Name: automation of bio-atomic force microscope measurements on hundreds of c. albicans cells
Uploaded: 2021-04-02T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Automation of Bio-Atomic Force Microscope Measurements on Hundreds of C. albicans Cells at JoVE.com

Vi ønsker at anerkende FONCYCYT fra CONACYT (Mexico), Frankrigs udenrigsministerium og Université Paris 13, selv om den finansielle støtte fra det internationale samarbejde ecos-nord-projekt ved navn Nano-palpation til diagnose, No. 263337 (Mexico) og MI5P02 (Frankrig). AMR vil gerne takke den finansielle støtte fra SIP-IPN gennem projektet Nr. 20195489. SPC understøttes af et ph.d.-stipendium fra CONACYT (nr. 288029) og IPN gennem cotutelle-aftalen om at opnå dobbelt ph.d.-certifikat (IPN-UPS). ED og CFD er forskere ved Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS).

1. Mikrobiel cellekultur
<ol><li>Genoplive celler fra en glycerol bestand. BEMÆRK: C. Albicans opbevares ved -80 °C i glycerollagre på marmor.<ol>
<li>Vælg en marmor i -80 °C lager og gnid det på gær peptone dextrose (YPD) agar. Cellerne dyrkes i 2 dage ved 30 °C, før flydende dyrkning.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Forbered flydende kulturer.<ol>
<li>Fyld et kulturrør med 5 mL steril YPD bouillon og tilsæt en enkelt koloni af C. albicans celler, dyrket på YPD agar plade.</li>
		<li>Kulturen d...

<ol>
	<li>Cross, S. E., Jin, Y. S., Rao, J., Gimzewski, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanomechanical+analysis+of+cells+from+cancer+patients.">Nanomechanical analysis of cells from cancer patients.</a> Nature Nanotechnology. 2 (12), 780-783 (2007).</li><li>Dague, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+force+and+electron+microscopic-based+study+of+sarcolemmal+surface+of+living+cardiomyocytes+unveils+unexpected+mitochondrial+shift+in+heart+failure.">Atomic force and electron microscopic-based study of sarcolemmal surface of living cardiomyocytes unveils unexpected mitochondrial shift in heart failure.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 74, 162-172 (2014).</li><li>Muller, D. J., Helenius, J., Alsteens, D., Dufrene, Y. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force+probing+surfaces+of+living+cells+to+molecular+resolution.">Force probing surfaces of living cells to molecular resolution.</a> Nature Chemical Biology. 5 (6), 383-390 (2009).</li><li>Dague, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+Force+Microscopy+to+Explore+Electroporation+Effects+on+Cells.">Atomic Force Microscopy to Explore Electroporation Effects on Cells.</a> Handbook of Electroporation. , 1-13 (2016).</li><li>Puntheeranurak, T., Neundlinger, I., Kinne, R. K. H., Hinterdorfer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+recognition+force+spectroscopy+of+transmembrane+transporters+on+living+cells.">Single-molecule recognition force spectroscopy of transmembrane transporters on living cells.</a> Nature Protocols. 6 (9), 1443-1452 (2011).</li><li>Formosa, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoscale+analysis+of+the+effects+of+antibiotics+and+CX1+on+a+Pseudomonas+aeruginosa+multidrug-resistant+strain.">Nanoscale analysis of the effects of antibiotics and CX1 on a Pseudomonas aeruginosa multidrug-resistant strain.</a> Scientific Reports. 2, (2012).</li><li>Pillet, F., Chopinet, L., Formosa, C., Dague, &. #. 2. 0. 1. ;. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+Force+Microscopy+and+pharmacology:+From+microbiology+to+cancerology.">Atomic Force Microscopy and pharmacology: From microbiology to cancerology.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - General Subjects. 1840 (3), 1028-1050 (2014).</li><li>Wu, P. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+methods+to+assess+cell+mechanical+properties.">A comparison of methods to assess cell mechanical properties.</a> Nature Methods. 15 (7), 491-498 (2018).</li><li>Rigato, A., Rico, F., Eghiaian, F., Piel, M., Scheuring, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+Force+Microscopy+Mechanical+Mapping+of+Micropatterned+Cells+Shows+Adhesion+Geometry-Dependent+Mechanical+Response+on+Local+and+Global+Scales.">Atomic Force Microscopy Mechanical Mapping of Micropatterned Cells Shows Adhesion Geometry-Dependent Mechanical Response on Local and Global Scales.</a> ACS Nano. 9 (6), 5846-5856 (2015).</li><li>Favre, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parallel+AFM+imaging+and+force+spectroscopy+using+two-dimensional+probe+arrays+for+applications+in+cell+biology.">Parallel AFM imaging and force spectroscopy using two-dimensional probe arrays for applications in cell biology.</a> Journal of Molecular Recognition. 24 (3), 446-452 (2011).</li><li>Dujardin, A., Wolf, P. D., Lafont, F., Dupres, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+multi-sample+acquisition+and+analysis+using+atomic+force+microscopy+for+biomedical+applications.">Automated multi-sample acquisition and analysis using atomic force microscopy for biomedical applications.</a> PLOS ONE. 14 (3), 0213853 (2019).</li><li>Formosa, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+living+cell+arrays+for+atomic+force+microscopy+studies.">Generation of living cell arrays for atomic force microscopy studies.</a> Nature Protocols. 10 (1), 199-204 (2015).</li><li>Proa-Coronado, S., S&#233;verac, C., Martinez-Rivas, A., Dague, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+the+paradigm+of+nanomechanical+measurements+on+cells+using+AFM:+an+automated+methodology+to+rapidly+analyse+thousands+of+cells.">Beyond the paradigm of nanomechanical measurements on cells using AFM: an automated methodology to rapidly analyse thousands of cells.</a> Nanoscale Horizons. , (2019).</li><li>Foncy, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+polyurethane+and+epoxy+resist+master+mold+for+nanoscale+soft+lithography.">Comparison of polyurethane and epoxy resist master mold for nanoscale soft lithography.</a> Microelectronic Engineering. 110, 183-187 (2013).</li><li>Unsay, J. D., Cosentino, K., Garc&#237;a-S&#225;ez, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+Force+Microscopy+Imaging+and+Force+Spectroscopy+of+Supported+Lipid+Bilayers.">Atomic Force Microscopy Imaging and Force Spectroscopy of Supported Lipid Bilayers.</a> Journal of Visualized Experiments. (101), e52867 (2015).</li><li>Schiavone, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+combined+chemical+and+enzymatic+method+to+determine+quantitatively+the+polysaccharide+components+in+the+cell+wall+of+yeasts.">A combined chemical and enzymatic method to determine quantitatively the polysaccharide components in the cell wall of yeasts.</a> FEMS Yeast Research. 14 (6), 933-947 (2014).</li><li>Formosa, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoscale+Effects+of+Caspofungin+against+Two+Yeast+Species,+Saccharomyces+cerevisiae+and+Candida+albicans.">Nanoscale Effects of Caspofungin against Two Yeast Species, Saccharomyces cerevisiae and Candida albicans.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 57 (8), 3498-3506 (2013).</li><li>El-Kirat-Chatel, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoscale+analysis+of+caspofungin-induced+cell+surface+remodelling+in+Candida+albicans.">Nanoscale analysis of caspofungin-induced cell surface remodelling in Candida albicans.</a> Nanoscale. 5 (3), 1105-1115 (2013).</li><li>Peric, O., Hannebelle, M., Adams, J. D., Fantner, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+bacterial+traps+for+simultaneous+fluorescence+and+atomic+force+microscopy.">Microfluidic bacterial traps for simultaneous fluorescence and atomic force microscopy.</a> Nano Research. 10 (11), 3896-3908 (2017).</li></ol>

Den største forbedring i denne metode er en betydelig stigning i antallet af målte celler på et bestemt tidsrum. Modstykket er en reduktion af antallet af målte point pr. celle. Det betyder, at denne metode ikke er designet til at give en detaljeret analyse af en enkelt celle. Metoden gælder kun for celler, der kan være i PDMS-stemplets brønde. Stemplet er ret alsidigt, mens det indeholder brønde på 1,5 x 1,5 μm2 op til 6 x 6 μm2. Stadig er det umuligt at immobilisere bacillus eller meget...

Dette arbejde giver en metode til at udføre automatiske kraftmålinger på hundredvis af levende celler ved hjælp af et atomkraftmikroskop (AFM). Det giver også en metode til at immobilisere mikrober på et PDMS mikrostruktureret stempel, der er kompatibelt med AFM-eksperimenter udført i et flydende miljø.
Bio-AFM er en højt specialiseret teknologi udtænkt til applikationer i biologi og derefter bruges til at studere levende celler. Det kræver en uddannet ingeniør, der kan analysere en celle på det tidspunkt. Under disse forhold er antallet af forskellige celler, der kan analyseres, ret lille, typisk 5 til 10 celler i 4-5 timer. Mængden af kraftmålinger, der registreres på en enkelt celle, er dog normalt meget høj og kan nemt nå op på 1000. Således er det nuværende paradigme for AFM kraft målinger på levende celler er at registrere hundredvis af kraft kurver (FCs), men på et begrænset antal celler.
Statistisk set er denne fremgangsmåde tvivlsom og rejser spørgsmålet om stikprøvens repræsentativitet. Det er faktisk vanskeligt at vurdere en cellepopulations heterogenitet ved kun at måle nogle få celler, selv om der registreres hundredvis af målinger på disse få celler. Det er dog på baggrund af dette paradigme, at der er gjort store fremskridt inden for biofysik, mikrobiologi og nanomedicin1,2,3. Faktisk nanometeranalyse på skala af enkeltceller har givet nye oplysninger om cellulære nanomekanik, om organiseringen af transmembraneproteiner eller virkningsmekanismen for antimikrobielle eller anticancerlægemidler4,5,6,7. For nylig er der imidlertid opstået flere biomekaniske tests med høj gennemstrømning udført på celler8, der viser det videnskabelige samfunds interesse i at ændre dette paradigme og få adgang til cellepopulationens heterogenitet. Disse test er alle afhængige af mikrofluidiske systemer til at deformere celler og optisk måle deres deformation under stress for at opnå et indirekte mål for deres samlede overfladeelasticitet8. Et vigtigt problem med disse metoder er imidlertid, at de er monoparametriske: kun celleelasticitet kan undersøges. Desuden tillader de ikke måling af de mekaniske parametre for vedhængende celler, hvilket kan være begrænsende for undersøgelser af ikke-cirkulationspatte pattedyrceller eller biofilm for eksempel.
Tilgange, der involverer AFM er blevet udviklet af holdene af S. Scheuring9 og M. Favre10. Scheuring et al. immobiliserede celler på fibronectin mønstre9, tvinger de enkelte celler til at tage form af mønsteret9. Derefter kortlagde dette team de mekaniske egenskaber for nogle få celler for at definere gennemsnitlige data, der er repræsentative for 14 til 18 celler. Farve et al.s udvikling havde til formål at multiplumre målingerne ved at parallelisere AFM cantilevers10. Så vidt vi ved, har dette arbejde i multiplexing retning ikke ført til målinger på levende celler.
En interessant tilgang foreslået af Dujardin's team præsenterer en automatiseret AFM i stand til at identificere celler og billedbehandling dem i bunden af skræddersyede brønde. Selvom denne metode ikke giver mulighed for analyse af en stor population af celler, tillader den automatisk test af forskellige forhold i hverbrønd 11.
Vores mål i dette arbejde er mere ambitiøst, da vi ønskede at måle mindst 1000 celler for at få adgang til ikke en gennemsnitlig celle, men tværtimod heterogeniteten mellem cellerne. Den strategi, vi har udviklet her for at få adgang til cellepopulation heterogenitet ved hjælp af AFM er baseret på analysen af hundredvis af celler, hvor et begrænset antal kraft kurver er registreret. Sammenlignet med den "klassiske" tilgang til registrering af et stort antal kraftkurver på et begrænset antal celler bør denne tilgang betragtes som komplementær, da den ikke giver de samme oplysninger. Faktisk, mens den typiske metode gør det muligt for en at sonde individuelle celle overflade heterogenitet, ved hjælp af vores tilgang, vi er i stand til at få adgang til hele cellepopulation heterogenitet. For at nå dette mål har vi kombineret en metode, der direkte immobiliserer mikrober (her gærarten Candida albicans) i brøndene i et PDMS mikrostruktureret stempel12, og udvikler et originalt program til automatisk at flytte AFM-spidsen fra celle til celle13 og måle de mekaniske egenskaber ved hver celle.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>AFM cantilever</td>
			<td>Bruker AFM probes</td>
			<td>MLCT</td>
			<td>The cantilevers used were the labeled &#8220;C&#8221; with resonant frequency of 7 to 10 kHz and k: 0.01 N/m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AFM data analysis</td>
			<td>JPK-Bruker</td>
			<td>JPK Data processing version minimum 5.1.8</td>
			<td>Can be downloaded from a JPK-Bruker user acount</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AFM Petri dishes</td>
			<td>WPI</td>
			<td>FluoroDish FD35-100</td>
			<td>The heater was used to monitor the temperature changes during the experiment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Atomic force Microscope (AFM)</td>
			<td>JPK-Bruker</td>
			<td>Nanowizard II or III</td>
			<td>the AFM should be mounted on an inverted optical microscope with a motorized stage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caspofungin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SML0425-5MG</td>
			<td>Caspofungin was used with a concentration of 4 MIC (Minimum Inhibitor Concentration)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Code editor</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td>Visual Studio Code version 1.40.1</td>
			<td>https://code.visualstudio.com/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryobeads</td>
			<td>IFU</td>
			<td>CB12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dessicator/Degassing chamber</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>15594635</td>
			<td>The equipment is used to degassing the PDMS stamps for about 50 minutes any dessicator coupled with a vaccum pump will do.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish heater</td>
			<td>JPK-Bruker</td>
			<td>PetriDishHeater</td>
			<td>This is an add-on to the JPK/Bruker AFM. The heater was used to monitor the temperature changes during the experiment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate buffer pH 5.2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7899</td>
			<td>The solution contains 18 mM sodium acetate, 1 mM CaCl2, and 1 mM MnCl2. Adjust the pH with glacial acetic acid. The solution can be stored at 4 &#176;C for 2 months</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Statistical analysis language</td>
			<td>https://www.r-project.org</td>
			<td>R version 3.6.1</td>
			<td>R is a language and environment for statistical computing and graphics. It is a GNU project which is similar to the S language and environment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Statistical analysis software</td>
			<td>https://rstudio.com</td>
			<td>R studio version 1.1.463</td>
			<td>collaboration between the R Foundation, RStudio, Microsoft, TIBCO, Google, Oracle, HP and others. RStudio and Shiny are affiliated projects of the Foundation for Open Access Statistics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard 184</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>761028</td>
			<td>Polydimethylsiloxane (PDMS) and curing agent in one set</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Peptone D Broth</td>
			<td>Difco</td>
			<td>242820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>YPD Agar</td>
			<td>Difco</td>
			<td>DF0427-17-6</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

automation of bio-atomic force microscope measurements on hundreds of c. albicans cells

Den metode, der præsenteres i dette papir har til formål at automatisere Bio-AFM eksperimenter og registrering af kraft kurver. Ved hjælp af denne metode er det muligt at registrere kræfter kurver på 1000 celler i 4 timer automatisk. For at opretholde en 4 timers analysetid reduceres antallet af kraftkurver pr. celle til 9 eller 16. Metoden kombinerer et Jython-baseret program og en strategi for samling af celler på definerede mønstre. Programmet, der gennemføres på en kommerciel Bio-AFM, kan centrere spidsen på den første celle i array og derefter flytte, automatisk, fra celle til celle, mens du optager kraft kurver på hver celle. Ved hjælp af denne metode er det muligt at få adgang til cellernes biofysiske parametre såsom deres stivhed, deres klæbende egenskaber osv. Med automatiseringen og det store antal analyserede celler kan man få adgang til cellepopulationens opførsel. Dette er et gennembrud i Bio-AFM feltet, hvor data hidtil er blevet registreret på kun et par snese celler.

Vi brugte den beskrevne protokol til at analysere effekten af caspofungin på de biofysiske egenskaber af det opportunistiske menneskelige patogen C. albicans i sin gærform. Caspofungin er en sidste chance svampedræbende molekyle, der anvendes, når andre lægemidler er ineffektive på grund af modstandsmekanismerne celler udvikle sig i retning af svampemidler. Dens virkningsmekanisme er baseret på hæmningen af underenheden Fks2 af den komplekse fks1/Fks2, der er ansvarlig for ß glucansyntesen. Da ß glucan...

Watch this Scientific Journal Video about Automation of Bio-Atomic Force Microscope Measurements on Hundreds of C. albicans Cells at JoVE.com

Automation of Bio-Atomic Force Microscope Measurements on Hundreds of C. albicans Cells

Denne protokol har til formål at automatisere AFM målinger på hundredvis af mikrobielle celler. For det første er mikrober immobiliseret i PDMS stempel mikrostrukturer og derefter tvinge spektroskopi målinger udføres automatisk på hundredvis af immobiliserede celler.

Automatisering af Bio-Atomic Force Mikroskop målinger på hundredvis af C. albicans celler

The method presented in this paper aims to automate Bio-AFM experiments and the recording of force curves. Using this method, it is possible to record ...

Automatisering af atomkraftmikroskoper er en vigtig nyskabelse i udviklingen af teknologien til biomedicinske anvendelser. Det åbner også adgang til undersøgelsen af cellepopulationernes biomekaniske egenskaber. Vores metode gør det muligt at registrere AFM-målinger for 1.000 celler på fire timer sammenlignet med de sædvanlige metoder, som tager fire timer at måle 10 celler, dette er virkelig en betydelig gevinst på tid.Hvis automatisering er en forudsætning for at bringe denne teknologi ind på hospitalet labs, dette proof of concept protokol tyder på sit potentiale for brug i udviklingen af specifikke medicinske diagnostiske strategier. Denne protokol bruger en alsidig PDMS-stilk, der kan fyldes med forskellige mikrober, der gør det muligt at udforske forskellige systemer. For at forberede PDMS-stemplet blandes 55 gram PDMS pre-polymer-opløsning ved et 10 til et masseforhold i PPM'er, oligomerer og hærdningsmiddel og afgas den resulterende opløsning under vakuum på en gang 10 til den negative en til en gang 10 til de negative to søjler i fem til 10 minutter.Når alle fælderne bobler er blevet fjernet, hæld 20 gram afgasset opløsning på en silicium master skimmel til en to til tre millimeter tykkelse og degas igen. Når alle boblerne er fjernet, skal du retikulere PDMS ved 80 grader Celsius i en time og bruge en skalpel til at skære PDMS mikrostruktureret stempel parallelt med de synlige mikrostruktur arrays. Skræl derefter stemplet fra silicium master formen og placere stempel mikro struktur site op på et glas dias med mikro strukturer justeret med den side af diaset.For at forberede cellerne til enheden, centrifuge 600 mikroliter af cellen suspension af interesse og tilsæt 200 mikroliter af supernatanten på stemplet. Afgas supernatanten under vakuum i ca. 40 minutter. Når alle boblerne er fjernet, skal supernatanten udskiftes fra PDMS-overfladen med 200 mikroliter af den genanvendelige celleopløsning til en 15 minutters inkubation ved stuetemperatur.For at indlæse cellerne i frimærkets mikrostrukturer skal du bruge en glasrutsjebane, der holdes i en 30 til 50 graders vinkel, til at sprede cellerne over stemplet i begge retninger, flere gange efter behov. Når der er opnået en høj påfyldningshastighed af mikrostrukturerne, skal du bruge en pipette til at fjerne celleaffjedringen og vaske de tre gange med en milliliter acetatbuffer pr. vask for at fjerne uspændte celler. Efter den sidste vask skal du bruge nitrogenstrømmen til at tørre bagsiden af prøven og placere stemplet i en petriskål.Derefter tilsættes to milliliter frisk acetat buffer til skålen. For atomare kraft mikroskopi af cellerne, placere parabol på atomare kraft mikroskop fase og centrere scenen på nul til nul. Når scenen er centreret, skal du flytte skålen ind i mikroskopet Petri parabol indehaveren og justere kanten af stemplet, så det er vinkelret på y-aksen af Petri parabol indehaveren.Placer derefter atommikroskopkrafthovedet på scenen, og pas på, at steppermotorerne er tilstrækkeligt udvidede til at undgå, at spidsen går ned på stemplet. Til billeddannelse skal du bruge mikroskopknapperne til at centrere atomkraftmikroskopspidsen over venstre hjørne af de 4,5 gange 4,5 kvadrerede mikromålerbrønde og vælge kraftkortlægningstilstanden i mikroskopsoftwaren. Hvis du vil indstille et 64 gange 64 kraftkort over et 100 gange 100 mikrometer område, skal du indstille det relative sætpunkt til tre til fem nano Newtons, Z-længden til fire mikrometer, Z-bevægelsen til konstant varighed, den forlængede tid til 0,01 sekunder, forlængelsesforsinkelsen til nul, tilbagetrækningsforsinkelsen til nul, forsinkelsestilstanden til konstant kraft , prøveprocenten til 2048 Hertz.Fjern markeringen af Z lukket løkke, og kontroller kvadratisk billede. Indstil den hurtige adgang til 100 mikrometer, den langsomme akse til 100 mikrometer, X-forskydningen til nul mikrometer, Y-forskydningen til nul mikrometer, gittervinklen til nul grader, pixel til 64 x 64 og pixelforholdet til en til en. Åbn derefter automatiseringssoftwaren.Vælg stien til scriptfilen i pop op-vinduet. Angiv W1-koordinaten i P1-variabellinje 239 i inputbokssektionen i gyfonscriptet og W2-koordinatværdien i P2-variabellinje 241. Tilfør tonehøjdeværdien til pitchvariabellinjen 245 i scriptet, og indtast brønddimensionen, som kan bestemmes ud fra designet af brøndmønstrene i W-S-variabellinje 248.Skriv stien til den lagringsmappe i linje 251 for at gemme dataene på det ønskede sted og indstille den samlede områdevariabellinje 254 til ønsket om at multiplum af de 100 mikrometer. Indstil derefter matrixrækken og kolonnen for kraftkurver, der er registreret pr. brønd i talscanningsvariabellinjen 257, og klik på Kør for at starte programmet. Hvis du vil analysere dataene, skal du bruge videostudiekodesoftwaren til at åbne Python-scriptet og udføre pythonscriptet til kopiering af filer for at organisere force curve-filerne i én mappe.Angiv stien til den generelle mappe, hvor dataene skal gemmes. for at analysere kraftkurverne skal du åbne den atomare kraftmikroskopproducents databehandlingssoftware. Vælg en batch af spektroskopikurver i menuen Filer.Vælg derefter fil- og indlæsningsprocessen, og vælg stivhedsprocessen. Vælg det sidste trin i processen, og klik på behold og anvend på alle, så alle kraftkurver får samme behandling. Hvis du vil åbne R-scriptet, skal du indlæse dig filer, der indeholder de oplysninger, der er udtrukket med databehandlingssoftwaren, i R-studiets software.Klik på importdatasættet i miljøvinduet, og klik på Gennemse for at finde TSV-filen med prik fra tekstlæser i pop op-vinduet. Når filen er indlæst, skal du vælge kodekørselsområde og køre alt for at køre hele koden. Her vises typiske histogrammer opnået ved hjælp af protokollen som demonstreret.I denne analyse blev stivhedsrepartitionen registreret på 957 indfødte celler, Mens stivheden af 574 caspofungin behandlede celler i denne analyse blev målt. Vid, at brugen af hundredvis af celler gør det muligt at observere en to-modal fordeling af værdierne. I mindre prøver observeres der typisk en enkelt fordeling, som kan resultere i manglende observation af befolkningens heterogenitet.En sammenligning af de to betingelser fremhæver virkningerne af Caspofungin på at reducere cellens stivhed. En afsløret af ANOVA sammenligning af de indfødte og behandlede celler, de to betingelser udviser meget, væsentligt forskellige stivheder. Denne værdi blev nået på grund af det store antal analyserede celler, hvilket giver en større tillid til de opnåede resultater.Tilføjelse af supernatant til PDMS-stemplet, før cellerne skylles gentagne gange ind i brøndene, indtil stemplet er fuldt, er afgørende for analysens succes. I dette proof of concept blev Candida albicans celler analyseret, men protokollen kan anvendes på enhver gruppe mønsterceller, molekyler eller materialer.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Automation of Bio-Atomic Force Microscope Measurements on Hundreds of C. albicans Cells

Multiplexed Single-molecule Force Proteolysis Measurements Using Magnetic Tweezers

Multiplexed enkelt-molekyle Tving proteolyse målinger ved hjælp Magnetiske Pincetter

The  generation and detection of mechanical forces is a ubiquitous aspect of cell physiology,  with direct relevance to cancer metastasis1, atherogenesis2 ...

Candida albicans Biofilm Chip (CaBChip) for High-throughput Antifungal Drug Screening

Candida albicans Biofilm Chip CaBChip for High-throughput Antifungal Drug Screening

Candida albicans Biofilm Chip (Ca BChip) for Højkapacitetsforskning Antifungisk Drug Screening

Candida  albicans remains the main etiological agent of candidiasis, which  currently represents the fourth most common nosocomial bloodstream infection ...

Flexural Rigidity Measurements of Biopolymers Using Gliding Assays

Microtubules are cytoskeletal polymers which  play a role in cell division, cell mechanics, and intracellular transport. Each of these functions requires ...

Biosensor for Detection of Antibiotic Resistant Staphylococcus Bacteria

Biosensor til detektion af antibiotikaresistente Staphylococcus Bakterier

A structurally transformed lytic bacteriophage having a broad host range of Staphylococcus aureus strains and a penicillin-binding protein (PBP 2a) ...

Measuring the Mechanical Properties of Living Cells Using Atomic Force Microscopy

Måling af mekaniske egenskaber af levende celler bruge Atomic Force Microscopy

Mechanical  properties of cells and extracellular matrix (ECM) play important roles in many  biological processes including stem cell differentiation, ...

Cell Patterning on Photolithographically Defined 
Parylene-C: SiO2 Substrates

Cell Patterning on Photolithographically Defined 
Parylene-C: SiO2 Substrates

Cell Patterning på fotolitografisk Defineret Parylene-C: SiO<sub&gt; 2.</sub&gt; Underlag

Cell patterning platforms support broad research goals, such as construction of predefined in vitro neuronal networks and the exploration of certain ...

From Fast Fluorescence Imaging to Molecular Diffusion Law on Live Cell Membranes in a Commercial Microscope

Fra Hurtig fluorescensimagografi til molekylær diffusion lov om levende cellemembraner i en kommerciel mikroskop

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the ...

Atomic Force Microscopy Imaging and Force Spectroscopy of Supported Lipid Bilayers

Atomic force mikroskopi Imaging og Kraft spektroskopi af understøttede lipiddobbeltlag

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient ...

Power Input Measurements in Stirred Bioreactors at Laboratory Scale

Power Input målinger i Stirred bioreaktorer på laboratoriet skala

The power input in stirred bioreactors is an important scaling-up parameter and can be measured through the torque that acts on the impeller shaft during ...

Measurement of Force-Sensitive Protein Dynamics in Living Cells Using a Combination of Fluorescent Techniques

Måling af kraft-følsom Protein Dynamics i levende celler ved hjælp af en kombination af fluorescerende teknikker

Cells sense and respond to physical cues in their environment by converting mechanical stimuli into biochemically-detectable signals in a process called ...