 (כולל למינין 511 או למינין 511-E8) תומכים בהידבקות ובידול של תאי hiPS לפודוציטים כאשר נעשה בהם שימוש בשילוב עם המדיה האינדוקטיבית המסיסה המתוארת להלן.
אינדוקציה של מחויבות שושלת התאים יזמה על ידי אישור תחילה כי תאי hiPS בתרבית על המשטחים מצופים למינין במשך יומיים בנוכחות מדיום המכיל Activin A, CHIR99021, ומעכב סלע Y27632 יכול להבדיל לתאים המבטאים את סמני mesoderm מוקדם HAND1, עור ברווז, brachyury8,11. טיפול בתאי mesoderm במשך 14 ימים עם מדיום בתוספת חלבון מורפוגנטי עצם 7 (BMP-7) ו CHIR99021 אפשר את הנגזרת של תאי mesoderm ביניים שביטא את סמני תא נפרון-אבות גידול 1 (WT1), חלבון קשור דילוג מוזר 1 (OSR1)8,11, ואת הגן תיבת מזווג 2 חלבון (PAX2)12. כדי להפיק את הפודוקיטים הגלומרולריים הבוגרים של הכליות, תאי המסודרם הבינוניים טופלו במשך 4-5 ימים במדיום חדשני המורכב מ- BMP-7, Activin A, גורם גדילה אנדותל וסקולרי (VEGF), חומצה ריטינואיתטרנסית ו- CHIR99021. ציטומטריית זרימה וחיסון שימשו כדי לאשר כי >90% מהתאים המתקבלים הציגו את המאפיינים המולקולריים, המורפולוגיים והתפקודיים של פודוקייט הכליות הבוגר8,11,13. מאפיינים אלה כוללים התפתחות של תהליכים ראשוניים ומשניים ברגל; הביטוי של גנים ספציפיים לשושלת שושלת פודוקיטים כולל SYNPO, PODXL, MAF, EFNB28 וביטוי של חלבונים כולל פודוקין, נפרין, ו WT114,15,16. בנוסף, נמצא כי פודוקיטים שמקורם בתא hiPS ניתן לשמור בתרבות עד ארבעה שבועות במבחנה באמצעות בינוני זמין מסחרית 8,11 אשר מספקגמישותנוספת בתזמון של ניסויים במורד הזרם. לקבלת מידע נוסף לגבי לוחות ציטומטריית הזרימה המשמשים לקביעת טוהר ה- hiPS-podocytes, עיין בפרסום הקודם שלנו11.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DU11 human iPS cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>The DU11(Duke University clone #11) iPS cell line was generated at the Duke University iPSC Core Facility and provided to us by the Bursac Lab at Duke University. This line has been tested for mycoplasma and was last karyotyped in July 2019 by our lab, and found to be karyotypically normal.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Growth Factors and Media Supplements</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>All-trans retinoic acid (500 mg)</td>
			<td>72262</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 serum-free supplement</td>
			<td>17504044</td>
			<td>Thermo/Life Technologies</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021</td>
			<td>04-0004</td>
			<td>Stemgent</td>
			<td>May show lot-to-lot variation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete Medium Kit with CultureBoost-R</td>
			<td>4Z0-500-R</td>
			<td>Cell Systems</td>
			<td>Podocyte maintenance media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>12634028</td>
			<td>Thermo/Life Technologies</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12 with GlutaMAX supplement</td>
			<td>10565042</td>
			<td>Thermo/Life Technologies</td>
			<td>DMEM/F12 with glutamine supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat-inactivated FBS</td>
			<td>10082147</td>
			<td>Thermo/Life Technologies</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human activin A</td>
			<td>PHC9564</td>
			<td>Thermo/Life Technologies</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human BMP7</td>
			<td>PHC9544</td>
			<td>Thermo/Life Technologies</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human VEGF</td>
			<td>PHC9394</td>
			<td>Thermo/Life Technologies</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR1 medium</td>
			<td>05850</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>hiPS cell culture media (CCM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin&#8211;streptomycin, liquid (100&#215;)</td>
			<td>15140-163</td>
			<td>Thermo/Life Technologies</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y27632 ROCK inhibitor</td>
			<td>1254</td>
			<td>Tocris</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488&#8211; and Alexa Fluor 594&#8211;conjugated secondary antibodies</td>
			<td>A32744; A32754; A-11076; A32790</td>
			<td>Thermo/Life Technologies</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brachyury(T&#65289;</td>
			<td>ab20680</td>
			<td>Abcam</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nephrin</td>
			<td>GP-N2</td>
			<td>Progen</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT4</td>
			<td>AF1759</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAX2</td>
			<td>71-6000</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WT1</td>
			<td>MAB4234</td>
			<td>Millipore</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECM Molecules</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iMatrix-511 Laminin-E8 (LM-E8) fragment</td>
			<td>N-892012</td>
			<td>Iwai North America</td>
			<td>Basement membrane (BM) matrix 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel hESC-qualified matrix, 5-mL vial</td>
			<td>354277</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>Basement membrane (BM) matrix 1. May show lot-to-lot variation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enzymes and Other Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>A1110501</td>
			<td>Thermo/Life Technologies</td>
			<td>Cell detachment solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>A9418</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>D2438</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DMSO is toxic. Should be handled in chemical safety hood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enzyme-free cell dissociation buffer, Hank&#8217;s balanced salt</td>
			<td>13150016</td>
			<td>Thermo/Life Technologies</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol solution, 70% (vol/vol), biotechnology grade</td>
			<td>97065-058</td>
			<td>VWR</td>
			<td>Ethanol is flammable and toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>431097</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>28906</td>
			<td>Thermo/Life Technologies</td>
			<td>PFA should be handled in a chemical fume hood with proper personal protection equipment, including gloves, lab coat, and safety eye glasses. Avoid inhalation and contact with skin.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>14190-250</td>
			<td>Thermo/Life Technologies</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Distilled Water</td>
			<td>15230162</td>
			<td>Thermo/Life Technologies</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>97062-208</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA, 0.05%</td>
			<td>25300-120</td>
			<td>Thermo/Life Technologies</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aspirating pipettes, individually wrapped</td>
			<td>29442-462</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avanti J-15R Centrifuge</td>
			<td>B99516</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical centrifuge tube, 15 mL</td>
			<td>352097</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical centrifuge tube, 50 mL</td>
			<td>352098</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryoboxes</td>
			<td>3395465</td>
			<td>Thermo/Life Technologies</td>
			<td>For storing frozen aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS M7000</td>
			<td>AMF7000</td>
			<td>Thermo/Life Technologies</td>
			<td>Flourescent microscope used to acquire images of fixed and stained iPS cells and their derivatives</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>100503-092</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heracell VIOS 160i CO2 incubator</td>
			<td>51030403</td>
			<td>Thermo/Life Technologies</td>
			<td>For the routine culture and maintenace of iPS cells and their derivatives</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Zeiss Axio Observer equipped with AxioCam 503 camera</td>
			<td>491916-0001-000(microscope) ; 426558-0000-000(camera)</td>
			<td>Carl Zeiss Microscopy</td>
			<td>Used to acquire phase contrast images of live iPS cells and their derivatives at each stage of podocyte differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimberly-Clark nitrile gloves</td>
			<td>40101-346</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes, large</td>
			<td>21905-049</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes, small</td>
			<td>21905-026</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P10 precision barrier pipette tips</td>
			<td>P1096-FR</td>
			<td>Denville Scientific</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P100 barrier pipette tips</td>
			<td>P1125</td>
			<td>Denville Scientific</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P1000 barrier pipette tips</td>
			<td>P1126</td>
			<td>Denville Scientific</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P20 barrier pipette tips</td>
			<td>P1121</td>
			<td>Denville Scientific</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P200 barrier pipette tips</td>
			<td>P1122</td>
			<td>Denville Scientific</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipette, 10 mL, individually wrapped</td>
			<td>356551</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipette, 25 mL, individually wrapped</td>
			<td>356525</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipette, 5 mL, individually wrapped</td>
			<td>356543</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steriflip, 0.22 &#956;m, PES</td>
			<td>SCGP00525</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Microcentrifuge Tubes</td>
			<td>1138W14</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>For aliquoting growth factors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture&#8211;treated 12-well plates</td>
			<td>353043</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture&#8211;treated six-well plates</td>
			<td>353046</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR white techuni lab coat</td>
			<td>10141-342</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wide-beveled cell lifter</td>
			<td>3008</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

guided differentiation of mature kidney podocytes from human induced pluripotent stem cells under chemically defined conditions

מחלת כליות משפיעה על יותר מ -10% מהאוכלוסייה העולמית ועולה מיליארדי דולרים בהוצאות פדרליות. הצורות החמורות ביותר של מחלת כליות ואי ספיקת כליות סופנית בסופו של דבר נגרמות לעתים קרובות על ידי הנזק לפודוציטים גלומרולריים, שהם תאי האפיתל המיוחדים ביותר המתפקדים יחד עם תאי אנדותל וקרום המרתף הגלומרולרי כדי ליצור את מחסום הסינון של הכליה. ההתקדמות ברפואה הכליתית הופרעה על ידי הזמינות המוגבלת של רקמות ראשוניות והיעדר שיטות חזקות להפקת תאי כליות אנושיים פונקציונליים, כגון פודוקיטים. היכולת להפיק פודוקיטים ממקורות מתחדשים, כגון תאי גזע, יכולה לסייע בקידום ההבנה הנוכחית של מנגנוני התפתחות הכליות והמחלות האנושיות, וכן לספק כלים חדשים לגילוי טיפולי. מטרת פרוטוקול זה הייתה לפתח שיטה להפקת פודוקיטים בוגרים, פוסט-מיטוטיים מתאי גזע פלוריפוטנטים (hiPS) הנגרמים על ידי האדם עם יעילות וספציפיות גבוהות, ובתנאים מוגדרים כימית. הפודוקיטים שמקורם בתא hiPS המיוצרים בשיטה זו מבטאים סמנים ספציפיים לשושלת היוחסין (כולל נפרין, פודוקין וגידול 1 של וילם) ומציגים את המאפיינים המורפולוגיים המיוחדים (כולל תהליכי כף הרגל הראשוניים והמשניים) הקשורים לפודוציטים בוגרים ופונקציונליים. באופן מסקרן, תכונות מיוחדות אלה נעדרות באופן בולט בקו התא הפודוקיט המונצח הנמצא בשימוש נרחב בתחום, מה שמצביע על כך שהפרוטוקול המתואר כאן מייצר פודוקיטים של כליות אנושיות שיש להן פנוטיפ בוגר יותר מבחינה התפתחותית מאשר קווי התאים הפודוקיטים הקיימים המשמשים בדרך כלל לחקר ביולוגיה של כליות אנושיות.

מטרת פרוטוקול זה הייתה להדגים כי פודוקיטים אנושיים בוגרים יכולים להיגזר מתאי hiPS בתנאים מוגדרים כימית. הנתונים המוצגים בכתב יד זה נוצרו באמצעות קו התא DU11 hiPS17, אשר נבדקו לראשונה, ונמצאו נקיים ממיקופלסטיסמה. ניתוח כרומוזומלי בוצע גם, והתאים נמצאו תקינים קריוטיפיים. החל מתאי ה-DU11...

Watch this Scientific Journal Video about Guided Differentiation of Mature Kidney Podocytes from Human Induced Pluripotent Stem Cells Under Chemically Defined Conditions at JoVE.com

Guided Differentiation of Mature Kidney Podocytes from Human Induced Pluripotent Stem Cells Under Chemically Defined Conditions

מוצג כאן פרוטוקול מוגדר כימית להפקת פופוטים כליות אנושיים מתאי גזע פלוריפוטנטים מושרים ביעילות גבוהה (>90%) ותלויים במניפולציות גנטיות או בבחירת תת-אכלוס. פרוטוקול זה מייצר את סוג התא הרצוי בתוך 26 ימים והוא יכול להיות שימושי לבדיקות nephrotoxicity ומידול מחלות.

הבחנה מודרכת של פודוקיטים בוגרים של כליות מתאי גזע פלוריפוטנטיים הנגרמים על ידי האדם בתנאים מוגדרים כימית

Kidney disease affects more than 10% of the global population and costs billions of dollars in federal expenditures. The most severe forms of kidney ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Alginate Microcapsule as a 3D Platform for Propagation and Differentiation of Human Embryonic Stem Cells (hESC) to Different Lineages

Alginate Microcapsule as a 3D Platform for Propagation and Differentiation of Human Embryonic Stem Cells hESC to Different Lineages

אלגינט microcapsule כפלטפורמה 3D עבור ריבוי והתמיינות של בתאי גזע עובריים אנושיים (hESC) כדי שושלות שונות

Human embryonic stem cells (hESC) are emerging as an attractive alternative source for cell replacement therapy since they can be expanded in culture ...

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells (hESCs) and Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs)

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells hESCs and Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs

פיתוח, הרחבה, ו<em&gt; בvivo</emתאי גזע pluripotent&gt; ניטור של תאי NK אדם מתאי גזע עובריים אנושיים (hESCs) ומושרה (iPSCs)

We present a method for deriving natural killer (NK) cells from undifferentiated hESCs and iPSCs using a feeder-free approach. This method gives rise to ...

Transplantation of Induced Pluripotent Stem Cell-derived Mesoangioblast-like Myogenic Progenitors in Mouse Models of Muscle Regeneration

השתלה של תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרה נגזר Mesoangioblast כמו אבות מיוגניים במודלים עכבר של התחדשות שרירים

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells ...

Isolation of Mesenchymal Stem Cells from Human Alveolar Periosteum and Effects of Vitamin D on Osteogenic Activity of Periosteum-derived Cells

בידוד של גזע Mesenchymal מן האדם קרום העצם מכתשיים ואפקטים של ויטמין D על פעילות Osteogenic של תאים נגזר קרום העצם

Mesenchymal stem cells (MSCs) are present in a variety of tissues and can be differentiated into numerous cell types, including osteoblasts. Among the ...

Human Pluripotent Stem Cell Culture on Polyvinyl Alcohol-Co-Itaconic Acid Hydrogels with Varying Stiffness Under Xeno-Free Conditions

התרבות תאי גזע Pluripotent אנושי על פוליויניל אלכוהול-Co-Itaconic Hydrogels חומצה עם קשיות שונות בתנאים קסנו-חופשית

The effect of physical cues, such as the stiffness of biomaterials on the proliferation and differentiation of stem cells, has been investigated by ...

Isolation of Adult Human Dermal Fibroblasts from Abdominal Skin and Generation of Induced Pluripotent Stem Cells Using a Non-Integrating Method

בידוד של האדם למבוגרים פיברוכדורים מעור הבטן הדור של המושרה בתאי גזע Pluriפוטנטי באמצעות שיטה שאינה משלבת

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) could be considered, to date, a promising source of pluripotent cells for the management of currently untreatable ...

Scalable Generation of Mature Cerebellar Organoids from Human Pluripotent Stem Cells and Characterization by Immunostaining

דור מדרגי של אורגנואידים המוח הקטן בוגר מתאי גזע פלורופוטנטיים אנושיים ואפיון על ידי אימונוסטיין

The cerebellum plays a critical role in the maintenance of balance and motor coordination, and a functional defect in different cerebellar neurons can ...

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

מדידה פוטנציאלית לפעולה אופטית חד-תאית בקרדיומיוציטים שמקורם בתאי גזע מושרים על ידי תאי גזע אנושיים

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...

Fibroblast Derived Human Engineered Connective Tissue for Screening Applications

פיברובלסט נגזר רקמת חיבור מהונדסת אנושית עבור יישומי הקרנה

Fibroblasts are phenotypically highly dynamic cells, which quickly transdifferentiate into myofibroblasts in response to biochemical and biomechanical ...