Name: measuring post-stroke cerebral edema, infarct zone and blood-brain barrier breakdown in a single set of rodent brain samples
Uploaded: 2020-10-23T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measuring Post-Stroke Cerebral Edema, Infarct Zone and Blood-Brain Barrier Breakdown in a Single Set of Rodent Brain Samples at JoVE.com

Agradecemos a Maryna Kuscheriava, Maksym Kryvonosov, Daryna Yakumenko y Evgenia Goncharyk del Departamento de Fisiología, Facultad de Biología, Ecología y Medicina, Oles Honchar, Universidad Dnipro, Dnipro, Ucrania por su apoyo y contribuciones útiles a nuestros debates. Los datos obtenidos forman parte de la tesis doctoral de Ruslan Kuts.

Los siguientes procedimientos se llevaron a cabo de acuerdo con las recomendaciones de la Declaración de Helsinki y Tokio y las Directrices para el uso de animales experimentales de la Comunidad Europea. Los experimentos también fueron aprobados por el Comité de Cuidado animal de la Universidad Ben-Gurion del Negev.
1. Preparación de ratas para el procedimiento experimental
<ol><li>Seleccione ratas macho sprague-dawley adultas sin patología excesiva, cada una con un peso de entre 300 y ...

El objetivo principal del presente protocolo era demostrar mediciones consistentes de tres parámetros principales de lesión isquémica: IZ, BE y BBB permeabilidad. Estudios previos en este campo han demostrado la posibilidad de realizar uno o dos de estos parámetros juntos en la misma muestra. Además de la reducción de costes que ofrece este método de tres partes, también proporciona un modelo bioético más deseable que limita el número de animales que deben ser operados y posteriormente eutanasiados. Al igual q...

Una de las causas más comunes de morbilidad y mortalidad en todo el mundo es el accidente cerebrovascular. A nivel mundial, el accidente cerebrovascular isquémico representa el 68% de todos los casos de accidente cerebrovascular, mientras que en los Estados Unidos el accidente cerebrovascular isquémico representa el 87% de los casos de accidente cerebrovascular1,2. Se estima que la carga económica del ictus alcanza los 34.000 millones de dólares en los Estados Unidos2.000 millones de dólares y los 45.000 millones de euros en la Unión Europea3. Los modelos animales de ictus son necesarios para estudiar su fisiopatología, desarrollar nuevos métodos de evaluación y proponer nuevas opciones terapéuticas4.
El accidente cerebrovascular isquémico ocurre con oclusión de una arteria cerebral importante, generalmente la arteria cerebral media o una de sus ramas5. Así, los modelos de accidente cerebrovascular isquémico han implicado históricamente oclusión arterial cerebral media (MCAO)6,7,8,9,10,11,12. Después de MCAO, las lesiones neurológicas se evalúan con mayor frecuencia midiendo la zona infarta (IZ) utilizando un método de tinción de cloruro de 2,3,5 tripfeniltrazolium (TTC)13,edema cerebral (BE) usando14, 15,16,y la permeabilidad de la barrera hemisférica de la barrera hemisférica de la sangre (BBB) mediante una técnica de espectrometría utilizando las manchas azules evans17,18,19.
El método tradicional MCAO utiliza conjuntos separados de cerebros para cada una de las tres mediciones cerebrales. Para un gran tamaño de muestra, esto resulta en un número significativo de animales eutanasiados, con consideraciones éticas y financieras añadidas. Un método alternativo para aliviar estos costos implicaría mediciones de los tres parámetros en un solo conjunto de cerebros de roedores post-MCAO.
Se han realizado intentos anteriores para medir combinaciones de parámetros en la misma muestra cerebral. Se han descrito métodos de tinción inmunofluorescentes simultáneas20, así como otros análisis moleculares y bioquímicos21 después de la tinción de TTC en la misma muestra cerebral. Hemos calculado previamente los volúmenes del hemisferio cerebral para evaluar el edema cerebral y hemos realizado manchas de TTC para calcular la zona infarta en el mismo cerebro establecido15.
En el protocolo actual, presentamos una técnica de MCAO modificada que mide la lesión cerebral isquémica a través de la determinación de la permeabilidad iz, BE y BBB en el mismo conjunto de cerebros de roedores. Iz se mide mediante tinción TTC, BE se determina calculando el volumen hemisférico, y la permeabilidad BBB se obtiene mediante métodos de espectrometría19. En este protocolo, utilizamos un modelo MCAO modificado, basado en la inserción directa y fijación del catéter monofilamento en la arteria carótida interna (ICA) y el bloqueo adicional del flujo sanguíneo a la arteria cerebral media (MCA)22. Este método modificado muestra una disminución de la tasa de mortalidad y morbilidad en comparación con el método tradicional MCAO16,22.
Este nuevo enfoque proporciona un modelo financieramente sólido y ético para medir lesiones neurológicas después de MCAO. Esta evaluación de los principales parámetros de la lesión cerebral isquémica ayudará a investigar exhaustivamente su fisiopatología.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2 mL Syringe</td>
			<td>Braun</td>
			<td>4606027V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2% chlorhexidine in 70% alcohol solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>500 cc</td>
			<td>Provides general antisepsis of the skin in the operatory field</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27 G Needle with Syringe</td>
			<td>Braun</td>
			<td>305620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-0 Silk sutures</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>1007842</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-0 Nylon suture</td>
			<td>4-00</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain &#38; Tissue Matrices</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>15013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cannula Venflon 22 G</td>
			<td>KD-FIX</td>
			<td>183603985447</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Sigma 2-16P</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Sigma 2-16P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compact Analytical Balances</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>HR-AZ/HR-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital weighing scale</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Rs 4,000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting scissors</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z265969</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf pipette</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z683884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf tube</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>EP0030119460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence detector</td>
			<td>Tecan, M&#228;nnedorf Switzerland</td>
			<td>Model: Infinite 200 PRO multimode reader</td>
			<td>Optional.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence detector</td>
			<td>Molecular Devices LLC</td>
			<td>VWR cat. # 10822 512 SpectraMax Paradigm Multi Mode Microplate Reader Base Instrument</td>
			<td>Optional.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gauze sponges</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>22-362-178</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heater with thermometer</td>
			<td>Heatingpad-1</td>
			<td>Model: HEATINGPAD-1/2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemostatic microclips</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horizon-XL</td>
			<td>Mennen Medical Ltd</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Infusion cuff</td>
			<td>ABN</td>
			<td>IC-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro forceps</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro scissors</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiset</td>
			<td>Teva Medical</td>
			<td>998702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus BX 40 microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Operating forceps</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Operating scissors</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical scanner</td>
			<td>Canon</td>
			<td>Cano Scan 4200F</td>
			<td>Resolution 3200 x 6400 dpi</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5606</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purina Chow</td>
			<td>Purina</td>
			<td>5001</td>
			<td>Rodent laboratory chow given to rats, mice and hamster is a life-cycle nutrition that has been used in biomedical research for over 5 decades. Provided to rats ad libitum in this experiment.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat cages</td>
			<td>Techniplast</td>
			<td>2000P</td>
			<td>Conventional housing for rodents. Cages were used for housing rats throughout the experiment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel blades #11</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adobe Photoshop CS2 for Windows</td>
			<td>Adobe</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ 1.37v</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td>The source code is freely available. The author, Wayne Rasband (wayne@codon.nih.gov), is at the Research Services Branch, National Institute of Mental Health, Bethesda, Maryland, USA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Office 365 ProPlus</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td>-</td>
			<td>Microsoft Office Excel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Windows 10</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>298-96-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50% trichloroacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>76-03-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 96 %</td>
			<td>Romical</td>
			<td></td>
			<td>Flammable liquid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Evans blue 2%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>314-13-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane, USP 100%</td>
			<td>Piramamal Critical Care, Inc</td>
			<td>NDC 66794-017</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring post-stroke cerebral edema, infarct zone and blood-brain barrier breakdown in a single set of rodent brain samples

Una de las causas más comunes de morbilidad y mortalidad en todo el mundo es el accidente cerebrovascular isquémico. Históricamente, un modelo animal utilizado para estimular el accidente cerebrovascular isquémico implica oclusión arterial cerebral media (MCAO). La zona infarta, el edema cerebral y la descomposición de la barrera hematoencefálica (BBB) se miden como parámetros que reflejan el alcance de la lesión cerebral después del MCAO. Una limitación significativa a este método es que estas mediciones se obtienen normalmente en diferentes muestras de cerebro de rata, lo que conduce a cargas éticas y financieras debido al gran número de ratas que necesitan ser eutanasiadas para un tamaño de muestra adecuado. Aquí presentamos un método para evaluar con precisión las lesiones cerebrales después de MCAO midiendo la zona infarta, el edema cerebral y la permeabilidad bbb en el mismo conjunto de cerebros de ratas. Esta novedosa técnica proporciona una manera más eficiente de evaluar la fisiopatología del accidente cerebrovascular.

Medición de zona infarto
Una prueba t de muestra independiente indicó que 19 ratas que se sometieron a MCAO permanente demostraron un aumento significativo en el volumen de infartos cerebrales en comparación con las 16 ratas operadas por sham (MCAO=7.49% ± 3.57 contra. Sham = 0,31% ± 1,9, t(28,49) = 7,56, p < 0,01 (véase la Figura 2A)). Los datos se expresan como un porcentaje medio del hemisferio contralateral ± SD.
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Measuring Post-Stroke Cerebral Edema, Infarct Zone and Blood-Brain Barrier Breakdown in a Single Set of Rodent Brain Samples

Este protocolo describe una novedosa técnica de medir los tres parámetros más importantes de la lesión cerebral isquémica en el mismo conjunto de muestras cerebrales de roedores. El uso de una sola muestra cerebral es altamente ventajoso en términos de costos éticos y económicos.

Medición del edema cerebral post-accidente cerebrovascular, zona infarta y descomposición de la barrera hematoencefálica en un solo conjunto de muestras cerebrales de roedores

One of the most common causes of morbidity and mortality worldwide is ischemic stroke. Historically, an animal model used to stimulate ischemic stroke ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

Neuroimagen Funcional Utilizando ultrasonidos hematoencefálica perturbación de la barrera y la RM-manganeso mayor

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

Investigación

Neurociencias

Assessment of Blood-brain Barrier Permeability by Intravenous Infusion of FITC-labeled Albumin in a Mouse Model of Neurodegenerative Disease

Evaluación de la permeabilidad de la barrera hemato - encefálica por infusión intravenosa de albúmina marcado con FITC en un modelo murino de enfermedad neurodegenerativa

Disruption of blood-brain barrier (BBB) integrity is a common feature for different neurological and neurodegenerative diseases. Although the interplay ...

An In Vivo Blood-brain Barrier Permeability Assay in Mice Using Fluorescently Labeled Tracers

An In Vivo Blood-brain Barrier Permeability Assay in Mice Using Fluorescently Labeled Tracers

Un en Vivo Barrera Blood - brain permeabilidad ensayo en ratones usando fluorescencia etiquetada trazadores

Blood-brain barrier (BBB) is a specialized barrier that protects the brain microenvironment from toxins and pathogens in the circulation and maintains ...

An In Vivo Assessment of Blood-Brain Barrier Disruption in a Rat Model of Ischemic Stroke

An In Vivo Assessment of Blood-Brain Barrier Disruption in a Rat Model of Ischemic Stroke

Una evaluación In Vivo de la interrupción de la Barrera Blood - Brain en un modelo de rata de ictus isquémico

Ischemic stroke leads to vasogenic cerebral edema and subsequent primary brain injury, which is mediated through destruction of the blood-brain barrier ...

Effects of Blast-induced Neurotrauma on Pressurized Rodent Middle Cerebral Arteries

Efectos de Neurotrauma inducido ráfaga en roedor a presión media de las arterias cerebrales

Though there have been studies on the histopathological and behavioral effects of blast exposure, fewer have been dedicated to blast&#39;s cerebral ...

A Benchtop Approach to the Location Specific Blood Brain Barrier Opening using Focused Ultrasound in a Rat Model

Un enfoque de sobremesa para la ubicación específica de la barrera hematoencefálica que se abre con ultrasonido enfocado en un modelo de rata

Stereotaxic surgery is the gold standard for localized drug and gene delivery to the rodent brain. This technique has many advantages over systemic ...

A High-Throughput Image-Guided Stereotactic Neuronavigation and Focused Ultrasound System for Blood-Brain Barrier Opening in Rodents

Un Alto Rendimiento De Imagen Guiada Por Neuronavegación Estereotáctica Y Sistema De Ultrasonido Enfocado Para La Apertura De La Barrera Hematoencefálica En Roedores

The blood-brain barrier (BBB) has been a major hurdle for the treatment of various brain diseases. Endothelial cells, connected by tight junctions, form a ...

Focused Ultrasound Induced Blood-Brain Barrier Opening for Targeting Brain Structures and Evaluating Chemogenetic Neuromodulation

Apertura de la barrera hematoencefálica inducida por ultrasonido focalizado para dirigirse a las estructuras cerebrales y evaluar la neuromodulación quimiogenética

Acoustically Targeted Chemogenetics (ATAC) allows for the noninvasive control of specific neural circuits. ATAC achieves such control through a ...

Transendothelial Resistance Measurement to Assess Cell Barrier Integrity

Barrier Functional Integrity Recording on bEnd.3 Vascular Endothelial Cells via Transendothelial Electrical Resistance Detection

Applications of TEER Detection to Assess Cell Barrier Integrity (Video) | JoVE

Registro de la integridad funcional de la barrera en las células endoteliales vasculares bEnd.3 mediante detección de resistencia eléctrica transendotelial

The blood-brain barrier (BBB) is a dynamic physiological structure composed of microvascular endothelial cells, astrocytes, and pericytes. By coordinating ...

A 3D Blood-Brain Barrier Model Derived from Human Pluripotent Stem-Cells

Reconstruction of the Blood-Brain Barrier In Vitro to Model and Therapeutically Target Neurological Disease

A Personalized Approach Towards Investigating Alzheimer's Disease Using an In Vitro Blood-Brain Barrier Model (Video) | JoVE

Reconstrucción de la barrera hematoencefálica in vitro para modelar y atacar terapéuticamente la enfermedad neurológica

The blood-brain barrier (BBB) is a key physiological component of the central nervous system (CNS), maintaining nutrients, clearing waste, and protecting ...