Name: automation of bio-atomic force microscope measurements on hundreds of c. albicans cells
Uploaded: 2021-04-02T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Automation of Bio-Atomic Force Microscope Measurements on Hundreds of C. albicans Cells at JoVE.com

نريد أن نعترف FONCYCYT من كوناسيت (المكسيك) ، ووزارة الخارجية الفرنسية وجامعة باريس 13 ، على الرغم من الدعم المالي للمشروع التعاوني الدولي ECOS - NORD اسمه نانو الجس للتشخيص ، رقم 263337 (المكسيك) وMI5P02 (فرنسا). ويود المكتب أن يشكر الدعم المالي الذي تقدمه الشبكة من خلال المشروع رقم 20195489. ويدعم SPC من قبل زمالة دكتوراه من كوناسيت (رقم 288029) و IPN من خلال اتفاق كوتيل للحصول على شهادة دكتوراه مزدوجة (IPN-UPS). ED وCFD هم باحثون في المركز الوطني للبحوث Scientifique (CNRS).

1. زراعة الخلايا الميكروبية
<ol><li>إحياء الخلايا من مخزون الجلسرين. ملاحظة: يتم تخزين C. albicans في -80 درجة مئوية في مخزونات الجلسرين، على الرخام.<ol>
<li>اختيار الرخام في الأوراق المالية -80 درجة مئوية وفرك على الخميرة بيبتون dextrose (YPD) أجار. تنمو الخلايا لمدة 2 أيام في 30 درجة مئوية، قبل زراعة الس?...

<ol>
	<li>Cross, S. E., Jin, Y. S., Rao, J., Gimzewski, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanomechanical+analysis+of+cells+from+cancer+patients.">Nanomechanical analysis of cells from cancer patients.</a> Nature Nanotechnology. 2 (12), 780-783 (2007).</li><li>Dague, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+force+and+electron+microscopic-based+study+of+sarcolemmal+surface+of+living+cardiomyocytes+unveils+unexpected+mitochondrial+shift+in+heart+failure.">Atomic force and electron microscopic-based study of sarcolemmal surface of living cardiomyocytes unveils unexpected mitochondrial shift in heart failure.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 74, 162-172 (2014).</li><li>Muller, D. J., Helenius, J., Alsteens, D., Dufrene, Y. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force+probing+surfaces+of+living+cells+to+molecular+resolution.">Force probing surfaces of living cells to molecular resolution.</a> Nature Chemical Biology. 5 (6), 383-390 (2009).</li><li>Dague, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+Force+Microscopy+to+Explore+Electroporation+Effects+on+Cells.">Atomic Force Microscopy to Explore Electroporation Effects on Cells.</a> Handbook of Electroporation. , 1-13 (2016).</li><li>Puntheeranurak, T., Neundlinger, I., Kinne, R. K. H., Hinterdorfer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+recognition+force+spectroscopy+of+transmembrane+transporters+on+living+cells.">Single-molecule recognition force spectroscopy of transmembrane transporters on living cells.</a> Nature Protocols. 6 (9), 1443-1452 (2011).</li><li>Formosa, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoscale+analysis+of+the+effects+of+antibiotics+and+CX1+on+a+Pseudomonas+aeruginosa+multidrug-resistant+strain.">Nanoscale analysis of the effects of antibiotics and CX1 on a Pseudomonas aeruginosa multidrug-resistant strain.</a> Scientific Reports. 2, (2012).</li><li>Pillet, F., Chopinet, L., Formosa, C., Dague, &. #. 2. 0. 1. ;. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+Force+Microscopy+and+pharmacology:+From+microbiology+to+cancerology.">Atomic Force Microscopy and pharmacology: From microbiology to cancerology.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - General Subjects. 1840 (3), 1028-1050 (2014).</li><li>Wu, P. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+methods+to+assess+cell+mechanical+properties.">A comparison of methods to assess cell mechanical properties.</a> Nature Methods. 15 (7), 491-498 (2018).</li><li>Rigato, A., Rico, F., Eghiaian, F., Piel, M., Scheuring, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+Force+Microscopy+Mechanical+Mapping+of+Micropatterned+Cells+Shows+Adhesion+Geometry-Dependent+Mechanical+Response+on+Local+and+Global+Scales.">Atomic Force Microscopy Mechanical Mapping of Micropatterned Cells Shows Adhesion Geometry-Dependent Mechanical Response on Local and Global Scales.</a> ACS Nano. 9 (6), 5846-5856 (2015).</li><li>Favre, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parallel+AFM+imaging+and+force+spectroscopy+using+two-dimensional+probe+arrays+for+applications+in+cell+biology.">Parallel AFM imaging and force spectroscopy using two-dimensional probe arrays for applications in cell biology.</a> Journal of Molecular Recognition. 24 (3), 446-452 (2011).</li><li>Dujardin, A., Wolf, P. D., Lafont, F., Dupres, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+multi-sample+acquisition+and+analysis+using+atomic+force+microscopy+for+biomedical+applications.">Automated multi-sample acquisition and analysis using atomic force microscopy for biomedical applications.</a> PLOS ONE. 14 (3), 0213853 (2019).</li><li>Formosa, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+living+cell+arrays+for+atomic+force+microscopy+studies.">Generation of living cell arrays for atomic force microscopy studies.</a> Nature Protocols. 10 (1), 199-204 (2015).</li><li>Proa-Coronado, S., S&#233;verac, C., Martinez-Rivas, A., Dague, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+the+paradigm+of+nanomechanical+measurements+on+cells+using+AFM:+an+automated+methodology+to+rapidly+analyse+thousands+of+cells.">Beyond the paradigm of nanomechanical measurements on cells using AFM: an automated methodology to rapidly analyse thousands of cells.</a> Nanoscale Horizons. , (2019).</li><li>Foncy, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+polyurethane+and+epoxy+resist+master+mold+for+nanoscale+soft+lithography.">Comparison of polyurethane and epoxy resist master mold for nanoscale soft lithography.</a> Microelectronic Engineering. 110, 183-187 (2013).</li><li>Unsay, J. D., Cosentino, K., Garc&#237;a-S&#225;ez, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+Force+Microscopy+Imaging+and+Force+Spectroscopy+of+Supported+Lipid+Bilayers.">Atomic Force Microscopy Imaging and Force Spectroscopy of Supported Lipid Bilayers.</a> Journal of Visualized Experiments. (101), e52867 (2015).</li><li>Schiavone, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+combined+chemical+and+enzymatic+method+to+determine+quantitatively+the+polysaccharide+components+in+the+cell+wall+of+yeasts.">A combined chemical and enzymatic method to determine quantitatively the polysaccharide components in the cell wall of yeasts.</a> FEMS Yeast Research. 14 (6), 933-947 (2014).</li><li>Formosa, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoscale+Effects+of+Caspofungin+against+Two+Yeast+Species,+Saccharomyces+cerevisiae+and+Candida+albicans.">Nanoscale Effects of Caspofungin against Two Yeast Species, Saccharomyces cerevisiae and Candida albicans.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 57 (8), 3498-3506 (2013).</li><li>El-Kirat-Chatel, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoscale+analysis+of+caspofungin-induced+cell+surface+remodelling+in+Candida+albicans.">Nanoscale analysis of caspofungin-induced cell surface remodelling in Candida albicans.</a> Nanoscale. 5 (3), 1105-1115 (2013).</li><li>Peric, O., Hannebelle, M., Adams, J. D., Fantner, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+bacterial+traps+for+simultaneous+fluorescence+and+atomic+force+microscopy.">Microfluidic bacterial traps for simultaneous fluorescence and atomic force microscopy.</a> Nano Research. 10 (11), 3896-3908 (2017).</li></ol>

والتحسن الرئيسي الذي توفره هذه المنهجية هو زيادة كبيرة في عدد الخلايا المقاسة في فترة زمنية محددة. النظير هو تخفيض عدد النقاط التي تقاس لكل خلية. وهذا يعني أن هذه الطريقة ليست مصممة لتقديم تحليل مفصل لخلية واحدة. تنطبق الطريقة فقط على الخلايا التي يمكن أن تتلاءم مع آبار ختم PDMS. الطابع هو تن?...

يوفر هذا العمل منهجية لإجراء قياسات القوة التلقائية على مئات الخلايا الحية باستخدام مجهر القوة الذرية (AFM). كما يوفر طريقة لشل حركة الميكروبات على طابع PDMS المجهري المتوافق مع تجارب AFM التي أجريت في بيئة سائلة.
Bio-AFM هي تقنية متخصصة للغاية تم تصميمها للتطبيقات في علم الأحياء ثم تستخدم لدراسة الخلايا الحية. يتطلب مهندسا مدربا يمكنه تحليل خلية واحدة في ذلك الوقت. في هذه الظروف، يكون عدد الخلايا المختلفة التي يمكن تحليلها صغيرا نوعا ما، نموذجيا من 5 إلى 10 خلايا في 4-5 ساعات. ومع ذلك، فإن كمية قياسات القوة المسجلة على خلية واحدة عادة ما تكون عالية جدا ويمكن أن تصل بسهولة إلى 1000. وبالتالي ، فإن النموذج الحالي لقياسات قوة AFM على الخلايا الحية هو تسجيل مئات منحنيات القوة (FCs) ولكن على عدد محدود من الخلايا.
ومن الناحية الإحصائية، فإن هذا النهج مشكوك فيه ويثير مسألة تمثيل العينة. في الواقع، من الصعب، على سبيل المثال، تقييم عدم التجانس بين مجموعة الخلايا من خلال قياس عدد قليل من الخلايا فقط، حتى لو تم تسجيل مئات القياسات على هذه الخلايا القليلة. ومع ذلك ، على أساس هذا النموذج الذي تم إحراز تقدم كبير في الفيزياء الحيوية وعلم الأحياء المجهرية والطب النانوي1و2و3. في الواقع ، قدم تحليل نانومتر على نطاق خلايا واحدة معلومات جديدة عن الميكانيكا النانوية الخلوية ، على تنظيم البروتينات عبر الميمبران ، أو آلية عمل الأدوية المضادة للميكروبات أو مضادات الميكروبات4،5،6،7. ولكن في الآونة الأخيرة، ظهرت العديد من الاختبارات الميكانيكية الحيوية عالية الإنتاجية التي أجريت على الخلايا8،مما يدل على اهتمام المجتمع العلمي في تغيير هذا النموذج والوصول إلى عدم التجانس السكاني الخلية. تعتمد جميع هذه الاختبارات على أنظمة microfluidic لتشوه الخلايا وقياس تشوهها بصريا تحت الضغط للحصول على مقياس غير مباشر لمرونتها السطحية الإجمالية8. ومع ذلك ، فإن مشكلة مهمة مع هذه الأساليب هي أنها أحادية البارامترية: يمكن فحص مرونة الخلية فقط. وعلاوة على ذلك، فإنها لا تسمح بقياس المعلمات الميكانيكية للخلايا الملتصقة، والتي يمكن أن تحد من دراسات خلايا الثدييات غير الدورانية أو الأغشية الحيوية على سبيل المثال.
وقد تم تطوير النهج التي تنطوي على AFM من قبل فرق S. Scheuring9 و M. Favre10. Scheuring وآخرون الخلايا المشلولة على أنماط فيبروكتين9, إجبار الخلايا الفردية على اتخاذ شكل نمط9. ثم قام هذا الفريق بتعيين الخصائص الميكانيكية لعدد قليل من الخلايا لتحديد متوسط البيانات ، ممثل 14 إلى 18 خلية. ويهدف التطوير الذي قام به Farve وآخرون إلى مضاعفة القياسات من خلال التوازي مع AFM cantilevers10. على حد علمنا، هذا العمل في الاتجاه المتعدد لم يؤد إلى قياسات على الخلايا الحية.
يقدم النهج المثير للاهتمام الذي اقترحه فريق دوجاردين AFM آليا قادرا على تحديد الخلايا وتصويرها في الجزء السفلي من الآبار المصنوعة خصيصا. على الرغم من أن هذه الطريقة لا تسمح لتحليل عدد كبير من الخلايا، فإنه يسمح للاختبار التلقائي لظروف مختلفة في كل بئر11.
هدفنا في هذا العمل هو أكثر طموحا لأننا أردنا قياس ما لا يقل عن 1000 خلية للوصول ليس إلى خلية متوسطة ، ولكن ، على العكس من ذلك ، عدم التجانس بين الخلايا. تستند الاستراتيجية التي وضعناها هنا للوصول إلى عدم تجانس سكان الخلايا باستخدام AFM إلى تحليل مئات الخلايا التي يتم تسجيل عدد محدود من منحنيات القوة عليها. وبالمقارنة مع النهج "التقليدي" المتمثل في تسجيل عدد كبير من منحنيات القوة على عدد محدود من الخلايا، ينبغي اعتبار هذا النهج مكملا لأنه لا يقدم نفس المعلومات. في الواقع ، في حين أن الطريقة النموذجية تسمح للمرء بالتحقيق في عدم التجانس سطح الخلية الفردية ، وذلك باستخدام نهجنا ، ونحن قادرون على الوصول إلى عدم التجانس مجموع سكان الخلية. لتحقيق هذا الهدف، قمنا بدمج طريقة تعمل مباشرة على شل حركة الميكروبات (هنا أنواع الخميرة المبيضات البيض)في آبار الطابع المجهريPDMS 12، وتطور برنامجا أصليا لنقل طرف AFM ، تلقائيا ، من الخلية إلى الخلية13 وقياس الخصائص الميكانيكية لكل خلية.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>AFM cantilever</td>
			<td>Bruker AFM probes</td>
			<td>MLCT</td>
			<td>The cantilevers used were the labeled &#8220;C&#8221; with resonant frequency of 7 to 10 kHz and k: 0.01 N/m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AFM data analysis</td>
			<td>JPK-Bruker</td>
			<td>JPK Data processing version minimum 5.1.8</td>
			<td>Can be downloaded from a JPK-Bruker user acount</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AFM Petri dishes</td>
			<td>WPI</td>
			<td>FluoroDish FD35-100</td>
			<td>The heater was used to monitor the temperature changes during the experiment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Atomic force Microscope (AFM)</td>
			<td>JPK-Bruker</td>
			<td>Nanowizard II or III</td>
			<td>the AFM should be mounted on an inverted optical microscope with a motorized stage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caspofungin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SML0425-5MG</td>
			<td>Caspofungin was used with a concentration of 4 MIC (Minimum Inhibitor Concentration)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Code editor</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td>Visual Studio Code version 1.40.1</td>
			<td>https://code.visualstudio.com/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryobeads</td>
			<td>IFU</td>
			<td>CB12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dessicator/Degassing chamber</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>15594635</td>
			<td>The equipment is used to degassing the PDMS stamps for about 50 minutes any dessicator coupled with a vaccum pump will do.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish heater</td>
			<td>JPK-Bruker</td>
			<td>PetriDishHeater</td>
			<td>This is an add-on to the JPK/Bruker AFM. The heater was used to monitor the temperature changes during the experiment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate buffer pH 5.2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7899</td>
			<td>The solution contains 18 mM sodium acetate, 1 mM CaCl2, and 1 mM MnCl2. Adjust the pH with glacial acetic acid. The solution can be stored at 4 &#176;C for 2 months</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Statistical analysis language</td>
			<td>https://www.r-project.org</td>
			<td>R version 3.6.1</td>
			<td>R is a language and environment for statistical computing and graphics. It is a GNU project which is similar to the S language and environment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Statistical analysis software</td>
			<td>https://rstudio.com</td>
			<td>R studio version 1.1.463</td>
			<td>collaboration between the R Foundation, RStudio, Microsoft, TIBCO, Google, Oracle, HP and others. RStudio and Shiny are affiliated projects of the Foundation for Open Access Statistics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard 184</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>761028</td>
			<td>Polydimethylsiloxane (PDMS) and curing agent in one set</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Peptone D Broth</td>
			<td>Difco</td>
			<td>242820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>YPD Agar</td>
			<td>Difco</td>
			<td>DF0427-17-6</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

automation of bio-atomic force microscope measurements on hundreds of c. albicans cells

تهدف الطريقة المعروضة في هذه الورقة إلى أتمتة تجارب Bio-AFM وتسجيل منحنيات القوة. باستخدام هذه الطريقة، فمن الممكن لتسجيل المنحنيات القوات على 1000 خلية في 4 ساعات تلقائيا. للحفاظ على وقت تحليل 4 ساعات، يتم تقليل عدد منحنيات القوة لكل خلية إلى 9 أو 16. الأسلوب يجمع بين برنامج Jython القائم على واستراتيجية لتجميع الخلايا على أنماط محددة. البرنامج، الذي تم تنفيذه على بيو-AFM التجارية، يمكن أن مركز تلميح على الخلية الأولى من الصفيف ومن ثم التحرك، تلقائيا، من خلية إلى خلية أثناء تسجيل منحنيات القوة على كل خلية. باستخدام هذه المنهجية ، من الممكن الوصول إلى المعلمات الفيزيائية الحيوية للخلايا مثل صلابتها ، وخصائصها اللاصقة ، وما إلى ذلك. مع التشغيل الآلي وعدد كبير من الخلايا تحليلها، يمكن للمرء الوصول إلى سلوك السكان الخلية. وهذا إنجاز كبير في مجال بيو-أ إف إم حيث تم تسجيل البيانات، حتى الآن، على بضع عشرات فقط من الخلايا.

استخدمنا البروتوكول الموصوف لتحليل تأثير البراميلوفونجين على الخصائص الفيزيائية الحيوية لمسبب الأمراض البشري الانتهازي C. albicans في شكل الخميرة. كاسبوفونجين هو جزيء مضاد للفطريات فرصة أخيرة تستخدم عندما الأدوية الأخرى غير فعالة بسبب آليات المقاومة الخلايا تتطور نحو مضادات الفطريات....

Watch this Scientific Journal Video about Automation of Bio-Atomic Force Microscope Measurements on Hundreds of C. albicans Cells at JoVE.com

Automation of Bio-Atomic Force Microscope Measurements on Hundreds of C. albicans Cells

يهدف هذا البروتوكول إلى أتمتة قياسات AFM على مئات الخلايا الميكروبية. أولا، يتم شل حركة الميكروبات في الهياكل المجهرية لختم PDMS ومن ثم يتم إجراء قياسات التحليل الطيفي بالقوة تلقائيا على مئات الخلايا المشلودة.

أتمتة قياسات المجهر القوة الحيوية الذرية على مئات من خلايا ألبيكانس C.

The method presented in this paper aims to automate Bio-AFM experiments and the recording of force curves. Using this method, it is possible to record ...

أتمتة المجهر القوة الذرية هو الابتكار الرئيسي في تطور التكنولوجيا نحو التطبيقات الطبية الحيوية. كما أنه يفتح المجال للتحقيق في الخصائص الميكانيكية الحيوية لتجمعات الخلايا. طريقتنا تجعل من الممكن تسجيل قياسات AFM ل1000 خلية في أربع ساعات ، مقارنة بالطرق المعتادة ، والتي تستغرق أربع ساعات لقياس 10 خلايا ، وهذا هو في الحقيقة مكسب كبير من الوقت.إذا كانت الأتمتة شرطا أساسيا لجلب هذه التكنولوجيا إلى مختبرات المستشفيات ، فإن بروتوكول إثبات المفهوم هذا يشير إلى إمكانية استخدامها في تطوير استراتيجيات تشخيص طبية محددة. يستخدم هذا البروتوكول جذع PDMS متعدد الاستخدامات يمكن ملؤه بمختلف الميكروبات مما يسمح باستكشاف أنظمة مختلفة. لإعداد ختم PDMS، مزيج 55 غراما من PDMS حل ما قبل البوليمر في نسبة كتلة 10 إلى واحد في PDMs، oligomers، وعامل علاج وdgas الحل الناتج تحت فراغ في مرة واحدة 10 إلى واحد إلى واحد سلبي مرات 10 إلى القضبان السلبية اثنين لمدة خمس إلى 10 دقائق.عندما تمت إزالة جميع فقاعات الفخاخ ، صب 20 غراما من محلول degassed على قالب السيليكون الرئيسي إلى سمك 2-3 ملليمترات وديغا مرة أخرى. عندما تتم إزالة جميع الفقاعات ، قم بإعادة صياغة PDMS عند 80 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة واستخدم مشرطا لقطع الطابع الهيكلي الدقيق PDMS بالتوازي مع صفائف البنية الدقيقة المرئية. ثم قشر الطابع من قالب السيليكون الرئيسي ووضع موقع هيكل الطابع الجزئي حتى على شريحة زجاجية مع الهياكل الصغيرة الانحياز مع جانب الشريحة.لإعداد الخلايا للجهاز، والطرد المركزي 600 ميكرولتر من تعليق الخلية من الفائدة وإضافة 200 ميكرولتر من supernatant على الطابع. ديغا العملاق تحت فراغ لمدة 40 دقيقة. عندما تتم إزالة جميع الفقاعات ، استبدل الناموست من سطح PDMS ب 200 ميكرولتر من محلول الخلية الذي أعيد إنفاقه لاحتضانه لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.لتحميل الخلايا في الهياكل الدقيقة للطابع، استخدم شريحة زجاجية تم الاحتفاظ بها بزاوية 30 إلى 50 درجة لنشر الخلايا عبر الطابع في كلا الاتجاهين، عدة مرات حسب الضرورة. عندما يتم تحقيق معدل تعبئة عالية من microstructures، استخدم ماصة لإزالة تعليق الخلية وغسل ثلاث مرات مع ملليلتر واحد من العازلة خلات لكل غسل لإزالة أي خلايا غير منقوبة. بعد الغسيل الأخير، استخدم تدفق النيتروجين لتجفيف الجزء الخلفي من العينة ووضع الطابع في طبق بيتري.ثم أضف اثنين من ملليلتر من العازلة خلات الطازجة إلى الطبق. بالنسبة للفحص المجهري للقوة الذرية للخلايا ، ضع الطبق على مرحلة مجهر القوة الذرية ومركز المسرح عند الصفر إلى الصفر. عندما تركزت المرحلة، نقل الطبق إلى حامل طبق بيتري المجهر ومحاذاة حافة الطابع بحيث يكون عموديا على المحور ص من حامل طبق بيتري.ثم ضع قوة المجهر الذري على خشبة المسرح ، مع الحرص على أن يتم تمديد محركات السائر بما فيه الكفاية لتجنب تحطم الطرف على الطابع. للتصوير، استخدم مقابض المجهر لمركز طرف مجهر القوة الذرية فوق الزاوية اليسرى من آبار العدادات الصغيرة 4.5 في 4.5 متر مربع وحدد وضع رسم خرائط القوة في برنامج المجهر. لتعيين خريطة قوة 64 في 64 على مساحة 100 في 100 ميكرومتر ، تعيين نقطة المجموعة النسبية إلى ثلاثة إلى خمسة نانو نيوتن ، وطول Z إلى أربعة ميكرومترات ، وحركة Z إلى مدة ثابتة ، ووقت التمديد إلى 0.01 ثانية ، وتأخير التمديد إلى الصفر ، وتأخير التراجع إلى الصفر ، ووضع التأخير للقوة الثابتة ، معدل العينة إلى 2048 Hertz.قم بإلغاء تحديد حلقة Z المغلقة وتحقق من الصورة المربعة. تعيين الوصول السريع إلى 100 ميكرومتر، المحور البطيء إلى 100 ميكرومتر، X الإزاحة إلى صفر ميكرومتر، إزاحة Y إلى صفر ميكرومتر، زاوية الشبكة إلى صفر درجة، بكسل إلى 64 في 64، ونسبة بكسل إلى واحد إلى واحد. فتح المقبل برنامج التشغيل الآلي.في الإطار المنبثق، حدد المسار نحو ملف البرنامج النصي. أدخل تنسيق W1 في سطر المتغير P1 239 من المقطع مربع المدخلات من البرنامج النصي gyfon و W2 تنسيق القيمة في P2 متغير سطر 241. سم قيمة الملعب إلى خط متغير الملعب 245 من السيناريو وإدخال البعد جيدا، والتي يمكن تحديدها من تصميم أنماط البئر في خط متغير W-S 248.اكتب المسار إلى دليل الحفظ في السطر 251 لحفظ البيانات في المكان المطلوب وتعيين إجمالي خط متغير المنطقة 254 إلى الرغبة في نهاية متعددة من 100 ميكرومتر. ثم تعيين قوة منحنيات مصفوفة الصف والعمود المسجلة في بئر في عدد بمسح متغير خط 257 وانقر فوق تشغيل لبدء البرنامج. لتحليل البيانات، استخدم برنامج التعليمات البرمجية استوديو الفيديو لفتح البرنامج النصي بيثون وتنفيذ نسخ الملفات بيثون البرنامج النصي لتنظيم ملفات منحنى القوة في مجلد واحد.إدخال المسار إلى المجلد العام حيث سيتم تخزين البيانات. لتحليل منحنيات القوة ، وفتح القوة الذرية المجهر مصنع البيانات معالجة البرمجيات. في قائمة الملفات، حدد مجموعة من منحنيات التحليل الطيفي.حدد التالي ملف وتحميل العملية، وحدد عملية صلابة. حدد الخطوة الأخيرة من العملية وانقر فوق الاحتفاظ وتطبيقها على الجميع بحيث تتلقى جميع منحنيات القوة نفس المعاملة. لفتح البرنامج النصي R، قم بتحميل الملفات التي تحتوي على المعلومات المستخرجة باستخدام برنامج معالجة البيانات في برنامج استوديو R.في إطار البيئة، انقر فوق استيراد مجموعة البيانات ومن قارئ النص في الإطار المنبثق، انقر فوق استعراض لتحديد موقع الملف TSV نقطة. بمجرد تحميل الملف حدد منطقة تشغيل التعليمات البرمجية وتشغيل كافة لتشغيل كافة التعليمات البرمجية. هنا، تظهر مخططات نموذجية تم الحصول عليها باستخدام البروتوكول كما هو موضح.في هذا التحليل، تم تسجيل إعادة تقسيم صلابة على 957 الخلايا الأصلية، بينما في هذا التحليل، تم قياس صلابة 574 خلية معالجة كاسبوفينجين. اعلم أن استخدام مئات الخلايا يسمح بتوزيع ثنائي الوسائط للقيم التي يجب ملاحظتها. وفي العينات الأصغر حجما، يلاحظ عادة توزيع واحد ويمكن أن يؤدي إلى عدم رصد عدم التجانس السكاني.مقارنة بين الشرطين يسلط الضوء على آثار كاسبوفينجين على الحد من تصلب الخلية. وكشفت مقارنة ANOVA من الخلايا الأصلية والعلاجية، والظروف اثنين تظهر صلابة عالية، مختلفة بشكل كبير. تم الوصول إلى هذه القيمة بسبب العدد الكبير من الخلايا التي تم تحليلها ، مما يوفر ثقة أكبر في النتائج التي تم الحصول عليها.إضافة supernatant إلى ختم PDMS قبل مسح الخلايا مرارا وتكرارا في الآبار حتى ختم كامل، أمر بالغ الأهمية لنجاح التحليل. في هذا الدليل على المفهوم ، تم تحليل خلايا المبيضات البيكان ولكن يمكن تطبيق البروتوكول على أي مجموعة من الخلايا النمطية أو الجزيئات أو المواد.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Automation of Bio-Atomic Force Microscope Measurements on Hundreds of C. albicans Cells

Multiplexed Single-molecule Force Proteolysis Measurements Using Magnetic Tweezers

المضاعفة واحدة جزيء القياسات التحلل البروتيني باستخدام الملقط قوة مغناطيسية

The  generation and detection of mechanical forces is a ubiquitous aspect of cell physiology,  with direct relevance to cancer metastasis1, atherogenesis2 ...

Candida albicans Biofilm Chip (CaBChip) for High-throughput Antifungal Drug Screening

Candida albicans Biofilm Chip CaBChip for High-throughput Antifungal Drug Screening

المبيضات البيض بيوفيلم رقاقة (كاليفورنيا BChip) لالفرز الفائق الإنتاجية مضاد للمخدرات

Candida  albicans remains the main etiological agent of candidiasis, which  currently represents the fourth most common nosocomial bloodstream infection ...

Flexural Rigidity Measurements of Biopolymers Using Gliding Assays

قياسات جمود العاطفة من البوليمرات الحيوية باستخدام فحوصات الانزلاق

Microtubules are cytoskeletal polymers which  play a role in cell division, cell mechanics, and intracellular transport. Each of these functions requires ...

Biosensor for Detection of Antibiotic Resistant Staphylococcus Bacteria

جهاز الاستشعار البيولوجي للكشف عن المضادات الحيوية البكتيريا العنقودية الذهبية المقاومة لل

A structurally transformed lytic bacteriophage having a broad host range of Staphylococcus aureus strains and a penicillin-binding protein (PBP 2a) ...

Measuring the Mechanical Properties of Living Cells Using Atomic Force Microscopy

قياس الخواص الميكانيكية للخلايا الحية باستخدام المجهر القوة الذرية

Mechanical  properties of cells and extracellular matrix (ECM) play important roles in many  biological processes including stem cell differentiation, ...

Cell Patterning on Photolithographically Defined 
Parylene-C: SiO2 Substrates

Cell Patterning on Photolithographically Defined 
Parylene-C: SiO2 Substrates

الزخرفة الخلية على Photolithographically معرفة Parylene-C: شافي<sub&gt; 2</sub&gt; ركائز

Cell patterning platforms support broad research goals, such as construction of predefined in vitro neuronal networks and the exploration of certain ...

From Fast Fluorescence Imaging to Molecular Diffusion Law on Live Cell Membranes in a Commercial Microscope

من السريع إلى التصوير الإسفار الجزيئية قانون إنتشار على أغشية الخلايا الحية في المجهر التجاري

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the ...

Atomic Force Microscopy Imaging and Force Spectroscopy of Supported Lipid Bilayers

قوة الذرية المجهر التصوير وقوة التحليل الطيفي لدعم الدهن طبقات ثنائية

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient ...

Power Input Measurements in Stirred Bioreactors at Laboratory Scale

قياسات الطاقة الإدخال في المفاعلات الحيوية المقلبة في المختبرات

The power input in stirred bioreactors is an important scaling-up parameter and can be measured through the torque that acts on the impeller shaft during ...

Measurement of Force-Sensitive Protein Dynamics in Living Cells Using a Combination of Fluorescent Techniques

قياس ديناميات حساسة لقوة البروتين في الخلايا الحية باستخدام مزيج من التقنيات الفلورسنت

Cells sense and respond to physical cues in their environment by converting mechanical stimuli into biochemically-detectable signals in a process called ...