Name: measuring post-stroke cerebral edema, infarct zone and blood-brain barrier breakdown in a single set of rodent brain samples
Uploaded: 2020-10-23T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measuring Post-Stroke Cerebral Edema, Infarct Zone and Blood-Brain Barrier Breakdown in a Single Set of Rodent Brain Samples at JoVE.com

Vi takker Maryna Kuscheriava, Maksym Kryvonosov, Daryna Yakumenko og Evgenia Goncharyk fra Institut for Fysiologi, Det Biologiske Fakultet, Økologi og Medicin, Oles Honchar, Dnipro University, Dnipro, Ukraine for deres støtte og nyttige bidrag til vores drøftelser. De indhentede data er en del af Ruslan Kuts' ph.d.-afhandling.

Følgende procedurer blev gennemført i overensstemmelse med henstillingerne i Helsingfors- og Tokyo-erklæringen og retningslinjerne for anvendelse af forsøgsdyr i Det Europæiske Fællesskab. Forsøgene blev også godkendt af Animal Care Committee på Ben-Gurion University of the Negev.
1. Forberedelse af rotter til forsøgsproceduren
<ol><li>Vælg voksne mandlige Sprague-Dawley rotter uden åbenlys patologi, der hver vejer mellem 300 og 350 g.</li>
	<li>Alle rotter skal opbevares ved stu...

Hovedformålet med denne protokol var at påvise konsekvente målinger af tre hovedparametre for iskæmisk skade: IZ, BE og BBB permeabilitet. Tidligere undersøgelser på dette område har vist muligheden for at udføre en eller to af disse parametre sammen i samme stikprøve. Ud over den omkostningsreduktion, som denne tredelte metode tilbyder, giver den også en mere ønskelig bioetisk model, der begrænser antallet af dyr, der skal opereres på og efterfølgende aflives. Som i alle histologiske teknikker er metoden b...

En af de mest almindelige årsager til sygelighed og dødelighed på verdensplan er slagtilfælde. Globalt repræsenterer iskæmisk slagtilfælde 68% af alle slagtilfælde tilfælde, mens der i USA iskæmisk slagtilfælde tegner sig for 87% af slagtilfælde tilfælde1,2. Det anslås , at den økonomiske byrde ved slagtilfælde når op på34 mia. Dyremodeller af slagtilfælde er nødvendige for at studere sin patofysiologi, udvikle nye metoder til evaluering og foreslå nye terapeutiske muligheder4.
Iskæmisk slagtilfælde opstår med okklusion af en større cerebral arterie, normalt den midterste cerebral arterie eller en af dens grene5. Således modeller af iskæmisk slagtilfælde har historisk involveret midten cerebral arterie okklusion (MCAO)6,7,8,9,10,11,12. Efter MCAO, neurologisk skade vurderes oftest ved at måle infarktzone (IZ) ved hjælp af en farvningsmetode på 2,3,5-triphenylenrazoliumchlorid (TTC)13, hjerneødem (BE) ved hjælp af tørring eller beregning af halvkugleformet volumen14,15,16og bbb-permeabilitet (blood brain barrier) ved hjælp af en spektrometriteknik ved hjælp af Evans blå farvning17,18,19.
Den traditionelle MCAO-metode bruger separate sæt hjerner til hver af de tre hjernemålinger. For en stor stikprøvestørrelse resulterer dette i et betydeligt antal aflivede dyr med yderligere etiske og økonomiske overvejelser. En alternativ metode til at lette disse omkostninger ville indebære målinger af alle tre parametre i et enkelt sæt af post-MCAO gnaver hjerner.
Tidligere forsøg er blevet gjort for at måle kombinationer af parametre i samme hjerneprøve. Samtidige immunfluorescerende farvningsmetoder20 samt andre molekylære og biokemiske analyser21 er blevet beskrevet efter TTC-farvning i samme hjerneprøve. Vi har tidligere beregnet hjernehalvdel mængder til at vurdere hjernen ødem og udført TTC farvning til at beregne infarkt zone i samme hjerne sæt15.
I denne protokol præsenterer vi en modificeret MCAO-teknik, der måler iskæmisk hjerneskade ved at bestemme IZ, BE og BBB permeabilitet i det samme sæt gnaverhjerner. IZ måles ved TTC-farvning, BE bestemmes ved beregning af halvkugleformet volumen, og BBB-permeabilitet opnås ved spektrometrimetoder19. I denne protokol brugte vi en modificeret MCAO-model, baseret på direkte indsættelse og fiksering af monofilamentkateteret i den indre halspulsåre (ICA) og yderligere blokering af blodgennemstrømningen til den midterste cerebral arterie (MCA)22. Denne ændrede metode viser en nedsat dødelighed og sygelighed sammenlignet med den traditionelle MCAO-metode16,22.
Denne nye tilgang giver en økonomisk sund og etisk model til måling af neurologiske skader efter MCAO. Denne vurdering af de vigtigste parametre for iskæmisk hjerneskade vil bidrage til en omfattende undersøgelse af dens patofysiologi.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2 mL Syringe</td>
			<td>Braun</td>
			<td>4606027V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2% chlorhexidine in 70% alcohol solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>500 cc</td>
			<td>Provides general antisepsis of the skin in the operatory field</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27 G Needle with Syringe</td>
			<td>Braun</td>
			<td>305620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-0 Silk sutures</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>1007842</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-0 Nylon suture</td>
			<td>4-00</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain &#38; Tissue Matrices</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>15013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cannula Venflon 22 G</td>
			<td>KD-FIX</td>
			<td>183603985447</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Sigma 2-16P</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Sigma 2-16P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compact Analytical Balances</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>HR-AZ/HR-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital weighing scale</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Rs 4,000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting scissors</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z265969</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf pipette</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z683884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf tube</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>EP0030119460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence detector</td>
			<td>Tecan, M&#228;nnedorf Switzerland</td>
			<td>Model: Infinite 200 PRO multimode reader</td>
			<td>Optional.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence detector</td>
			<td>Molecular Devices LLC</td>
			<td>VWR cat. # 10822 512 SpectraMax Paradigm Multi Mode Microplate Reader Base Instrument</td>
			<td>Optional.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gauze sponges</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>22-362-178</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heater with thermometer</td>
			<td>Heatingpad-1</td>
			<td>Model: HEATINGPAD-1/2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemostatic microclips</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horizon-XL</td>
			<td>Mennen Medical Ltd</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Infusion cuff</td>
			<td>ABN</td>
			<td>IC-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro forceps</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro scissors</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiset</td>
			<td>Teva Medical</td>
			<td>998702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus BX 40 microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Operating forceps</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Operating scissors</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical scanner</td>
			<td>Canon</td>
			<td>Cano Scan 4200F</td>
			<td>Resolution 3200 x 6400 dpi</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5606</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purina Chow</td>
			<td>Purina</td>
			<td>5001</td>
			<td>Rodent laboratory chow given to rats, mice and hamster is a life-cycle nutrition that has been used in biomedical research for over 5 decades. Provided to rats ad libitum in this experiment.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat cages</td>
			<td>Techniplast</td>
			<td>2000P</td>
			<td>Conventional housing for rodents. Cages were used for housing rats throughout the experiment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel blades #11</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adobe Photoshop CS2 for Windows</td>
			<td>Adobe</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ 1.37v</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td>The source code is freely available. The author, Wayne Rasband (wayne@codon.nih.gov), is at the Research Services Branch, National Institute of Mental Health, Bethesda, Maryland, USA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Office 365 ProPlus</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td>-</td>
			<td>Microsoft Office Excel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Windows 10</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>298-96-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50% trichloroacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>76-03-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 96 %</td>
			<td>Romical</td>
			<td></td>
			<td>Flammable liquid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Evans blue 2%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>314-13-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane, USP 100%</td>
			<td>Piramamal Critical Care, Inc</td>
			<td>NDC 66794-017</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring post-stroke cerebral edema, infarct zone and blood-brain barrier breakdown in a single set of rodent brain samples

En af de mest almindelige årsager til sygelighed og dødelighed på verdensplan er iskæmisk slagtilfælde. Historisk set, et dyr model, der anvendes til at stimulere iskæmisk slagtilfælde indebærer midten cerebral arterie okklusion (MCAO). Infarkt zone, hjerneødem og blod-hjerne barriere (BBB) opdeling måles som parametre, der afspejler omfanget af hjerneskade efter MCAO. En væsentlig begrænsning af denne metode er, at disse målinger normalt opnås i forskellige rottehjerneprøver, hvilket fører til etiske og økonomiske byrder på grund af det store antal rotter, der skal aflives for en passende prøvestørrelse. Her præsenterer vi en metode til præcist at vurdere hjerneskade efter MCAO ved at måle infarkt zone, hjerneødem og BBB permeabilitet i samme sæt rottehjerner. Denne nye teknik giver en mere effektiv måde at evaluere patofysiologi af slagtilfælde.

Måling af infarkt zone
En uafhængig prøve t-test viste, at 19 rotter, der gennemgik permanent MCAO, udviste en betydelig stigning i hjernens infarktvolumen sammenlignet med de 16 sham-opererede rotter (MCAO = 7,49% ± 3,57 vs. Sham = 0,31% ± 1,9, t(28,49) = 7,56, p < 0,01 (se figur 2A)). Dataene udtrykkes som en gennemsnitlig procentdel af den kontralaterale halvkugle ± SD.
Måling af hjer...

Watch this Scientific Journal Video about Measuring Post-Stroke Cerebral Edema, Infarct Zone and Blood-Brain Barrier Breakdown in a Single Set of Rodent Brain Samples at JoVE.com

Measuring Post-Stroke Cerebral Edema, Infarct Zone and Blood-Brain Barrier Breakdown in a Single Set of Rodent Brain Samples

Denne protokol beskriver en ny teknik til måling af de tre vigtigste parametre for iskæmisk hjerneskade på samme sæt gnaver hjerneprøver. Det er meget fordelagtigt kun at bruge én hjerneprøve med hensyn til etiske og økonomiske omkostninger.

Måling af Post-Stroke Cerebral Ødem, Infarct Zone og Blod-Brain Barrier Opdeling i et enkelt sæt gnaver Hjerne Prøver

One of the most common causes of morbidity and mortality worldwide is ischemic stroke. Historically, an animal model used to stimulate ischemic stroke ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

Funktionel Neuroimaging Med Ultrasonic blod-hjerne barrieren forstyrrelser og mangan-forstærket MRI

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

Assessment of Blood-brain Barrier Permeability by Intravenous Infusion of FITC-labeled Albumin in a Mouse Model of Neurodegenerative Disease

Vurdering af blod - hjerne barrieren permeabilitet af intravenøs Infusion af FITC-mærket Albumin i en musemodel af neurodegenerativ sygdom

Disruption of blood-brain barrier (BBB) integrity is a common feature for different neurological and neurodegenerative diseases. Although the interplay ...

An In Vivo Blood-brain Barrier Permeability Assay in Mice Using Fluorescently Labeled Tracers

An In Vivo Blood-brain Barrier Permeability Assay in Mice Using Fluorescently Labeled Tracers

En In Vivo blod - hjerne barrieren permeabilitet Assay i mus ved hjælp af Fluorescently mærket røbestoffer

Blood-brain barrier (BBB) is a specialized barrier that protects the brain microenvironment from toxins and pathogens in the circulation and maintains ...

An In Vivo Assessment of Blood-Brain Barrier Disruption in a Rat Model of Ischemic Stroke

An In Vivo Assessment of Blood-Brain Barrier Disruption in a Rat Model of Ischemic Stroke

En In Vivo evaluering af blod - hjerne barrieren forstyrrelser i en rotte Model af iskæmisk slagtilfælde

Ischemic stroke leads to vasogenic cerebral edema and subsequent primary brain injury, which is mediated through destruction of the blood-brain barrier ...

Effects of Blast-induced Neurotrauma on Pressurized Rodent Middle Cerebral Arteries

Virkningerne af Blast-induceret Neurotrauma på trykisoleret gnaver midt cerebrale arterier

Though there have been studies on the histopathological and behavioral effects of blast exposure, fewer have been dedicated to blast&#39;s cerebral ...

A Benchtop Approach to the Location Specific Blood Brain Barrier Opening using Focused Ultrasound in a Rat Model

En benchtop tilgang til placeringsspecifik blodhjernebarriereåbning ved hjælp af fokuseret ultralyd i en rottemodel

Stereotaxic surgery is the gold standard for localized drug and gene delivery to the rodent brain. This technique has many advantages over systemic ...

A High-Throughput Image-Guided Stereotactic Neuronavigation and Focused Ultrasound System for Blood-Brain Barrier Opening in Rodents

En high-throughput Image-Guided Stereotactic Neuronavigation og fokuseret ultralyd system til blod-hjerne barrieren Åbning i gnavere

The blood-brain barrier (BBB) has been a major hurdle for the treatment of various brain diseases. Endothelial cells, connected by tight junctions, form a ...

Focused Ultrasound Induced Blood-Brain Barrier Opening for Targeting Brain Structures and Evaluating Chemogenetic Neuromodulation

Fokuseret ultralydinduceret blod-hjerne-barriereåbning til målretning af hjernestrukturer og evaluering af kemogenetisk neuromodulation

Acoustically Targeted Chemogenetics (ATAC) allows for the noninvasive control of specific neural circuits. ATAC achieves such control through a ...

Transendothelial Resistance Measurement to Assess Cell Barrier Integrity

Barrier Functional Integrity Recording on bEnd.3 Vascular Endothelial Cells via Transendothelial Electrical Resistance Detection

Applications of TEER Detection to Assess Cell Barrier Integrity (Video) | JoVE

Registrering af barrierefunktionel integritet på bEnd.3 Vaskulære endotelceller via transendotelial elektrisk modstandsdetektion

The blood-brain barrier (BBB) is a dynamic physiological structure composed of microvascular endothelial cells, astrocytes, and pericytes. By coordinating ...

A 3D Blood-Brain Barrier Model Derived from Human Pluripotent Stem-Cells

Reconstruction of the Blood-Brain Barrier In Vitro to Model and Therapeutically Target Neurological Disease

A Personalized Approach Towards Investigating Alzheimer's Disease Using an In Vitro Blood-Brain Barrier Model (Video) | JoVE

Rekonstruktion af blod-hjerne-barrieren in vitro til modellering og terapeutisk målretning af neurologisk sygdom

The blood-brain barrier (BBB) is a key physiological component of the central nervous system (CNS), maintaining nutrients, clearing waste, and protecting ...