Name: measuring post-stroke cerebral edema, infarct zone and blood-brain barrier breakdown in a single set of rodent brain samples
Uploaded: 2020-10-23T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measuring Post-Stroke Cerebral Edema, Infarct Zone and Blood-Brain Barrier Breakdown in a Single Set of Rodent Brain Samples at JoVE.com

Agradecemos a Maryna Kuscheriava, Maksym Kryvonosov, Daryna Yakumenko e Evgenia Goncharyk do Departamento de Fisiologia, Faculdade de Biologia, Ecologia e Medicina, Oles Honchar, Dnipro University, Dnipro, Ucrânia por seu apoio e contribuições úteis às nossas discussões. Os dados obtidos fazem parte da tese de doutorado de Ruslan Kuts.

Os seguintes procedimentos foram conduzidos de acordo com as recomendações da Declaração de Helsinque e Tóquio e as Diretrizes para o Uso de Animais Experimentais da Comunidade Europeia. Os experimentos também foram aprovados pelo Comitê de Cuidados Com Animais da Universidade Ben-Gurion do Negev.
1. Preparando ratos para o procedimento experimental
<ol><li>Selecione ratos adultos machos Sprague-Dawley sem patologia atolizada, cada um pesando entre 300 e 350 g.</li>
	<li>Mantenha todo...

O objetivo principal do presente protocolo foi demonstrar medições consistentes de três parâmetros principais de lesão isquêmica: permeabilidade IZ, BE e BBB. Estudos anteriores neste campo demonstraram a possibilidade de realizar um ou dois desses parâmetros juntos na mesma amostra. Além da redução de custos que este método de três partes oferece, ele também fornece um modelo bioético mais desejável que limita o número de animais que devem ser operados e, posteriormente, eutanizados. Como em todas as té...

Uma das causas mais comuns de morbidade e mortalidade em todo o mundo é o AVC. Globalmente, o AVC isquêmico representa 68% de todos os casos de AVC, enquanto nos Estados Unidos o AVC isquêmico é responsável por 87% dos casos de acidente vascular cerebral1,2. Estima-se que o ônus econômico do AVC atinja US$ 34 bilhões nos Estados Unidos2 e € 45 bilhões na União Europeia3. Modelos animais de AVC são necessários para estudar sua fisiopatologia, desenvolver novos métodos de avaliação e propor novas opções terapêuticas4.
O AVC isquêmico ocorre com a oclusão de uma artéria cerebral grave, geralmente a artéria cerebral média ou um de seus ramos5. Assim, os modelos de AVC isquêmico envolveram historicamente a oclusão da artéria cerebral média (MCAO)6,7,8,9,10,11,12. Seguindo MCAO, a lesão neurológica é mais comumente avaliada pela medição da zona de infarto (IZ) usando um método de coloração de cloreto de tripheniltetrazolium (TTC) de 2,3,5, usando o método de coloração13, edema cerebral (BE) usando secagem ou cálculo dos volumes hemisféricos14,15,16e permeabilidade da barreira cerebral sanguínea (BBB) por uma técnica de espectrometria usando a coloração azul evans17,18,19.
O método tradicional de MCAO usa conjuntos separados de cérebros para cada uma das três medidas cerebrais. Para um grande tamanho amostral, isso resulta em um número significativo de animais eutanizados, com considerações éticas e financeiras adicionais. Um método alternativo para aliviar esses custos envolveria medições de todos os três parâmetros em um único conjunto de cérebros de roedores pós-MCAO.
Tentativas anteriores foram feitas para medir combinações de parâmetros na mesma amostra cerebral. Métodos simultâneos de coloração imunofluorescente20, bem como outras análises moleculares e bioquímicas21 foram descritos após a coloração de TTC na mesma amostra cerebral. Calculamos anteriormente os volumes do hemisfério cerebral para avaliar o edema cerebral e realizamos a coloração do TTC para calcular a zona de infarto no mesmo conjunto cerebral15.
No presente protocolo, apresentamos uma técnica modificada de MCAO que mede a lesão cerebral isquêmica através da determinação da permeabilidade de IZ, BE e BBB no mesmo conjunto de cérebros de roedores. O IZ é medido pela coloração TTC, o BE é determinado pelo cálculo do volume hemisférico, e a permeabilidade do BBB é obtida pelos métodos de espectrometria19. Neste protocolo, utilizou-se um modelo MCAO modificado, baseado na inserção direta e fixação do cateter monofilamento na artéria carótida interna (ICA) e posterior bloqueio do fluxo sanguíneo para a artéria cerebral média (MCA)22. Este método modificado mostra uma taxa reduzida de mortalidade e morbidade em comparação com o método tradicional de MCAO16,22.
Esta nova abordagem fornece um modelo financeiro e ético para medir lesões neurológicas após mcao. Essa avaliação dos principais parâmetros da lesão cerebral isquêmica ajudará a investigar de forma abrangente sua fisiopatologia.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2 mL Syringe</td>
			<td>Braun</td>
			<td>4606027V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2% chlorhexidine in 70% alcohol solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>500 cc</td>
			<td>Provides general antisepsis of the skin in the operatory field</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27 G Needle with Syringe</td>
			<td>Braun</td>
			<td>305620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-0 Silk sutures</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>1007842</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-0 Nylon suture</td>
			<td>4-00</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain &#38; Tissue Matrices</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>15013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cannula Venflon 22 G</td>
			<td>KD-FIX</td>
			<td>183603985447</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Sigma 2-16P</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Sigma 2-16P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compact Analytical Balances</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>HR-AZ/HR-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital weighing scale</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Rs 4,000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting scissors</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z265969</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf pipette</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z683884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf tube</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>EP0030119460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence detector</td>
			<td>Tecan, M&#228;nnedorf Switzerland</td>
			<td>Model: Infinite 200 PRO multimode reader</td>
			<td>Optional.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence detector</td>
			<td>Molecular Devices LLC</td>
			<td>VWR cat. # 10822 512 SpectraMax Paradigm Multi Mode Microplate Reader Base Instrument</td>
			<td>Optional.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gauze sponges</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>22-362-178</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heater with thermometer</td>
			<td>Heatingpad-1</td>
			<td>Model: HEATINGPAD-1/2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemostatic microclips</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horizon-XL</td>
			<td>Mennen Medical Ltd</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Infusion cuff</td>
			<td>ABN</td>
			<td>IC-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro forceps</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro scissors</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiset</td>
			<td>Teva Medical</td>
			<td>998702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus BX 40 microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Operating forceps</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Operating scissors</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical scanner</td>
			<td>Canon</td>
			<td>Cano Scan 4200F</td>
			<td>Resolution 3200 x 6400 dpi</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5606</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purina Chow</td>
			<td>Purina</td>
			<td>5001</td>
			<td>Rodent laboratory chow given to rats, mice and hamster is a life-cycle nutrition that has been used in biomedical research for over 5 decades. Provided to rats ad libitum in this experiment.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat cages</td>
			<td>Techniplast</td>
			<td>2000P</td>
			<td>Conventional housing for rodents. Cages were used for housing rats throughout the experiment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel blades #11</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adobe Photoshop CS2 for Windows</td>
			<td>Adobe</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ 1.37v</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td>The source code is freely available. The author, Wayne Rasband (wayne@codon.nih.gov), is at the Research Services Branch, National Institute of Mental Health, Bethesda, Maryland, USA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Office 365 ProPlus</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td>-</td>
			<td>Microsoft Office Excel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Windows 10</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>298-96-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50% trichloroacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>76-03-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 96 %</td>
			<td>Romical</td>
			<td></td>
			<td>Flammable liquid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Evans blue 2%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>314-13-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane, USP 100%</td>
			<td>Piramamal Critical Care, Inc</td>
			<td>NDC 66794-017</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring post-stroke cerebral edema, infarct zone and blood-brain barrier breakdown in a single set of rodent brain samples

Uma das causas mais comuns de morbidade e mortalidade em todo o mundo é o AVC isquêmico. Historicamente, um modelo animal usado para estimular o AVC isquêmico envolve o oclusão da artéria cerebral média (MCAO). A zona infarto, o edema cerebral e a quebra da barreira hematoencefálica (BBB) são medidos como parâmetros que refletem a extensão da lesão cerebral após o MCAO. Uma limitação significativa para este método é que essas medidas são normalmente obtidas em diferentes amostras cerebrais de ratos, levando a encargos éticos e financeiros devido ao grande número de ratos que precisam ser eutanizados para um tamanho amostral adequado. Aqui apresentamos um método para avaliar com precisão a lesão cerebral após mcao medindo zona de infarto, edema cerebral e permeabilidade BBB no mesmo conjunto de cérebros de ratos. Esta nova técnica fornece uma maneira mais eficiente de avaliar a fisiopatologia do AVC.

Medição da zona de infarto
Um teste t de amostra independente indicou que 19 ratos submetidos a MCAO permanente demonstraram um aumento significativo no volume de infarto cerebral em comparação com os 16 ratos operados por vergonha (MCAO=7,49% ± 3,57 vs. Sham = 0,31% ± 1,9, t(28,49) = 7,56, p < 0,01 (ver Figura 2A).). Os dados são expressos como uma porcentagem média do hemisfério contralateral ± SD.
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Measuring Post-Stroke Cerebral Edema, Infarct Zone and Blood-Brain Barrier Breakdown in a Single Set of Rodent Brain Samples

Este protocolo descreve uma nova técnica de medição dos três parâmetros mais importantes de lesão cerebral isquêmica no mesmo conjunto de amostras cerebrais de roedores. Usar apenas uma amostra cerebral é altamente vantajoso em termos de custos éticos e econômicos.

Medição de edema cerebral pós-acidente vascular cerebral, zona de infarto e quebra da barreira hematoencefálica em um único conjunto de amostras cerebrais de roedores

One of the most common causes of morbidity and mortality worldwide is ischemic stroke. Historically, an animal model used to stimulate ischemic stroke ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

Neuroimagem Funcional Usando rompimento da barreira hemato-encefálica ultra-sônico e Manganês-RM

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

Neurociência

Assessment of Blood-brain Barrier Permeability by Intravenous Infusion of FITC-labeled Albumin in a Mouse Model of Neurodegenerative Disease

Avaliação da permeabilidade da barreira hemato - encefálica por infusão intravenosa de albumina FITC-etiquetadas em um modelo do rato da doença neurodegenerativa

Disruption of blood-brain barrier (BBB) integrity is a common feature for different neurological and neurodegenerative diseases. Although the interplay ...

An In Vivo Blood-brain Barrier Permeability Assay in Mice Using Fluorescently Labeled Tracers

An In Vivo Blood-brain Barrier Permeability Assay in Mice Using Fluorescently Labeled Tracers

Na Vivo barreira hemato - encefálica permeabilidade ensaio nos ratos usando fluorescente etiquetado traçadores

Blood-brain barrier (BBB) is a specialized barrier that protects the brain microenvironment from toxins and pathogens in the circulation and maintains ...

An In Vivo Assessment of Blood-Brain Barrier Disruption in a Rat Model of Ischemic Stroke

An In Vivo Assessment of Blood-Brain Barrier Disruption in a Rat Model of Ischemic Stroke

Uma avaliação In Vivo do rompimento da barreira hemato - encefálica em um modelo do rato de acidente vascular cerebral isquêmico

Ischemic stroke leads to vasogenic cerebral edema and subsequent primary brain injury, which is mediated through destruction of the blood-brain barrier ...

Effects of Blast-induced Neurotrauma on Pressurized Rodent Middle Cerebral Arteries

Efeitos de Neurotrauma induzida por explosão em roedores pressurizado artérias cerebrais de médio

Though there have been studies on the histopathological and behavioral effects of blast exposure, fewer have been dedicated to blast&#39;s cerebral ...

A Benchtop Approach to the Location Specific Blood Brain Barrier Opening using Focused Ultrasound in a Rat Model

Uma abordagem benchtop para a abertura da barreira cerebral de sangue específica do local usando ultrassom focado em um modelo de rato

Stereotaxic surgery is the gold standard for localized drug and gene delivery to the rodent brain. This technique has many advantages over systemic ...

A High-Throughput Image-Guided Stereotactic Neuronavigation and Focused Ultrasound System for Blood-Brain Barrier Opening in Rodents

Um sistema de neuronação estereática guiada por imagem de alta produtividade e sistema de ultrassom focado para abertura de barreira hemencefálica em roedores

The blood-brain barrier (BBB) has been a major hurdle for the treatment of various brain diseases. Endothelial cells, connected by tight junctions, form a ...

Focused Ultrasound Induced Blood-Brain Barrier Opening for Targeting Brain Structures and Evaluating Chemogenetic Neuromodulation

Abertura da Barreira Hematoencefálica Induzida por Ultrassom Focalizado para Atingir Estruturas Cerebrais e Avaliar a Neuromodulação Quimiogenética

Acoustically Targeted Chemogenetics (ATAC) allows for the noninvasive control of specific neural circuits. ATAC achieves such control through a ...

Transendothelial Resistance Measurement to Assess Cell Barrier Integrity

Barrier Functional Integrity Recording on bEnd.3 Vascular Endothelial Cells via Transendothelial Electrical Resistance Detection

Applications of TEER Detection to Assess Cell Barrier Integrity (Video) | JoVE

Registro da Integridade Funcional da Barreira em bEnd.3 Células Endoteliais Vasculares via Detecção de Resistência Elétrica Transendotelial

The blood-brain barrier (BBB) is a dynamic physiological structure composed of microvascular endothelial cells, astrocytes, and pericytes. By coordinating ...

A 3D Blood-Brain Barrier Model Derived from Human Pluripotent Stem-Cells

Reconstruction of the Blood-Brain Barrier In Vitro to Model and Therapeutically Target Neurological Disease

A Personalized Approach Towards Investigating Alzheimer's Disease Using an In Vitro Blood-Brain Barrier Model (Video) | JoVE

Reconstrução da Barreira Hematoencefálica In Vitro para Modelar e Combater Terapeuticamente a Doença Neurológica

The blood-brain barrier (BBB) is a key physiological component of the central nervous system (CNS), maintaining nutrients, clearing waste, and protecting ...