Name: automation of bio-atomic force microscope measurements on hundreds of c. albicans cells
Uploaded: 2021-04-02T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Automation of Bio-Atomic Force Microscope Measurements on Hundreds of C. albicans Cells at JoVE.com

We willen FONCYCYT van CONACYT (Mexico), het ministerie van Buitenlandse Zaken van Frankrijk en de Université Paris 13 erkennen, hoewel de financiële steun van het internationale samenwerkingsproject ECOS-NORD genaamd Nano-palpation for diagnosis, nr. 263337 (Mexico) en MI5P02 (Frankrijk). AMR wil de financiële steun van SIP-IPN via het project No. 20195489 bedanken. SPC wordt ondersteund door een PhD fellowship van CONACYT (No. 288029) en IPN via de cotutelle overeenkomst om een dubbel PhD certificaat (IPN-UPS) te behalen. ED en CFD zijn onderzoekers van Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS).

1. Microbiële celkweek
<ol><li>Cellen uit een glycerolvoorraad revivificeren. OPMERKING: C. albicans worden bij -80 °C opgeslagen in glycerolvoorraden, op knikkers.<ol>
<li>Pluk een marmer in de bouillon van -80 °C en wrijf het op gist pepton dextrose (YPD) agar. Kweek de cellen gedurende 2 dagen bij 30 °C, vóór vloeibare teelt.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bereid vloeibare culturen voor.<ol>
<li>Vul een kweekbuis met 5 ml steriele YPD-bouillon en voeg een enkele kolonie C. albicans-cellen toe, gek...

<ol>
	<li>Cross, S. E., Jin, Y. S., Rao, J., Gimzewski, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanomechanical+analysis+of+cells+from+cancer+patients.">Nanomechanical analysis of cells from cancer patients.</a> Nature Nanotechnology. 2 (12), 780-783 (2007).</li><li>Dague, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+force+and+electron+microscopic-based+study+of+sarcolemmal+surface+of+living+cardiomyocytes+unveils+unexpected+mitochondrial+shift+in+heart+failure.">Atomic force and electron microscopic-based study of sarcolemmal surface of living cardiomyocytes unveils unexpected mitochondrial shift in heart failure.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 74, 162-172 (2014).</li><li>Muller, D. J., Helenius, J., Alsteens, D., Dufrene, Y. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force+probing+surfaces+of+living+cells+to+molecular+resolution.">Force probing surfaces of living cells to molecular resolution.</a> Nature Chemical Biology. 5 (6), 383-390 (2009).</li><li>Dague, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+Force+Microscopy+to+Explore+Electroporation+Effects+on+Cells.">Atomic Force Microscopy to Explore Electroporation Effects on Cells.</a> Handbook of Electroporation. , 1-13 (2016).</li><li>Puntheeranurak, T., Neundlinger, I., Kinne, R. K. H., Hinterdorfer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+recognition+force+spectroscopy+of+transmembrane+transporters+on+living+cells.">Single-molecule recognition force spectroscopy of transmembrane transporters on living cells.</a> Nature Protocols. 6 (9), 1443-1452 (2011).</li><li>Formosa, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoscale+analysis+of+the+effects+of+antibiotics+and+CX1+on+a+Pseudomonas+aeruginosa+multidrug-resistant+strain.">Nanoscale analysis of the effects of antibiotics and CX1 on a Pseudomonas aeruginosa multidrug-resistant strain.</a> Scientific Reports. 2, (2012).</li><li>Pillet, F., Chopinet, L., Formosa, C., Dague, &. #. 2. 0. 1. ;. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+Force+Microscopy+and+pharmacology:+From+microbiology+to+cancerology.">Atomic Force Microscopy and pharmacology: From microbiology to cancerology.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - General Subjects. 1840 (3), 1028-1050 (2014).</li><li>Wu, P. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+methods+to+assess+cell+mechanical+properties.">A comparison of methods to assess cell mechanical properties.</a> Nature Methods. 15 (7), 491-498 (2018).</li><li>Rigato, A., Rico, F., Eghiaian, F., Piel, M., Scheuring, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+Force+Microscopy+Mechanical+Mapping+of+Micropatterned+Cells+Shows+Adhesion+Geometry-Dependent+Mechanical+Response+on+Local+and+Global+Scales.">Atomic Force Microscopy Mechanical Mapping of Micropatterned Cells Shows Adhesion Geometry-Dependent Mechanical Response on Local and Global Scales.</a> ACS Nano. 9 (6), 5846-5856 (2015).</li><li>Favre, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parallel+AFM+imaging+and+force+spectroscopy+using+two-dimensional+probe+arrays+for+applications+in+cell+biology.">Parallel AFM imaging and force spectroscopy using two-dimensional probe arrays for applications in cell biology.</a> Journal of Molecular Recognition. 24 (3), 446-452 (2011).</li><li>Dujardin, A., Wolf, P. D., Lafont, F., Dupres, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+multi-sample+acquisition+and+analysis+using+atomic+force+microscopy+for+biomedical+applications.">Automated multi-sample acquisition and analysis using atomic force microscopy for biomedical applications.</a> PLOS ONE. 14 (3), 0213853 (2019).</li><li>Formosa, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+living+cell+arrays+for+atomic+force+microscopy+studies.">Generation of living cell arrays for atomic force microscopy studies.</a> Nature Protocols. 10 (1), 199-204 (2015).</li><li>Proa-Coronado, S., S&#233;verac, C., Martinez-Rivas, A., Dague, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+the+paradigm+of+nanomechanical+measurements+on+cells+using+AFM:+an+automated+methodology+to+rapidly+analyse+thousands+of+cells.">Beyond the paradigm of nanomechanical measurements on cells using AFM: an automated methodology to rapidly analyse thousands of cells.</a> Nanoscale Horizons. , (2019).</li><li>Foncy, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+polyurethane+and+epoxy+resist+master+mold+for+nanoscale+soft+lithography.">Comparison of polyurethane and epoxy resist master mold for nanoscale soft lithography.</a> Microelectronic Engineering. 110, 183-187 (2013).</li><li>Unsay, J. D., Cosentino, K., Garc&#237;a-S&#225;ez, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+Force+Microscopy+Imaging+and+Force+Spectroscopy+of+Supported+Lipid+Bilayers.">Atomic Force Microscopy Imaging and Force Spectroscopy of Supported Lipid Bilayers.</a> Journal of Visualized Experiments. (101), e52867 (2015).</li><li>Schiavone, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+combined+chemical+and+enzymatic+method+to+determine+quantitatively+the+polysaccharide+components+in+the+cell+wall+of+yeasts.">A combined chemical and enzymatic method to determine quantitatively the polysaccharide components in the cell wall of yeasts.</a> FEMS Yeast Research. 14 (6), 933-947 (2014).</li><li>Formosa, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoscale+Effects+of+Caspofungin+against+Two+Yeast+Species,+Saccharomyces+cerevisiae+and+Candida+albicans.">Nanoscale Effects of Caspofungin against Two Yeast Species, Saccharomyces cerevisiae and Candida albicans.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 57 (8), 3498-3506 (2013).</li><li>El-Kirat-Chatel, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoscale+analysis+of+caspofungin-induced+cell+surface+remodelling+in+Candida+albicans.">Nanoscale analysis of caspofungin-induced cell surface remodelling in Candida albicans.</a> Nanoscale. 5 (3), 1105-1115 (2013).</li><li>Peric, O., Hannebelle, M., Adams, J. D., Fantner, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+bacterial+traps+for+simultaneous+fluorescence+and+atomic+force+microscopy.">Microfluidic bacterial traps for simultaneous fluorescence and atomic force microscopy.</a> Nano Research. 10 (11), 3896-3908 (2017).</li></ol>

De belangrijkste verbetering van deze methodologie is een significante toename van het aantal gemeten cellen in een bepaalde hoeveelheid tijd. De tegenwaarde is een vermindering van het aantal gemeten punten per cel. Het betekent dat deze methode niet is ontworpen om een gedetailleerde analyse van een enkele cel te bieden. De methode is alleen van toepassing op cellen die in de putten van de PDMS-stempel passen. De stempel is vrij veelzijdig, terwijl het putten van 1,5 x 1,5 μm2 tot 6 x 6 μm2bevat...

Dit werk biedt een methodiek om met behulp van een atoomkrachtmicroscoop (AFM) automatische krachtmetingen uit te voeren op honderden levende cellen. Het biedt ook een methode om microben te immobiliseren op een PDMS-microgestructureerde stempel die compatibel is met AFM-experimenten die in een vloeibare omgeving worden uitgevoerd.
Bio-AFM is een zeer gespecialiseerde technologie die is ontworpen voor toepassingen in de biologie en vervolgens wordt gebruikt om levende cellen te bestuderen. Het vereist een getrainde ingenieur die één cel tegelijk kan analyseren. In deze omstandigheden is het aantal verschillende cellen dat kan worden geanalyseerd vrij klein, typisch 5 tot 10 cellen in 4-5 uur. De hoeveelheid krachtmetingen die op een enkele cel zijn geregistreerd, is echter meestal erg hoog en kan gemakkelijk 1000 bereiken. Het huidige paradigma van AFM-krachtmetingen op levende cellen is dus het registreren van honderden krachtcurven (FCs) maar op een beperkt aantal cellen.
Statistisch gezien is deze benadering twijfelachtig en roept de kwestie van de representativiteit van de steekproef op. Het is bijvoorbeeld moeilijk om de heterogeniteit van een celpopulatie te evalueren door slechts een paar cellen te meten, zelfs als er honderden metingen op deze paar cellen worden geregistreerd. Het is echter op basis van dit paradigma dat er grote vooruitgang is geboekt op het gebied van biofysica, microbiologie en nanogeneeskunde1,2,3. Inderdaad, nanometeranalyse op de schaal van enkele cellen heeft nieuwe informatie opgeleverd over cellulaire nanomechanica, over de organisatie van transmembrane-eiwitten of het werkingsmechanisme van antimicrobiële of antikankergeneesmiddelen4,5,6,7. Onlangs zijn echter verschillende biomechanische tests met hoge doorvoer op cellen naar voren gekomen8, waaruit blijkt dat de wetenschappelijke gemeenschap geïnteresseerd is in het veranderen van dit paradigma en toegang tot de heterogeniteit van de celpopulatie. Deze tests zijn allemaal gebaseerd op microfluïdische systemen om cellen te vervormen en optisch hun vervorming onder spanning te meten om een indirecte meting van hun totale oppervlakteelasticiteit te verkrijgen8. Een belangrijk probleem met deze methoden is echter dat ze monoparametrisch zijn: alleen celelasticiteit kan worden onderzocht. Bovendien staan ze het meten van de mechanische parameters van aanhangende cellen niet toe, wat beperkend kan zijn voor de studies van niet-circulerende zoogdiercellen of biofilms bijvoorbeeld.
Door de teams van S. Scheuring9 en M. Favre10zijn benaderingen met afm ontwikkeld. Scheuring et al. geïmmobiliseerde cellen op fibronectinepatronen9, waardoor individuele cellen de vorm van het patroon moesten aannemen9. Vervolgens bracht dit team de mechanische eigenschappen van een paar cellen in kaart om gemiddelde gegevens te definiëren, representatief voor 14 tot 18 cellen. De door Farve c.s. uitgevoerde ontwikkeling was gericht op het multiplexen van de metingen door parallel te lopen met de AFM-vrijdragende10. Voor zover wij weten heeft dit werk in de multiplexing richting niet geleid tot metingen op levende cellen.
Een interessante aanpak voorgesteld door het team van Dujardin presenteert een geautomatiseerde AFM die cellen kan identificeren en in beeld kan brengen aan de onderkant van op maat gemaakte putten. Hoewel deze methode geen analyse van een grote populatie cellen mogelijk maakt, maakt het het mogelijk om automatisch verschillende omstandigheden in elke put te testen11.
Ons doel in dit werk is ambitieuzer, omdat we ten minste 1000 cellen wilden meten om toegang te krijgen tot geen gemiddelde cel, maar integendeel de heterogeniteit tussen cellen. De strategie die we hier hebben ontwikkeld om toegang te krijgen tot celpopulatie heterogeniteit met behulp van AFM is gebaseerd op de analyse van honderden cellen waarop een beperkt aantal krachtcurves wordt geregistreerd. In vergelijking met de "klassieke" benadering van het registreren van een groot aantal krachtcurven op een beperkt aantal cellen, moet deze benadering als complementair worden beschouwd, aangezien deze niet dezelfde informatie verschaft. Inderdaad, hoewel de typische methode het mogelijk maakt om individuele celoppervlak heterogeniteit te onderzoeken, met behulp van onze aanpak, zijn we in staat om toegang te krijgen tot de volledige celpopulatie heterogeniteit. Om dit doel te bereiken, hebben we een methode gecombineerd die microben (hier de gistsoort Candida albicans) direct immobiliseert in de putten van een PDMS microgestructureerde stempel12, en ontwikkelt een origineel programma voor het automatisch verplaatsen van de AFM-tip van cel naar cel13 en het meten van de mechanische eigenschappen van elke cel.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>AFM cantilever</td>
			<td>Bruker AFM probes</td>
			<td>MLCT</td>
			<td>The cantilevers used were the labeled &#8220;C&#8221; with resonant frequency of 7 to 10 kHz and k: 0.01 N/m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AFM data analysis</td>
			<td>JPK-Bruker</td>
			<td>JPK Data processing version minimum 5.1.8</td>
			<td>Can be downloaded from a JPK-Bruker user acount</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AFM Petri dishes</td>
			<td>WPI</td>
			<td>FluoroDish FD35-100</td>
			<td>The heater was used to monitor the temperature changes during the experiment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Atomic force Microscope (AFM)</td>
			<td>JPK-Bruker</td>
			<td>Nanowizard II or III</td>
			<td>the AFM should be mounted on an inverted optical microscope with a motorized stage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caspofungin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SML0425-5MG</td>
			<td>Caspofungin was used with a concentration of 4 MIC (Minimum Inhibitor Concentration)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Code editor</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td>Visual Studio Code version 1.40.1</td>
			<td>https://code.visualstudio.com/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryobeads</td>
			<td>IFU</td>
			<td>CB12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dessicator/Degassing chamber</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>15594635</td>
			<td>The equipment is used to degassing the PDMS stamps for about 50 minutes any dessicator coupled with a vaccum pump will do.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish heater</td>
			<td>JPK-Bruker</td>
			<td>PetriDishHeater</td>
			<td>This is an add-on to the JPK/Bruker AFM. The heater was used to monitor the temperature changes during the experiment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate buffer pH 5.2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7899</td>
			<td>The solution contains 18 mM sodium acetate, 1 mM CaCl2, and 1 mM MnCl2. Adjust the pH with glacial acetic acid. The solution can be stored at 4 &#176;C for 2 months</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Statistical analysis language</td>
			<td>https://www.r-project.org</td>
			<td>R version 3.6.1</td>
			<td>R is a language and environment for statistical computing and graphics. It is a GNU project which is similar to the S language and environment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Statistical analysis software</td>
			<td>https://rstudio.com</td>
			<td>R studio version 1.1.463</td>
			<td>collaboration between the R Foundation, RStudio, Microsoft, TIBCO, Google, Oracle, HP and others. RStudio and Shiny are affiliated projects of the Foundation for Open Access Statistics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard 184</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>761028</td>
			<td>Polydimethylsiloxane (PDMS) and curing agent in one set</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Peptone D Broth</td>
			<td>Difco</td>
			<td>242820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>YPD Agar</td>
			<td>Difco</td>
			<td>DF0427-17-6</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

automation of bio-atomic force microscope measurements on hundreds of c. albicans cells

De in dit artikel gepresenteerde methode is gericht op het automatiseren van Bio-AFM experimenten en het registreren van krachtcurves. Met deze methode is het mogelijk om krachtencurven op 1000 cellen automatisch in 4 uur vast te leggen. Om een analysetijd van 4 uur te behouden, wordt het aantal krachtcurven per cel teruggebracht tot 9 of 16. De methode combineert een op Jython gebaseerd programma en een strategie voor het assembleren van cellen op gedefinieerde patronen. Het programma, geïmplementeerd op een commerciële Bio-AFM, kan de tip centreren op de eerste cel van de array en vervolgens automatisch van cel naar cel bewegen terwijl krachtcurves op elke cel worden opgenomen. Met behulp van deze methodologie is het mogelijk om toegang te krijgen tot de biofysische parameters van de cellen, zoals hun stijfheid, hun kleefeigenschappen, enz. Met de automatisering en het grote aantal geanalyseerde cellen heeft men toegang tot het gedrag van de celpopulatie. Dit is een doorbraak op het gebied van Bio-AFM, waar tot nu toe slechts enkele tientallen cellen gegevens zijn geregistreerd.

We gebruikten het beschreven protocol om het effect van caspofungine op de biofysische eigenschappen van de opportunistische menselijke ziekteverwekker C. albicans in zijn gistvorm te analyseren. Caspofungine is een laatste kans antischimmel molecuul gebruikt wanneer andere geneesmiddelen zijn niet effectief vanwege de weerstandsmechanismen cellen ontwikkelen zich in de richting van antischimmelmiddelen. Het werkingsmechanisme is gebaseerd op de remming van de subeenheid Fks2 van het complex fks1/Fks2 die verant...

Watch this Scientific Journal Video about Automation of Bio-Atomic Force Microscope Measurements on Hundreds of C. albicans Cells at JoVE.com

Automation of Bio-Atomic Force Microscope Measurements on Hundreds of C. albicans Cells

Dit protocol heeft als doel afm-metingen op honderden microbiële cellen te automatiseren. Eerst worden microben geïmmobiliseerd in PDMS-stempelmicrostructuren en vervolgens worden krachtspectroscopiemetingen automatisch uitgevoerd op honderden geïmmobiliseerde cellen.

Automatisering van bio-atoomkrachtmicroscoopmetingen op honderden C. albicans-cellen

The method presented in this paper aims to automate Bio-AFM experiments and the recording of force curves. Using this method, it is possible to record ...

Atoomkrachtmicroscoopautomatisering is een belangrijke innovatie in de evolutie van de technologie naar biomedische toepassingen. Het opent ook toegang tot het onderzoek naar de biomechanische eigenschappen van celpopulaties. Onze methode maakt het mogelijk om AFM-metingen voor 1.000 cellen in vier uur vast te leggen, in vergelijking met de gebruikelijke methoden, die vier uur duren om 10 cellen te meten, dit is echt een aanzienlijke tijdwinst.Als automatisering een voorwaarde is om deze technologie in ziekenhuislaboratoria te brengen, suggereert dit proof of concept-protocol het potentieel voor gebruik bij de ontwikkeling van specifieke medische diagnostische strategieën. Dit protocol maakt gebruik van een veelzijdige PDMS-stam die kan worden gevuld met verschillende microben waardoor verschillende systemen kunnen worden verkend. Om de PDMS-stempel te bereiden, mengt u 55 gram PDMS-prepolymeeroplossing met een massaverhouding van 10 tot één in PDMs, oligomeren en uithardingsmiddel en ontgast u de resulterende oplossing onder vacuüm op één keer 10 tot de negatieve één tot één keer 10 tot de negatieve twee staven gedurende vijf tot 10 minuten.Wanneer alle vangbellen zijn verwijderd, giet je 20 gram van de ontgaste oplossing op een siliconen mastervorm tot een dikte van twee tot drie millimeter en ontgass je het opnieuw. Wanneer alle bellen zijn verwijderd, moet u het PDMS gedurende een uur op 80 graden Celsius laten staan en een scalpel gebruiken om de PDMS micro gestructureerde stempel parallel aan de zichtbare microstructuurarrays te snijden. Schil vervolgens de stempel van de siliconen mastervorm en plaats de stempelmicrostructuurplaats op een glazen dia met de microstructuren uitgelijnd met de zijkant van de dia.Om de cellen voor het apparaat voor te bereiden, centrifugeer 600 microliters van de celsuspensie van belang en voeg 200 microliters van het supernatant toe aan de stempel. Ontgast het supernatant ongeveer 40 minuten onder vacuüm. Wanneer alle bellen zijn verwijderd, vervangt u het supernatant van het PDMS-oppervlak door 200 microliters van de geresuspendeerde celoplossing gedurende een incubatietijd van 15 minuten bij kamertemperatuur.Om de cellen in de microstructuren van de stempel te laden, gebruikt u een glazen schuif die onder een hoek van 30 tot 50 graden wordt gehouden om de cellen in beide richtingen over de stempel te spreiden, meerdere keren indien nodig. Wanneer een hoge vulsnelheid van de microstructuren is bereikt, gebruik dan een pipet om de celsuspensie te verwijderen en was de drie keer met één milliliter acetaatbuffer per wasbeurt om eventuele ongetradeerde cellen te verwijderen. Gebruik na de laatste wasbeurt de stikstofstroom om de achterkant van het monster te drogen en plaats de stempel in een petrischaal.Voeg vervolgens twee milliliter verse acetaatbuffer toe aan de schaal. Voor atoomkrachtmicroscopie van de cellen plaatst u de schotel op het stadium van de atoomkrachtmicroscoop en centreert u het stadium op nul tot nul. Wanneer het podium is gecentreerd, verplaatst u de schaal in de petrischaalhouder van de microscoop en lijnt u de rand van de stempel uit zodat deze loodrecht staat op de y-as van de petrischaalhouder.Plaats vervolgens de krachtkop van de atoommicroscoop op het podium en zorg ervoor dat de stappenmotoren voldoende zijn uitgeschoven om te voorkomen dat de punt op de stempel crasht. Gebruik voor beeldvorming de microscoopknoppen om de atoomkrachtmicroscooppunt over de linkerhoek van de 4,5 bij 4,5 vierkante micrometerputten te centreren en selecteer de krachtmappingmodus in de microscoopsoftware. Om een 64 bij 64 krachtkaart in te stellen over een gebied van 100 bij 100 micrometer, stelt u het relatieve instelpunt in op drie tot vijf nano Newton, de Z-lengte op vier micrometer, de Z-beweging op constante duur, de verlengingstijd tot 0,01 seconden, de verlengingsvertraging op nul, de intrekkingsvertraging op nul, de vertragingsmodus op constante kracht , de steekproeffrequentie tot 2048 Hertz.Schakel Z closed loop uit en controleer de vierkante afbeelding. Stel de snelle toegang in op 100 micrometer, de langzame as op 100 micrometer, de X-offset op nul micrometer, de Y-offset op nul micrometer, de rasterhoek op nul graden, de pixels op 64 bij 64 en de pixelverhouding op één op één. Open vervolgens de automatiseringssoftware.Selecteer in het pop-upvenster het pad naar het scriptbestand. Voer de W1-coördinaat in de variabele P1-regel 239 van de sectie invoervak van het gyfonscript en de W2-coördinaatwaarde in de variabele P2-regel 241 in. Schrijf de toonhoogtewaarde toe aan de toonhoogtevariabele lijn 245 van het script en voer de putdimensie in, die kan worden bepaald aan de hand van het ontwerp van de putpatronen in de variabele W-S-lijn 248.Schrijf het pad naar de opslagmap in regel 251 om de gegevens op de gewenste plaats op te slaan en stel de variabele regel 254 voor het totale gebied in op de wens om meerdere uiteinden van de 100 micrometer te bereiken. Stel vervolgens de matrixrij en kolom krachtcurven in die per put zijn opgenomen in de variabele regel 257 voor getalscans en klik op uitvoeren om het programma te starten. Als u de gegevens wilt analyseren, gebruikt u de videostudiocodesoftware om het Python-script te openen en het Python-script voor kopieerbestanden uit te voeren om de forcecurvebestanden in één map te ordenen.Voer het pad in naar de algemene map waar de gegevens worden opgeslagen. om de krachtcurven te analyseren, opent u de gegevensverwerkingssoftware van de fabrikant van de atoomkrachtmicroscoop. Selecteer in het bestandsmenu een batch spectroscopiecurven.Selecteer vervolgens het bestand- en laadproces en selecteer het stijfheidsproces. Selecteer de laatste stap van het proces en klik op houden en toepassen op iedereen, zodat alle krachtcurven dezelfde behandeling krijgen. Als u het R-script wilt openen, laadt u de bestanden met de informatie die met de gegevensverwerkingssoftware is geëxtraheerd in de R-studiosoftware.Klik in het omgevingsvenster op gegevensset importeren en klik vanuit tekstlezer in het pop-upvenster op bladeren om het TSV-bestand met de stip te zoeken. Zodra het bestand is geladen, selecteert u het gebied voor het uitvoeren van code en voert u alles uit om alle code uit te voeren. Hier worden typische histogrammen getoond die zijn verkregen met behulp van het protocol zoals gedemonstreerd.In deze analyse werd de stijfheidsherpartitie geregistreerd op 957 inheemse cellen, terwijl in deze analyse de stijfheid van 574 caspofungine behandelde cellen werd gemeten. Weet dat het gebruik van honderden cellen het mogelijk maakt om een bi-modale verdeling van de waarden waar te nemen. In kleinere monsters wordt meestal een enkele verdeling waargenomen en kan dit leiden tot een gebrek aan observatie van de populatie heterogeniteit.Een vergelijking van de twee aandoeningen benadrukt de effecten van Caspofungin op het verminderen van de celstijfheid. Een onthuld door ANOVA vergelijking van de inheemse en behandelde cellen, de twee voorwaarden vertonen zeer, aanzienlijk verschillende stijfheden. Deze waarde werd bereikt vanwege het grote aantal geanalyseerde cellen, waardoor een groter vertrouwen in de verkregen resultaten.Het toevoegen van het supernatant aan de PDMS-stempel voordat de cellen herhaaldelijk in de putten worden gespoeld totdat de stempel vol is, is van cruciaal belang voor het succes van de analyse. In deze proof of concept werden Candida albicans cellen geanalyseerd, maar het protocol kan worden toegepast op elke groep patrooncellen, moleculen of materialen.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Automation of Bio-Atomic Force Microscope Measurements on Hundreds of C. albicans Cells

Multiplexed Single-molecule Force Proteolysis Measurements Using Magnetic Tweezers

Multiplexed Single-molecule force Proteolyse metingen met behulp van magnetisch pincet

The  generation and detection of mechanical forces is a ubiquitous aspect of cell physiology,  with direct relevance to cancer metastasis1, atherogenesis2 ...

Candida albicans Biofilm Chip (CaBChip) for High-throughput Antifungal Drug Screening

Candida albicans Biofilm Chip CaBChip for High-throughput Antifungal Drug Screening

Candida albicans Biofilm Chip (Ca BChip) voor high-throughput antimycoticum Screening

Candida  albicans remains the main etiological agent of candidiasis, which  currently represents the fourth most common nosocomial bloodstream infection ...

Flexural Rigidity Measurements of Biopolymers Using Gliding Assays

Buigstijfheid Metingen van Biopolymeren gebruik Zweefvliegen Assays

Microtubules are cytoskeletal polymers which  play a role in cell division, cell mechanics, and intracellular transport. Each of these functions requires ...

Biosensor for Detection of Antibiotic Resistant Staphylococcus Bacteria

Biosensor voor de detectie van antibiotica resistente Staphylococcus bacteriën

A structurally transformed lytic bacteriophage having a broad host range of Staphylococcus aureus strains and a penicillin-binding protein (PBP 2a) ...

Measuring the Mechanical Properties of Living Cells Using Atomic Force Microscopy

Het meten van de mechanische eigenschappen van levende cellen door gebruik Atomic Force Microscopy

Mechanical  properties of cells and extracellular matrix (ECM) play important roles in many  biological processes including stem cell differentiation, ...

Cell Patterning on Photolithographically Defined 
Parylene-C: SiO2 Substrates

Cell Patterning on Photolithographically Defined 
Parylene-C: SiO2 Substrates

Cel Patterning op fotolithografisch Defined Parylene-C: SiO<sub&gt; 2</sub&gt; Substrates

Cell patterning platforms support broad research goals, such as construction of predefined in vitro neuronal networks and the exploration of certain ...

From Fast Fluorescence Imaging to Molecular Diffusion Law on Live Cell Membranes in a Commercial Microscope

Van Fast Fluorescentie Imaging om moleculaire diffusie wet op de Live-celmembranen in een Commercial Microscoop

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the ...

Atomic Force Microscopy Imaging and Force Spectroscopy of Supported Lipid Bilayers

Atomic Force Microscopy Imaging en Force Spectroscopie van Ondersteunde lipidendubbellagen

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient ...

Power Input Measurements in Stirred Bioreactors at Laboratory Scale

De Input metingen van de macht in Stirred bioreactoren op laboratoriumschaal

The power input in stirred bioreactors is an important scaling-up parameter and can be measured through the torque that acts on the impeller shaft during ...

Measurement of Force-Sensitive Protein Dynamics in Living Cells Using a Combination of Fluorescent Techniques

Meting van de kracht-gevoelige eiwitten Dynamics in levende cellen met behulp van een combinatie van Fluorescent technieken

Cells sense and respond to physical cues in their environment by converting mechanical stimuli into biochemically-detectable signals in a process called ...