Name: automation of bio-atomic force microscope measurements on hundreds of c. albicans cells
Uploaded: 2021-04-02T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Automation of Bio-Atomic Force Microscope Measurements on Hundreds of C. albicans Cells at JoVE.com

Nous tenons à saluer FONCYCYT du CONACYT (Mexique), le ministère des Affaires étrangères de la France et l’Université Paris 13, à travers le soutien financier du projet collaboratif international ECOS-NORD nommé Nano-palpation pour le diagnostic, n° 263337 (Mexique) et MI5P02 (France). AMR tient à remercier le soutien financier du SIP-IPN dans le cadre du projet no 20195489. La CPS est soutenue par une bourse de doctorat du CONACYT (n° 288029) et de l’IPN dans le cadre de l’accord de cotutelle pour l’obtention d’un double certificat de doctorat (IPN-UPS). ED et CFD sont chercheurs au Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS).

1. Culture cellulaire microbienne
<ol><li>Revivifier les cellules d’un stock de glycérol. REMARQUE: C. albicans sont stockés à -80 °C dans des stocks de glycérol, sur des billes.<ol>
<li>Choisissez une bille dans le stock de -80 °C et frottez-la sur une gélose à la levure peptone dextrose (YPD). Faire pousser les cellules pendant 2 jours à 30 °C, avant la culture liquide.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Préparer des cultures liquides.<ol>
<li>Remplissez un tube de culture avec 5 mL de bouillon stérile ...

<ol>
	<li>Cross, S. E., Jin, Y. S., Rao, J., Gimzewski, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanomechanical+analysis+of+cells+from+cancer+patients.">Nanomechanical analysis of cells from cancer patients.</a> Nature Nanotechnology. 2 (12), 780-783 (2007).</li><li>Dague, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+force+and+electron+microscopic-based+study+of+sarcolemmal+surface+of+living+cardiomyocytes+unveils+unexpected+mitochondrial+shift+in+heart+failure.">Atomic force and electron microscopic-based study of sarcolemmal surface of living cardiomyocytes unveils unexpected mitochondrial shift in heart failure.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 74, 162-172 (2014).</li><li>Muller, D. J., Helenius, J., Alsteens, D., Dufrene, Y. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force+probing+surfaces+of+living+cells+to+molecular+resolution.">Force probing surfaces of living cells to molecular resolution.</a> Nature Chemical Biology. 5 (6), 383-390 (2009).</li><li>Dague, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+Force+Microscopy+to+Explore+Electroporation+Effects+on+Cells.">Atomic Force Microscopy to Explore Electroporation Effects on Cells.</a> Handbook of Electroporation. , 1-13 (2016).</li><li>Puntheeranurak, T., Neundlinger, I., Kinne, R. K. H., Hinterdorfer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+recognition+force+spectroscopy+of+transmembrane+transporters+on+living+cells.">Single-molecule recognition force spectroscopy of transmembrane transporters on living cells.</a> Nature Protocols. 6 (9), 1443-1452 (2011).</li><li>Formosa, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoscale+analysis+of+the+effects+of+antibiotics+and+CX1+on+a+Pseudomonas+aeruginosa+multidrug-resistant+strain.">Nanoscale analysis of the effects of antibiotics and CX1 on a Pseudomonas aeruginosa multidrug-resistant strain.</a> Scientific Reports. 2, (2012).</li><li>Pillet, F., Chopinet, L., Formosa, C., Dague, &. #. 2. 0. 1. ;. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+Force+Microscopy+and+pharmacology:+From+microbiology+to+cancerology.">Atomic Force Microscopy and pharmacology: From microbiology to cancerology.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - General Subjects. 1840 (3), 1028-1050 (2014).</li><li>Wu, P. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+methods+to+assess+cell+mechanical+properties.">A comparison of methods to assess cell mechanical properties.</a> Nature Methods. 15 (7), 491-498 (2018).</li><li>Rigato, A., Rico, F., Eghiaian, F., Piel, M., Scheuring, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+Force+Microscopy+Mechanical+Mapping+of+Micropatterned+Cells+Shows+Adhesion+Geometry-Dependent+Mechanical+Response+on+Local+and+Global+Scales.">Atomic Force Microscopy Mechanical Mapping of Micropatterned Cells Shows Adhesion Geometry-Dependent Mechanical Response on Local and Global Scales.</a> ACS Nano. 9 (6), 5846-5856 (2015).</li><li>Favre, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parallel+AFM+imaging+and+force+spectroscopy+using+two-dimensional+probe+arrays+for+applications+in+cell+biology.">Parallel AFM imaging and force spectroscopy using two-dimensional probe arrays for applications in cell biology.</a> Journal of Molecular Recognition. 24 (3), 446-452 (2011).</li><li>Dujardin, A., Wolf, P. D., Lafont, F., Dupres, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+multi-sample+acquisition+and+analysis+using+atomic+force+microscopy+for+biomedical+applications.">Automated multi-sample acquisition and analysis using atomic force microscopy for biomedical applications.</a> PLOS ONE. 14 (3), 0213853 (2019).</li><li>Formosa, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+living+cell+arrays+for+atomic+force+microscopy+studies.">Generation of living cell arrays for atomic force microscopy studies.</a> Nature Protocols. 10 (1), 199-204 (2015).</li><li>Proa-Coronado, S., S&#233;verac, C., Martinez-Rivas, A., Dague, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+the+paradigm+of+nanomechanical+measurements+on+cells+using+AFM:+an+automated+methodology+to+rapidly+analyse+thousands+of+cells.">Beyond the paradigm of nanomechanical measurements on cells using AFM: an automated methodology to rapidly analyse thousands of cells.</a> Nanoscale Horizons. , (2019).</li><li>Foncy, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+polyurethane+and+epoxy+resist+master+mold+for+nanoscale+soft+lithography.">Comparison of polyurethane and epoxy resist master mold for nanoscale soft lithography.</a> Microelectronic Engineering. 110, 183-187 (2013).</li><li>Unsay, J. D., Cosentino, K., Garc&#237;a-S&#225;ez, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+Force+Microscopy+Imaging+and+Force+Spectroscopy+of+Supported+Lipid+Bilayers.">Atomic Force Microscopy Imaging and Force Spectroscopy of Supported Lipid Bilayers.</a> Journal of Visualized Experiments. (101), e52867 (2015).</li><li>Schiavone, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+combined+chemical+and+enzymatic+method+to+determine+quantitatively+the+polysaccharide+components+in+the+cell+wall+of+yeasts.">A combined chemical and enzymatic method to determine quantitatively the polysaccharide components in the cell wall of yeasts.</a> FEMS Yeast Research. 14 (6), 933-947 (2014).</li><li>Formosa, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoscale+Effects+of+Caspofungin+against+Two+Yeast+Species,+Saccharomyces+cerevisiae+and+Candida+albicans.">Nanoscale Effects of Caspofungin against Two Yeast Species, Saccharomyces cerevisiae and Candida albicans.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 57 (8), 3498-3506 (2013).</li><li>El-Kirat-Chatel, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoscale+analysis+of+caspofungin-induced+cell+surface+remodelling+in+Candida+albicans.">Nanoscale analysis of caspofungin-induced cell surface remodelling in Candida albicans.</a> Nanoscale. 5 (3), 1105-1115 (2013).</li><li>Peric, O., Hannebelle, M., Adams, J. D., Fantner, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+bacterial+traps+for+simultaneous+fluorescence+and+atomic+force+microscopy.">Microfluidic bacterial traps for simultaneous fluorescence and atomic force microscopy.</a> Nano Research. 10 (11), 3896-3908 (2017).</li></ol>

La principale amélioration apportée par cette méthodologie est une augmentation significative du nombre de cellules mesurées dans un laps de temps déterminé. La contrepartie est une réduction du nombre de points mesurés par cellule. Cela signifie que cette méthode n’est pas conçue pour fournir une analyse détaillée d’une seule cellule. La méthode s’applique uniquement aux cellules qui peuvent tenir dans les puits du tampon PDMS. Le timbre est assez polyvalent, alors qu’il contient des puits de 1,5 x ...

Ce travail fournit une méthodologie pour effectuer des mesures de force automatiques sur des centaines de cellules vivantes à l’aide d’un microscope à force atomique (AFM). Il fournit également une méthode pour immobiliser les microbes sur un tampon microstructuré PDMS qui est compatible avec les expériences AFM menées dans un environnement liquide.
Bio-AFM est une technologie hautement spécialisée conçue pour des applications en biologie et ensuite utilisée pour étudier les cellules vivantes. Il nécessite un ingénieur qualifié qui peut analyser une cellule à la fois. Dans ces conditions, le nombre de cellules différentes pouvant être analysées est plutôt faible, typique de 5 à 10 cellules en 4-5 heures. Cependant, la quantité de mesures de force enregistrées sur une seule cellule est généralement très élevée et peut facilement atteindre 1000. Ainsi, le paradigme actuel des mesures de force AFM sur les cellules vivantes est d’enregistrer des centaines de courbes de force (FCs) mais sur un nombre limité de cellules.
Statistiquement, cette approche est discutable et soulève la question de la représentativité de l’échantillon. En effet, il est difficile, par exemple, d’évaluer l’hétérogénéité d’une population cellulaire en ne mesurant que quelques cellules, même si des centaines de mesures sont enregistrées sur ces quelques cellules. Cependant, c’est sur la base de ce paradigme que des avancées majeures ont été réalisées en biophysique, microbiologie et nanomédecine1,2,3. En effet, l’analyse nanométrique à l’échelle des cellules individuelles a fourni de nouvelles informations sur la nanomécanique cellulaire, sur l’organisation des protéines transmembranaires, ou sur le mécanisme d’action des médicaments antimicrobiens ou anticancéreux4,5,6,7. Récemment cependant, plusieurs tests biomécaniques à haut débit menés sur des cellules ont émergé8, montrant l’intérêt de la communauté scientifique à changer ce paradigme et à accéder à l’hétérogénéité de la population cellulaire. Ces essais s’appuient tous sur des systèmes microfluidiques pour déformer les cellules et mesurer optiquement leur déformation sous contrainte afin d’obtenir une mesure indirecte de leur élasticité globale de surface8. Cependant, un problème important avec ces méthodes est qu’elles sont mono-paramétriques: seule l’élasticité cellulaire peut être sondée. De plus, ils ne permettent pas la mesure des paramètres mécaniques des cellules adhérentes, ce qui peut être limitatif pour les études de cellules de mammifères non circulaires ou de biofilms par exemple.
Des approches impliquant l’AFM ont été développées par les équipes de S. Scheuring9 et M. Favre10. Scheuring et al. ont immobilisé des cellules sur des motifs de fibronectine9,forçant des cellules individuelles à prendre la forme du motif9. Ensuite, cette équipe a cartographié les propriétés mécaniques de quelques cellules pour définir des données moyennes, représentatives de 14 à 18 cellules. Le développement réalisé par Farve et al. visait à multiplexer les mesures en parallélisant les cantilevers AFM10. À notre connaissance, ce travail dans le sens du multiplexage n’a pas conduit à des mesures sur des cellules vivantes.
Une approche intéressante proposée par l’équipe de Dujardin présente une AFM automatisée capable d’identifier les cellules et de les imager au fond de puits sur mesure. Bien que cette méthode ne permette pas l’analyse d’une grande population de cellules, elle permet de tester automatiquement différentes conditions dans chaque puits11.
Notre objectif dans ce travail est plus ambitieux puisque nous voulions mesurer au moins 1000 cellules pour accéder non pas à une cellule moyenne, mais, au contraire, à l’hétérogénéité entre les cellules. La stratégie que nous avons développée ici pour accéder à l’hétérogénéité de la population cellulaire à l’aide de l’AFM est basée sur l’analyse de centaines de cellules sur lesquelles un nombre limité de courbes de force sont enregistrées. Par rapport à l’approche « classique » consistant à enregistrer un grand nombre de courbes de force sur un nombre limité de cellules, cette approche doit être considérée comme complémentaire car elle ne fournit pas les mêmes informations. En effet, alors que la méthode typique permet de sonder l’hétérogénéité de la surface cellulaire individuelle, en utilisant notre approche, nous sommes en mesure d’accéder à l’hétérogénéité de la population cellulaire entière. Pour atteindre cet objectif, nous avons combiné une méthode qui immobilise directement les microbes (ici l’espèce de levure Candida albicans)dans les puits d’un tampon microstructuré PDMS12,et développe un programme original pour déplacer la pointe AFM, automatiquement, de cellule en cellule13 et mesurer les propriétés mécaniques de chaque cellule.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>AFM cantilever</td>
			<td>Bruker AFM probes</td>
			<td>MLCT</td>
			<td>The cantilevers used were the labeled &#8220;C&#8221; with resonant frequency of 7 to 10 kHz and k: 0.01 N/m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AFM data analysis</td>
			<td>JPK-Bruker</td>
			<td>JPK Data processing version minimum 5.1.8</td>
			<td>Can be downloaded from a JPK-Bruker user acount</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AFM Petri dishes</td>
			<td>WPI</td>
			<td>FluoroDish FD35-100</td>
			<td>The heater was used to monitor the temperature changes during the experiment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Atomic force Microscope (AFM)</td>
			<td>JPK-Bruker</td>
			<td>Nanowizard II or III</td>
			<td>the AFM should be mounted on an inverted optical microscope with a motorized stage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caspofungin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SML0425-5MG</td>
			<td>Caspofungin was used with a concentration of 4 MIC (Minimum Inhibitor Concentration)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Code editor</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td>Visual Studio Code version 1.40.1</td>
			<td>https://code.visualstudio.com/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryobeads</td>
			<td>IFU</td>
			<td>CB12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dessicator/Degassing chamber</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>15594635</td>
			<td>The equipment is used to degassing the PDMS stamps for about 50 minutes any dessicator coupled with a vaccum pump will do.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish heater</td>
			<td>JPK-Bruker</td>
			<td>PetriDishHeater</td>
			<td>This is an add-on to the JPK/Bruker AFM. The heater was used to monitor the temperature changes during the experiment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate buffer pH 5.2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7899</td>
			<td>The solution contains 18 mM sodium acetate, 1 mM CaCl2, and 1 mM MnCl2. Adjust the pH with glacial acetic acid. The solution can be stored at 4 &#176;C for 2 months</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Statistical analysis language</td>
			<td>https://www.r-project.org</td>
			<td>R version 3.6.1</td>
			<td>R is a language and environment for statistical computing and graphics. It is a GNU project which is similar to the S language and environment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Statistical analysis software</td>
			<td>https://rstudio.com</td>
			<td>R studio version 1.1.463</td>
			<td>collaboration between the R Foundation, RStudio, Microsoft, TIBCO, Google, Oracle, HP and others. RStudio and Shiny are affiliated projects of the Foundation for Open Access Statistics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard 184</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>761028</td>
			<td>Polydimethylsiloxane (PDMS) and curing agent in one set</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Peptone D Broth</td>
			<td>Difco</td>
			<td>242820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>YPD Agar</td>
			<td>Difco</td>
			<td>DF0427-17-6</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

automation of bio-atomic force microscope measurements on hundreds of c. albicans cells

La méthode présentée dans cet article vise à automatiser les expériences Bio-AFM et l’enregistrement des courbes de force. En utilisant cette méthode, il est possible d’enregistrer automatiquement les courbes de forces sur 1000 cellules en 4 heures. Pour maintenir un temps d’analyse de 4 heures, le nombre de courbes de force par cellule est réduit à 9 ou 16. La méthode combine un programme basé sur Jython et une stratégie d’assemblage de cellules sur des motifs définis. Le programme, mis en œuvre sur un Bio-AFM commercial, peut centrer la pointe sur la première cellule du réseau, puis se déplacer, automatiquement, de cellule en cellule tout en enregistrant les courbes de force sur chaque cellule. Grâce à cette méthodologie, il est possible d’accéder aux paramètres biophysiques des cellules tels que leur rigidité, leurs propriétés adhésives, etc. Avec l’automatisation et le grand nombre de cellules analysées, on peut accéder au comportement de la population cellulaire. Il s’agit d’une percée dans le domaine de la bio-AFM où les données n’ont, jusqu’à présent, été enregistrées que sur quelques dizaines de cellules.

Nous avons employé le protocole décrit pour analyser l’effet du caspofungin sur les propriétés biophysiques des albicans opportunistes du microbe pathogène humain opportuniste C. sous sa forme de levure. La caspofungine est une molécule antifongique de dernière chance utilisée lorsque d’autres médicaments sont inefficaces en raison des mécanismes de résistance que les cellules développent vers les antifongiques. Son mécanisme d’action est basé sur l’inhibition de la sous-unité Fks2 du comp...

Watch this Scientific Journal Video about Automation of Bio-Atomic Force Microscope Measurements on Hundreds of C. albicans Cells at JoVE.com

Automation of Bio-Atomic Force Microscope Measurements on Hundreds of C. albicans Cells

Ce protocole vise à automatiser les mesures AFM sur des centaines de cellules microbiennes. Tout d’abord, les microbes sont immobilisés dans des microstructures de tampon PDMS, puis des mesures de spectroscopie de force sont effectuées automatiquement sur des centaines de cellules immobilisées.

Automatisation des mesures de microscope à force bioatomique sur des centaines de cellules de C. albicans

The method presented in this paper aims to automate Bio-AFM experiments and the recording of force curves. Using this method, it is possible to record ...

L’automatisation du microscope à force atomique est une innovation clé dans l’évolution de la technologie vers des applications biomédicales. Il ouvre également l’accès à l’étude des propriétés biomécaniques des populations cellulaires. Notre méthode permet d’enregistrer des mesures AFM pour 1 000 cellules en quatre heures, par rapport aux méthodes habituelles, qui prennent quatre heures pour mesurer 10 cellules, c’est vraiment un gain de temps significatif.Si l’automatisation est une condition préalable à l’introduction de cette technologie dans les laboratoires hospitaliers, ce protocole de validation de principe suggère son potentiel d’utilisation dans le développement de stratégies de diagnostic médical spécifiques. Ce protocole utilise une tige PDMS polyvalente qui peut être remplie de divers microbes permettant d’explorer différents systèmes. Pour préparer le tampon PDMS, mélanger 55 grammes de solution pré-polymère PDMS à un rapport de masse de 10 à un dans des PDP, des oligomères et un agent de durcissement et dégazer la solution résultante sous vide à un moment donné 10 à la négative une à une fois 10 à négative deux barres pendant cinq à 10 minutes.Lorsque toutes les bulles de pièges ont été enlevées, versez 20 grammes de la solution dégazée sur un moule maître en silicium sur une épaisseur de deux à trois millimètres et dégazez à nouveau. Lorsque toutes les bulles ont été enlevées, réticulez le PDMS à 80 degrés Celsius pendant une heure et utilisez un scalpel pour couper le tampon microstructuré PDMS parallèlement aux réseaux de microstructures visibles. Ensuite, épluchez le tampon du moule maître en silicium et placez le site de la microstructure du timbre sur une lame de verre avec les microstructures alignées sur le côté de la lame.Pour préparer les cellules pour l’appareil, centrifugez 600 microlitres de la suspension cellulaire d’intérêt et ajoutez 200 microlitres du surnageant sur le tampon. Dégazer le surnageant sous vide pendant environ 40 minutes. Lorsque toutes les bulles ont été enlevées, remplacez le surnageant de la surface PDMS par 200 microlitres de la solution cellulaire remise en suspension pour une incubation de 15 minutes à température ambiante.Pour charger les cellules dans les microstructures du timbre, utilisez une lame de verre maintenue à un angle de 30 à 50 degrés pour répartir les cellules à travers le timbre dans les deux sens, plusieurs fois si nécessaire. Lorsqu’un taux de remplissage élevé des microstructures a été atteint, utilisez une pipette pour retirer la suspension cellulaire et lavez les trois fois avec un millilitre de tampon acétate par lavage pour éliminer les cellules non piégées. Après le dernier lavage, utilisez le flux d’azote pour sécher le dos de l’échantillon et placez le tampon dans une boîte de Pétri.Ajoutez ensuite deux millilitres de tampon acétate frais au plat. Pour la microscopie à force atomique des cellules, placez la boîte sur l’étage du microscope à force atomique et centrez l’étape à zéro à zéro. Lorsque l’étape a été centrée, déplacez la boîte dans le porte-boîte de Petri au microscope et alignez le bord du tampon de manière à ce qu’il soit perpendiculaire à l’axe y du porte-boîte de Petri.Placez ensuite la tête de force du microscope atomique sur la scène, en prenant soin que les moteurs pas à pas soient suffisamment étendus pour éviter que la pointe ne s’écrase sur le tampon. Pour l’imagerie, utilisez les boutons du microscope pour centrer la pointe du microscope à force atomique sur le coin gauche des puits de micromètres de 4,5 par 4,5 au carré et sélectionnez le mode de cartographie de la force dans le logiciel du microscope. Pour définir une carte de force de 64 par 64 sur une zone de 100 par 100 micromètres, définissez le point de jeu relatif sur trois à cinq nano Newtons, la longueur Z sur quatre micromètres, le mouvement Z sur une durée constante, le temps d’extension à 0,01 seconde, le délai d’extension à zéro, le retard de rétraction à zéro, le mode de retard à force constante , le taux d’échantillonnage jusqu’à 2048 Hertz.Décochez Z boucle fermée et vérifiez l’image carrée. Réglez l’accès rapide sur 100 micromètres, l’axe lent sur 100 micromètres, le décalage X sur zéro micromètre, le décalage Y sur zéro micromètre, l’angle de grille à zéro degré, les pixels à 64 par 64 et le rapport de pixels à un à un. Ensuite, ouvrez le logiciel d’automatisation.Dans la fenêtre contextuelle, sélectionnez le chemin d’accès au fichier de script. Entrez la coordonnée W1 dans la ligne 239 de la variable P1 de la section de la zone d’entrées du script gyfon et la valeur de coordonnée W2 dans la ligne 241 de la variable P2. Attribuez la valeur de hauteur à la variable de hauteur ligne 245 du script et entrez la dimension du puits, qui peut être déterminée à partir de la conception des motifs de puits dans la ligne variable W-S 248.Écrivez le chemin d’accès au répertoire de sauvegarde à la ligne 251 pour enregistrer les données à l’endroit souhaité et définissez la ligne de variable de surface totale 254 sur le désir à plusieurs extrémités des 100 micromètres. Ensuite, définissez la ligne de matrice des courbes de force et la colonne enregistrées par puits dans la ligne variable de balayages de nombre 257 et cliquez sur exécuter pour démarrer le programme. Pour analyser les données, utilisez le logiciel de code de studio vidéo pour ouvrir le script Python et exécuter le script Python des fichiers de copie pour organiser les fichiers de courbe de force dans un dossier.Entrez le chemin d’accès au dossier général dans lequel les données seront stockées. pour analyser les courbes de force, ouvrez le logiciel de traitement de données du fabricant du microscope à force atomique. Dans le menu Fichier, sélectionnez lot de courbes de spectroscopie.Ensuite, sélectionnez le fichier et le processus de chargement, puis sélectionnez le processus de rigidité. Sélectionnez la dernière étape du processus et cliquez sur conserver et appliquer à tous afin que toutes les courbes de force reçoivent le même traitement. Pour ouvrir le script R, chargez les fichiers contenant les informations extraites avec le logiciel de traitement des données dans le logiciel R studio.Dans la fenêtre d’environnement, cliquez sur Importer le jeu de données et, à partir du lecteur de texte dans la fenêtre contextuelle, cliquez sur Parcourir pour localiser le fichier TSV à points. Une fois le fichier chargé, sélectionnez la région d’exécution du code et exécutez tout pour exécuter tout le code. Ici, des histogrammes typiques obtenus utilisant le protocole tel que démontré sont montrés.Dans cette analyse, la répartition de rigidité a été enregistrée sur 957 cellules indigènes, Tandis que dans cette analyse, la rigidité de 574 cellules traitées caspofungin ont été mesurées. Sachez que l’utilisation de centaines de cellules permet d’observer une distribution bimodale des valeurs. Dans les échantillons plus petits, une distribution unique est généralement observée et peut entraîner un manque d’observation de l’hétérogénéité de la population.Une comparaison des deux conditions met en évidence les effets de Caspofungin sur la réduction de la rigidité cellulaire. A révélé par la comparaison d’ANOVA des cellules natives et traitées, les deux conditions présentent des rigidités fortement, significativement différentes. Cette valeur a été atteinte en raison du grand nombre de cellules analysées, offrant une plus grande confiance dans les résultats obtenus.L’ajout du surnageant au tampon PDMS avant de rincer à plusieurs reprises les cellules dans les puits jusqu’à ce que le tampon soit plein est essentiel au succès de l’analyse. Dans cette preuve de concept, des cellules albicans de Candida ont été analysées mais le protocole peut être appliqué à n’importe quel groupe de cellules de modèle, molécules, ou matériaux.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Automation of Bio-Atomic Force Microscope Measurements on Hundreds of C. albicans Cells

Multiplexed Single-molecule Force Proteolysis Measurements Using Magnetic Tweezers

Multiplexée unique molécule mesures Protéolyse forcer l&#39;utilisation de pinces magnétiques

The  generation and detection of mechanical forces is a ubiquitous aspect of cell physiology,  with direct relevance to cancer metastasis1, atherogenesis2 ...

Recherche

Bio-ingénierie

Candida albicans Biofilm Chip (CaBChip) for High-throughput Antifungal Drug Screening

Candida albicans Biofilm Chip CaBChip for High-throughput Antifungal Drug Screening

Candida albicans biofilm Chip (Ca BChip) pour criblage à haut débit des médicaments antifongiques

Candida  albicans remains the main etiological agent of candidiasis, which  currently represents the fourth most common nosocomial bloodstream infection ...

Flexural Rigidity Measurements of Biopolymers Using Gliding Assays

Mesures rigidité en flexion des biopolymères en utilisant des essais de vol à voile

Microtubules are cytoskeletal polymers which  play a role in cell division, cell mechanics, and intracellular transport. Each of these functions requires ...

Biosensor for Detection of Antibiotic Resistant Staphylococcus Bacteria

Biocapteurs pour la détection de bactéries aux antibiotiques de staphylocoques résistants

A structurally transformed lytic bacteriophage having a broad host range of Staphylococcus aureus strains and a penicillin-binding protein (PBP 2a) ...

Measuring the Mechanical Properties of Living Cells Using Atomic Force Microscopy

Mesurer les propriétés mécaniques des cellules vivantes par microscopie à force atomique

Mechanical  properties of cells and extracellular matrix (ECM) play important roles in many  biological processes including stem cell differentiation, ...

Cell Patterning on Photolithographically Defined 
Parylene-C: SiO2 Substrates

Cell Patterning on Photolithographically Defined 
Parylene-C: SiO2 Substrates

Cellule structuration par photolithographie sur Défini Parylene-C: SiO<sub&gt; 2</sub&gt; Substrats

Cell patterning platforms support broad research goals, such as construction of predefined in vitro neuronal networks and the exploration of certain ...

From Fast Fluorescence Imaging to Molecular Diffusion Law on Live Cell Membranes in a Commercial Microscope

De Fluorescence Imaging rapide à moléculaire loi Diffusion sur les membranes cellulaires en direct dans un microscope commercial

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the ...

Atomic Force Microscopy Imaging and Force Spectroscopy of Supported Lipid Bilayers

Microscopie à force atomique imagerie et spectroscopie de force de bicouches lipidiques supportées

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient ...

Power Input Measurements in Stirred Bioreactors at Laboratory Scale

Mesures d’entrée de puissance dans des bioréacteurs brassées à l’échelle du laboratoire

The power input in stirred bioreactors is an important scaling-up parameter and can be measured through the torque that acts on the impeller shaft during ...

Measurement of Force-Sensitive Protein Dynamics in Living Cells Using a Combination of Fluorescent Techniques

Mesure de la dynamique des protéines sensibles à la Force dans les cellules vivantes à l’aide d’une combinaison de Techniques Fluorescent

Cells sense and respond to physical cues in their environment by converting mechanical stimuli into biochemically-detectable signals in a process called ...