Name: automation of bio-atomic force microscope measurements on hundreds of c. albicans cells
Uploaded: 2021-04-02T13:00:00
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Wir möchten FONCYCYT von CONACYT (Mexiko), dem französischen Außenministerium und der Université Paris 13 dank der finanziellen Unterstützung des internationalen Kooperationsprojekts ECOS-NORD mit dem Namen Nano-Palpation for diagnosis, No. 263337 (Mexiko) und MI5P02 (Frankreich) anerkennen. AMR bedankt sich für die finanzielle Unterstützung von SIP-IPN durch das Projekt Nr. 20195489. SPC wird durch ein PhD-Stipendium von CONACYT (Nr. 288029) und IPN durch die Cotutelle-Vereinbarung unterstützt, um ein doppeltes PhD-Zertifikat (IPN-UPS) zu erhalten. ED und CFD sind Forscher am Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS).

1. Mikrobielle Zellkultur
<ol><li>Belebung von Zellen aus einem Glycerinvorrat. HINWEIS: C. albicans werden bei -80 °C in Glycerinvorräten auf Murmeln gelagert.<ol>
<li>Wählen Sie eine Murmel in der -80 °C-Brühe und reiben Sie sie auf Hefepeptrose (YPD) Agar. Züchten Sie die Zellen für 2 Tage bei 30 °C, bevor Sie die Flüssigkeit kultivieren.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bereiten Sie flüssige Kulturen vor.<ol>
<li>Füllen Sie ein Kulturröhrchen mit 5 ml steriler YPD-Brühe und fügen Sie eine einzelne K...

<ol>
	<li>Cross, S. E., Jin, Y. S., Rao, J., Gimzewski, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanomechanical+analysis+of+cells+from+cancer+patients.">Nanomechanical analysis of cells from cancer patients.</a> Nature Nanotechnology. 2 (12), 780-783 (2007).</li><li>Dague, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+force+and+electron+microscopic-based+study+of+sarcolemmal+surface+of+living+cardiomyocytes+unveils+unexpected+mitochondrial+shift+in+heart+failure.">Atomic force and electron microscopic-based study of sarcolemmal surface of living cardiomyocytes unveils unexpected mitochondrial shift in heart failure.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 74, 162-172 (2014).</li><li>Muller, D. J., Helenius, J., Alsteens, D., Dufrene, Y. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force+probing+surfaces+of+living+cells+to+molecular+resolution.">Force probing surfaces of living cells to molecular resolution.</a> Nature Chemical Biology. 5 (6), 383-390 (2009).</li><li>Dague, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+Force+Microscopy+to+Explore+Electroporation+Effects+on+Cells.">Atomic Force Microscopy to Explore Electroporation Effects on Cells.</a> Handbook of Electroporation. , 1-13 (2016).</li><li>Puntheeranurak, T., Neundlinger, I., Kinne, R. K. H., Hinterdorfer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+recognition+force+spectroscopy+of+transmembrane+transporters+on+living+cells.">Single-molecule recognition force spectroscopy of transmembrane transporters on living cells.</a> Nature Protocols. 6 (9), 1443-1452 (2011).</li><li>Formosa, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoscale+analysis+of+the+effects+of+antibiotics+and+CX1+on+a+Pseudomonas+aeruginosa+multidrug-resistant+strain.">Nanoscale analysis of the effects of antibiotics and CX1 on a Pseudomonas aeruginosa multidrug-resistant strain.</a> Scientific Reports. 2, (2012).</li><li>Pillet, F., Chopinet, L., Formosa, C., Dague, &. #. 2. 0. 1. ;. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+Force+Microscopy+and+pharmacology:+From+microbiology+to+cancerology.">Atomic Force Microscopy and pharmacology: From microbiology to cancerology.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - General Subjects. 1840 (3), 1028-1050 (2014).</li><li>Wu, P. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+methods+to+assess+cell+mechanical+properties.">A comparison of methods to assess cell mechanical properties.</a> Nature Methods. 15 (7), 491-498 (2018).</li><li>Rigato, A., Rico, F., Eghiaian, F., Piel, M., Scheuring, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+Force+Microscopy+Mechanical+Mapping+of+Micropatterned+Cells+Shows+Adhesion+Geometry-Dependent+Mechanical+Response+on+Local+and+Global+Scales.">Atomic Force Microscopy Mechanical Mapping of Micropatterned Cells Shows Adhesion Geometry-Dependent Mechanical Response on Local and Global Scales.</a> ACS Nano. 9 (6), 5846-5856 (2015).</li><li>Favre, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parallel+AFM+imaging+and+force+spectroscopy+using+two-dimensional+probe+arrays+for+applications+in+cell+biology.">Parallel AFM imaging and force spectroscopy using two-dimensional probe arrays for applications in cell biology.</a> Journal of Molecular Recognition. 24 (3), 446-452 (2011).</li><li>Dujardin, A., Wolf, P. D., Lafont, F., Dupres, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+multi-sample+acquisition+and+analysis+using+atomic+force+microscopy+for+biomedical+applications.">Automated multi-sample acquisition and analysis using atomic force microscopy for biomedical applications.</a> PLOS ONE. 14 (3), 0213853 (2019).</li><li>Formosa, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+living+cell+arrays+for+atomic+force+microscopy+studies.">Generation of living cell arrays for atomic force microscopy studies.</a> Nature Protocols. 10 (1), 199-204 (2015).</li><li>Proa-Coronado, S., S&#233;verac, C., Martinez-Rivas, A., Dague, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+the+paradigm+of+nanomechanical+measurements+on+cells+using+AFM:+an+automated+methodology+to+rapidly+analyse+thousands+of+cells.">Beyond the paradigm of nanomechanical measurements on cells using AFM: an automated methodology to rapidly analyse thousands of cells.</a> Nanoscale Horizons. , (2019).</li><li>Foncy, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+polyurethane+and+epoxy+resist+master+mold+for+nanoscale+soft+lithography.">Comparison of polyurethane and epoxy resist master mold for nanoscale soft lithography.</a> Microelectronic Engineering. 110, 183-187 (2013).</li><li>Unsay, J. D., Cosentino, K., Garc&#237;a-S&#225;ez, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+Force+Microscopy+Imaging+and+Force+Spectroscopy+of+Supported+Lipid+Bilayers.">Atomic Force Microscopy Imaging and Force Spectroscopy of Supported Lipid Bilayers.</a> Journal of Visualized Experiments. (101), e52867 (2015).</li><li>Schiavone, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+combined+chemical+and+enzymatic+method+to+determine+quantitatively+the+polysaccharide+components+in+the+cell+wall+of+yeasts.">A combined chemical and enzymatic method to determine quantitatively the polysaccharide components in the cell wall of yeasts.</a> FEMS Yeast Research. 14 (6), 933-947 (2014).</li><li>Formosa, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoscale+Effects+of+Caspofungin+against+Two+Yeast+Species,+Saccharomyces+cerevisiae+and+Candida+albicans.">Nanoscale Effects of Caspofungin against Two Yeast Species, Saccharomyces cerevisiae and Candida albicans.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 57 (8), 3498-3506 (2013).</li><li>El-Kirat-Chatel, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoscale+analysis+of+caspofungin-induced+cell+surface+remodelling+in+Candida+albicans.">Nanoscale analysis of caspofungin-induced cell surface remodelling in Candida albicans.</a> Nanoscale. 5 (3), 1105-1115 (2013).</li><li>Peric, O., Hannebelle, M., Adams, J. D., Fantner, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+bacterial+traps+for+simultaneous+fluorescence+and+atomic+force+microscopy.">Microfluidic bacterial traps for simultaneous fluorescence and atomic force microscopy.</a> Nano Research. 10 (11), 3896-3908 (2017).</li></ol>

Die wichtigste Verbesserung, die diese Methodik bietet, ist eine signifikante Erhöhung der Anzahl der gemessenen Zellen in einem bestimmten Zeitraum. Das Gegenstück ist eine Reduzierung der Anzahl der pro Zelle gemessenen Punkte. Dies bedeutet, dass diese Methode nicht für eine detaillierte Analyse einer einzelnen Zelle ausgelegt ist. Die Methode gilt nur für Zellen, die in die Vertiefungen des PDMS-Stempels passen. Der Stempel ist sehr vielseitig, während er Vertiefungen von 1,5 x 1,5 μm2 bis zu 6 x 6 ?...

Diese Arbeit bietet eine Methodik, um automatische Kraftmessungen an Hunderten von lebenden Zellen mit einem Rasterkraftmikroskop (AFM) durchzuführen. Es bietet auch eine Methode zur Immobilisierung von Mikroben auf einem mikrostrukturierten PDMS-Stempel, die mit AFM-Experimenten kompatibel ist, die in einer flüssigen Umgebung durchgeführt werden.
Bio-AFM ist eine hochspezialisierte Technologie, die für Anwendungen in der Biologie konzipiert und dann zur Untersuchung lebender Zellen verwendet wird. Es erfordert einen ausgebildeten Ingenieur, der eine Zelle zu diesem Zeitpunkt analysieren kann. Unter diesen Bedingungen ist die Anzahl der verschiedenen Zellen, die analysiert werden können, eher klein, typische 5 bis 10 Zellen in 4-5 Stunden. Die Menge der an einer einzelnen Zelle aufgezeichneten Kraftmessungen ist jedoch in der Regel sehr hoch und kann leicht 1000 erreichen. Daher besteht das derzeitige Paradigma der AFM-Kraftmessungen an lebenden Zellen darin, Hunderte von Kraftkurven (FCs) aufzuzeichnen, jedoch auf einer begrenzten Anzahl von Zellen.
Statistisch gesehen ist dieser Ansatz fragwürdig und wirft die Frage nach der Repräsentativität der Stichprobe auf. Tatsächlich ist es beispielsweise schwierig, die Heterogenität einer Zellpopulation zu bewerten, indem man nur wenige Zellen misst, selbst wenn hunderte von Messungen an diesen wenigen Zellen aufgezeichnet werden. Auf der Grundlage dieses Paradigmas wurden jedoch große Fortschritte in der Biophysik, Mikrobiologie und Nanomedizin erzielt1,2,3. Tatsächlich hat die Nanometeranalyse auf der Skala einzelner Zellen neue Informationen über die zelluläre Nanomechanik, über die Organisation von Transmembranproteinen oder den Wirkmechanismus antimikrobieller oder krebshemmender Medikamente geliefert4,5,6,7. In jüngster Zeit sind jedoch mehrere biomechanische Hochdurchsatztests an Zellen aufgetaucht8, die das Interesse der wissenschaftlichen Gemeinschaft zeigen, dieses Paradigma zu ändern und auf die Heterogenität der Zellpopulation zuzugreifen. Diese Tests basieren alle auf mikrofluidischen Systemen, um Zellen zu verformen und ihre Verformung unter Belastung optisch zu messen, um ein indirektes Maß für ihre gesamte Oberflächenelastizität zu erhalten8. Ein wichtiges Problem bei diesen Methoden ist jedoch, dass sie monoparametrisch sind: Nur die Zellelastizität kann untersucht werden. Darüber hinaus erlauben sie keine Messung der mechanischen Parameter von adhärenten Zellen, was beispielsweise für die Untersuchung von nicht zirkulierenden Säugetierzellen oder Biofilmen einschränkend sein kann.
Ansätze mit AFM wurden von den Teams von S. Scheuring9 und M. Favre10entwickelt. Scheuring et al. immobilisierten Zellen auf Fibronektinmustern9, die einzelne Zellen zwangen, die Form des Musters anzunehmen9. Dann kartierte dieses Team die mechanischen Eigenschaften einiger Zellen, um durchschnittliche Daten zu definieren, die für 14 bis 18 Zellen repräsentativ sind. Die von Farve et al. durchgeführte Entwicklung zielte darauf ab, die Messungen durch Parallelisierung der AFM-Ausleger10 zumultiplexen. Unseres Wissens hat diese Arbeit in Multiplexrichtung nicht zu Messungen an lebenden Zellen geführt.
Ein interessanter Ansatz, der von Dujardins Team vorgeschlagen wurde, stellt ein automatisiertes AFM vor, das in der Lage ist, Zellen zu identifizieren und sie am Boden von maßgeschneiderten Vertiefungen abbilden zu können. Obwohl diese Methode nicht die Analyse einer großen Population von Zellen ermöglicht, ermöglicht sie das automatische Testen verschiedener Bedingungen in jederVertiefung 11.
Unser Ziel in dieser Arbeit ist ehrgeiziger, da wir mindestens 1000 Zellen messen wollten, um nicht auf eine durchschnittliche Zelle zuzugreifen, sondern im Gegenteil auf die Heterogenität zwischen den Zellen. Die Strategie, die wir hier entwickelt haben, um mit AFM auf Zellpopulationsheterogenität zuzugreifen, basiert auf der Analyse von Hunderten von Zellen, auf denen eine begrenzte Anzahl von Kraftkurven aufgezeichnet wird. Im Vergleich zum "klassischen" Ansatz, eine große Anzahl von Kraftkurven auf einer begrenzten Anzahl von Zellen aufzuzeichnen, sollte dieser Ansatz als komplementär betrachtet werden, da er nicht die gleichen Informationen liefert. Während die typische Methode es ermöglicht, die Heterogenität einzelner Zelloberflächen zu untersuchen, sind wir mit unserem Ansatz in der Lage, auf die gesamte Heterogenität der Zellpopulation zuzugreifen. Um dieses Ziel zu erreichen, haben wir eine Methode kombiniert, die Mikroben (hier die Hefeart Candida albicans)direkt in die Vertiefungen eines mikrostrukturierten PDMS-Stempels12immobilisiert und ein originelles Programm entwickelt, um die AFM-Spitze automatisch von Zelle zu Zelle13 zu bewegen und die mechanischen Eigenschaften jeder Zelle zu messen.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>AFM cantilever</td>
			<td>Bruker AFM probes</td>
			<td>MLCT</td>
			<td>The cantilevers used were the labeled &#8220;C&#8221; with resonant frequency of 7 to 10 kHz and k: 0.01 N/m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AFM data analysis</td>
			<td>JPK-Bruker</td>
			<td>JPK Data processing version minimum 5.1.8</td>
			<td>Can be downloaded from a JPK-Bruker user acount</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AFM Petri dishes</td>
			<td>WPI</td>
			<td>FluoroDish FD35-100</td>
			<td>The heater was used to monitor the temperature changes during the experiment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Atomic force Microscope (AFM)</td>
			<td>JPK-Bruker</td>
			<td>Nanowizard II or III</td>
			<td>the AFM should be mounted on an inverted optical microscope with a motorized stage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caspofungin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SML0425-5MG</td>
			<td>Caspofungin was used with a concentration of 4 MIC (Minimum Inhibitor Concentration)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Code editor</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td>Visual Studio Code version 1.40.1</td>
			<td>https://code.visualstudio.com/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryobeads</td>
			<td>IFU</td>
			<td>CB12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dessicator/Degassing chamber</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>15594635</td>
			<td>The equipment is used to degassing the PDMS stamps for about 50 minutes any dessicator coupled with a vaccum pump will do.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish heater</td>
			<td>JPK-Bruker</td>
			<td>PetriDishHeater</td>
			<td>This is an add-on to the JPK/Bruker AFM. The heater was used to monitor the temperature changes during the experiment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate buffer pH 5.2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7899</td>
			<td>The solution contains 18 mM sodium acetate, 1 mM CaCl2, and 1 mM MnCl2. Adjust the pH with glacial acetic acid. The solution can be stored at 4 &#176;C for 2 months</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Statistical analysis language</td>
			<td>https://www.r-project.org</td>
			<td>R version 3.6.1</td>
			<td>R is a language and environment for statistical computing and graphics. It is a GNU project which is similar to the S language and environment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Statistical analysis software</td>
			<td>https://rstudio.com</td>
			<td>R studio version 1.1.463</td>
			<td>collaboration between the R Foundation, RStudio, Microsoft, TIBCO, Google, Oracle, HP and others. RStudio and Shiny are affiliated projects of the Foundation for Open Access Statistics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard 184</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>761028</td>
			<td>Polydimethylsiloxane (PDMS) and curing agent in one set</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Peptone D Broth</td>
			<td>Difco</td>
			<td>242820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>YPD Agar</td>
			<td>Difco</td>
			<td>DF0427-17-6</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

automation of bio-atomic force microscope measurements on hundreds of c. albicans cells

Die in diesem Artikel vorgestellte Methode zielt darauf ab, Bio-AFM-Experimente und die Aufzeichnung von Kraftkurven zu automatisieren. Mit dieser Methode ist es möglich, Kräftekurven auf 1000 Zellen in 4 Stunden automatisch aufzuzeichnen. Um eine Analysezeit von 4 Stunden einzuhalten, wird die Anzahl der Kraftkurven pro Zelle auf 9 oder 16 reduziert. Die Methode kombiniert ein Jython-basiertes Programm und eine Strategie zum Zusammensetzen von Zellen auf definierten Mustern. Das Programm, das auf einem kommerziellen Bio-AFM implementiert ist, kann die Spitze auf der ersten Zelle des Arrays zentrieren und sich dann automatisch von Zelle zu Zelle bewegen, während Kraftkurven auf jeder Zelle aufgezeichnet werden. Mit dieser Methodik ist es möglich, auf die biophysikalischen Parameter der Zellen wie ihre Steifigkeit, ihre Hafteigenschaften usw. zuzugreifen. Mit der Automatisierung und der großen Anzahl der analysierten Zellen kann man auf das Verhalten der Zellpopulation zugreifen. Dies ist ein Durchbruch im Bio-AFM-Bereich, wo bisher nur Daten an wenigen Dutzend Zellen aufgezeichnet wurden.

Wir haben das beschriebene Protokoll verwendet, um die Wirkung von Caspofungin auf die biophysikalischen Eigenschaften des opportunistischen Humanpathogens C. albicans in seiner Hefeform zu analysieren. Caspofungin ist ein Antimykotikum der letzten Chance, das verwendet wird, wenn andere Medikamente aufgrund der Resistenzmechanismen, die Zellen gegenüber Antimykotika entwickeln, unwirksam sind. Sein Wirkmechanismus beruht auf der Hemmung der Untereinheit Fks2 des komplexen fks1/Fks2, der für die ß-Glucansynth...

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Automation of Bio-Atomic Force Microscope Measurements on Hundreds of C. albicans Cells

Dieses Protokoll zielt darauf ab, AFM-Messungen an Hunderten von mikrobiellen Zellen zu automatisieren. Zuerst werden Mikroben in PDMS-Stempelmikrostrukturen immobilisiert und dann werden kraftspektroskopische Messungen automatisch an Hunderten von immobilisierten Zellen durchgeführt.

Automatisierung von Bio-Rasterkraftmikroskop-Messungen an Hunderten von C. albicans-Zellen

The method presented in this paper aims to automate Bio-AFM experiments and the recording of force curves. Using this method, it is possible to record ...

Die Automatisierung des Rasterkraftmikroskops ist eine Schlüsselinnovation in der Entwicklung der Technologie hin zu biomedizinischen Anwendungen. Es eröffnet auch den Zugang zur Untersuchung der biomechanischen Eigenschaften von Zellpopulationen. Unsere Methode ermöglicht es, AFM-Messungen für 1.000 Zellen in vier Stunden aufzuzeichnen, verglichen mit den üblichen Methoden, die vier Stunden dauern, um 10 Zellen zu messen, ist dies wirklich ein erheblicher Zeitgewinn.Wenn Automatisierung eine Voraussetzung ist, um diese Technologie in Krankenhauslabore zu bringen, deutet dieses Proof-of-Concept-Protokoll auf ihr Potenzial für die Entwicklung spezifischer medizinischer Diagnosestrategien hin. Dieses Protokoll verwendet einen vielseitigen PDMS-Stamm, der mit verschiedenen Mikroben gefüllt werden kann, so dass verschiedene Systeme erforscht werden können. Um den PDMS-Stempel vorzubereiten, mischen Sie 55 Gramm PDMS-Präpolymerlösung in einem Massenverhältnis von 10 zu eins in PDMs, Oligomeren und Härter und entgasen Sie die resultierende Lösung unter Vakuum bei einmal 10 bis zum Minus eins zu eins mal 10 zu den negativen zwei Balken für fünf bis 10 Minuten.Wenn alle Fallenblasen entfernt sind, gießen Sie 20 Gramm der entgasten Lösung auf eine Silikon-Masterform auf eine Dicke von zwei bis drei Millimetern und entgasen Sie erneut. Wenn alle Blasen entfernt wurden, setzen Sie das PDMS eine Stunde lang bei 80 Grad Celsius und schneiden Sie den PDMS-Mikrostrukturstempel parallel zu den sichtbaren Mikrostrukturarrays mit einem Skalpell. Ziehen Sie dann den Stempel von der Silizium-Masterform und legen Sie die Stempel-Mikrostrukturstelle auf einen Glasträger, wobei die Mikrostrukturen an der Seite des Objektträgers ausgerichtet sind.Um die Zellen für das Gerät vorzubereiten, zentrifugieren Sie 600 Mikroliter der Zellsuspension von Interesse und fügen Sie 200 Mikroliter des Überstands auf den Stempel hinzu. Entgasen Sie den Überstand unter Vakuum für etwa 40 Minuten. Wenn alle Blasen entfernt wurden, ersetzen Sie den Überstand von der PDMS-Oberfläche durch 200 Mikroliter der resuspendierten Zelllösung für eine 15-minütige Inkubation bei Raumtemperatur.Um die Zellen in die Mikrostrukturen des Stempels zu laden, verwenden Sie einen Glasträger, der in einem Winkel von 30 bis 50 Grad gehalten wird, um die Zellen mehrmals nach Bedarf über den Stempel in beide Richtungen zu verteilen. Wenn eine hohe Füllrate der Mikrostrukturen erreicht wurde, verwenden Sie eine Pipette, um die Zellsuspension zu entfernen, und waschen Sie die dreimal mit einem Milliliter Acetatpuffer pro Waschgang, um nicht eingefangene Zellen zu entfernen. Nach dem letzten Waschen verwenden Sie Stickstofffluss, um die Rückseite der Probe zu trocknen und den Stempel in eine Petrischale zu legen.Dann fügen Sie zwei Milliliter frischen Acetatpuffer in die Schüssel. Für die Rasterkraftmikroskopie der Zellen legen Sie die Schüssel auf die Rasterkraftmikroskopstufe und zentrieren Sie die Stufe bei Null bis Null. Wenn die Bühne zentriert ist, bewegen Sie die Schüssel in den Petrischalenhalter des Mikroskops und richten Sie den Rand des Stempels so aus, dass er senkrecht zur y-Achse des Petrischalenhalters steht.Legen Sie dann den Rastermikroskop-Kraftkopf auf die Bühne und achten Sie darauf, dass die Schrittmotoren ausreichend ausgefahren sind, um zu vermeiden, dass die Spitze auf den Stempel prallt. Verwenden Sie für die Bildgebung die Mikroskopknöpfe, um die Rasterkraftmikroskopspitze über die linke Ecke der 4,5 x 4,5 Quadrat-Mikrometer-Vertiefungen zu zentrieren und wählen Sie den Kraftmapping-Modus in der Mikroskopsoftware. Um eine Kraftkarte von 64 x 64 über einen Bereich von 100 x 100 Mikrometern einzustellen, setzen Sie den relativen Sollpunkt auf drei bis fünf Nanonewton, die Z-Länge auf vier Mikrometer, die Z-Bewegung auf konstante Dauer, die Verlängerungszeit auf 0,01 Sekunden, die Verlängerungsverzögerung auf Null, die Rückzugsverzögerung auf Null, den Verzögerungsmodus auf konstante Kraft , die Abtastrate auf 2048 Hertz.Deaktivieren Sie Z closed loop und aktivieren Sie das quadratische Bild. Stellen Sie den schnellen Zugriff auf 100 Mikrometer, die langsame Achse auf 100 Mikrometer, den X-Offset auf Nullmikrometer, den Y-Offset auf null Mikrometer, den Rasterwinkel auf null Grad, die Pixel auf 64 x 64 und das Pixelverhältnis auf eins zu eins eins ein. Öffnen Sie als Nächstes die Automatisierungssoftware.Wählen Sie im Popup-Fenster den Pfad zur Skriptdatei aus. Geben Sie die W1-Koordinate in der P1-Variablenlinie 239 des Eingangsfeldabschnitts des Gyfon-Skripts und den W2-Koordinatenwert in der P2-Variablenzeile 241 ein. Ordnen Sie den Pitch-Wert der Pitch-Variablenlinie 245 des Skripts zu und geben Sie die Bohrplatzdimension ein, die aus dem Design der Bohrbrunnenmuster in die W-S-Variable Linie 248 bestimmt werden kann.Schreiben Sie den Pfad in das Speicherverzeichnis in Zeile 251, um die Daten an der gewünschten Stelle zu speichern, und setzen Sie die Gesamtflächenvariable Zeile 254 auf den Wunsch nach mehreren Enden der 100 Mikrometer. Legen Sie dann die Matrixzeile und -spalte der Kraftkurven fest, die pro Vertiefung in der Variablen Zeile 257 für Zahlenscans aufgezeichnet wurden, und klicken Sie auf Ausführen, um das Programm zu starten. Um die Daten zu analysieren, verwenden Sie die Videostudio-Code-Software, um das Python-Skript zu öffnen und das Python-Skript zum Kopieren von Dateien auszuführen, um die Kraftkurvendateien in einem Ordner zu organisieren.Geben Sie den Pfad zum allgemeinen Ordner ein, in dem die Daten gespeichert werden. Um die Kraftkurven zu analysieren, öffnen Sie die Datenverarbeitungssoftware des Rasterkraftmikroskopherstellers. Wählen Sie im Menü Datei den Stapel von Spektroskopiekurven aus.Wählen Sie als Nächstes Datei und Ladevorgang und wählen Sie den Steifigkeitsprozess aus. Wählen Sie den letzten Schritt des Prozesses aus und klicken Sie auf Behalten und auf alle anwenden, damit alle Kraftkurven die gleiche Behandlung erhalten. Um das R-Skript zu öffnen, laden Sie die Dateien mit den mit der Datenverarbeitungssoftware extrahierten Informationen in die R Studio-Software.Klicken Sie im Umgebungsfenster auf Datensatz importieren und im Popupfenster im Textleser auf Durchsuchen, um die Punkt-TSV-Datei zu suchen. Sobald die Datei geladen wurde, wählen Sie Codeausführungsregion und führen Sie alle aus, um den gesamten Code auszuführen. Hier werden typische Histogramme gezeigt, die mit dem protokolliert erhalten wurden.In dieser Analyse wurde die Steifigkeitsrepartition an 957 nativen Zellen aufgezeichnet, während in dieser Analyse die Steifigkeit von 574 mit Caspofungin behandelten Zellen gemessen wurde. Wisse, dass die Verwendung von Hunderten von Zellen eine bimodale Verteilung der zu beobachtenden Werte ermöglicht. In kleineren Stichproben wird typischerweise eine einzelne Verteilung beobachtet, die zu einer mangelnden Beobachtung der Heterogenität der Population führen kann.Ein Vergleich der beiden Bedingungen unterstreicht die Auswirkungen von Caspofungin auf die Verringerung der Zellsteifigkeit. Ein durch ANOVA-Vergleich der nativen und behandelten Zellen aufgedeckt, weisen die beiden Zustände sehr, signifikant unterschiedliche Steifigkeiten auf. Dieser Wert wurde aufgrund der großen Anzahl der analysierten Zellen erreicht, was ein größeres Vertrauen in die erhaltenen Ergebnisse bietet.Das Hinzufügen des Überstands zum PDMS-Stempel, bevor die Zellen wiederholt in die Vertiefungen gespült werden, bis der Stempel voll ist, ist entscheidend für den Erfolg der Analyse. In diesem Proof of Concept wurden Candida albicans-Zellen analysiert, aber das Protokoll kann auf jede Gruppe von Musterzellen, Molekülen oder Materialien angewendet werden.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Automation of Bio-Atomic Force Microscope Measurements on Hundreds of C. albicans Cells

Multiplexed Single-molecule Force Proteolysis Measurements Using Magnetic Tweezers

Multiplexed Einzelmolekül-Kraftspektroskopie Proteolyse Messungen mit magnetischen Pinzette

The  generation and detection of mechanical forces is a ubiquitous aspect of cell physiology,  with direct relevance to cancer metastasis1, atherogenesis2 ...

Forschung

Biotechnik

Candida albicans Biofilm Chip (CaBChip) for High-throughput Antifungal Drug Screening

Candida albicans Biofilm Chip CaBChip for High-throughput Antifungal Drug Screening

Candida albicans Biofilm Chip (Ca BChip) für das Hochdurchsatz-Screening-Antimykotikum

Candida  albicans remains the main etiological agent of candidiasis, which  currently represents the fourth most common nosocomial bloodstream infection ...

Flexural Rigidity Measurements of Biopolymers Using Gliding Assays

Biegesteifigkeit Maße von Biopolymeren mit Gliding Assays

Microtubules are cytoskeletal polymers which  play a role in cell division, cell mechanics, and intracellular transport. Each of these functions requires ...

Biosensor for Detection of Antibiotic Resistant Staphylococcus Bacteria

Biosensor zum Nachweis von Antibiotika-resistenten Staphylococcus Bakterien

A structurally transformed lytic bacteriophage having a broad host range of Staphylococcus aureus strains and a penicillin-binding protein (PBP 2a) ...

Measuring the Mechanical Properties of Living Cells Using Atomic Force Microscopy

Messung der mechanischen Eigenschaften von lebenden Zellen mit Atomic Force Microscopy

Mechanical  properties of cells and extracellular matrix (ECM) play important roles in many  biological processes including stem cell differentiation, ...

Cell Patterning on Photolithographically Defined 
Parylene-C: SiO2 Substrates

Cell Patterning on Photolithographically Defined 
Parylene-C: SiO2 Substrates

Musterbildung auf Photolithographische Definierte Parylene-C: SiO<sub&gt; 2</sub&gt; Substrate

Cell patterning platforms support broad research goals, such as construction of predefined in vitro neuronal networks and the exploration of certain ...

From Fast Fluorescence Imaging to Molecular Diffusion Law on Live Cell Membranes in a Commercial Microscope

Von Fast Fluoreszenz-Imaging, um molekulare Diffusion Gesetz über Live Cell Membrane in einem kommerziellen Mikroskop

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the ...

Atomic Force Microscopy Imaging and Force Spectroscopy of Supported Lipid Bilayers

Rasterkraftmikroskopie und Imaging Kraftspektroskopie von unterstützten Lipiddoppelschichten

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient ...

Power Input Measurements in Stirred Bioreactors at Laboratory Scale

Eingabe Leistungsmessungen in gerührten Bioreaktoren im Labormaßstab

The power input in stirred bioreactors is an important scaling-up parameter and can be measured through the torque that acts on the impeller shaft during ...

Measurement of Force-Sensitive Protein Dynamics in Living Cells Using a Combination of Fluorescent Techniques

Messung von Kraft-und Kleinschreibung Proteindynamik in lebenden Zellen mit einer Kombination von fluoreszierenden Techniken

Cells sense and respond to physical cues in their environment by converting mechanical stimuli into biochemically-detectable signals in a process called ...