Name: automation of bio-atomic force microscope measurements on hundreds of c. albicans cells
Uploaded: 2021-04-02T13:00:00
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Vogliamo riconoscere FONCYCYT di CONACYT (Messico), il Ministero degli Affari Esteri della Francia e l'Université Paris 13, anche se il supporto finanziario del progetto collaborativo internazionale ECOS-NORD ha nominato Nano-palpazione per la diagnosi, n. 263337 (Messico) e MI5P02 (Francia). AMR desidera ringraziare il sostegno finanziario di SIP-IPN attraverso il progetto n. 20195489. SPC è supportata da una borsa di dottorato di CONACYT (n. 288029) e IPN attraverso l'accordo cotutelle per ottenere un doppio certificato di dottorato (IPN-UPS). ED e CFD sono ricercatori del Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS).

1. Coltura cellulare microbica
<ol><li>Ravvivare le cellule da un calcio di glicerolo. NOTA: Gli albicani C. sono conservati a -80 °C in scorte di glicerolo, su marmi.<ol>
<li>Raccogliere un marmo nel ceppo di -80 °C e strofinarlo sull'agar peptone destrosio di lievito (YPD). Coltivare le cellule per 2 giorni a 30 °C, prima della coltivazione liquida.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparare colture liquide.<ol>
<li>Riempire un tubo di coltura con 5 ml di brodo sterile YPD e aggiungere una singola colonia di...

<ol>
	<li>Cross, S. E., Jin, Y. S., Rao, J., Gimzewski, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanomechanical+analysis+of+cells+from+cancer+patients.">Nanomechanical analysis of cells from cancer patients.</a> Nature Nanotechnology. 2 (12), 780-783 (2007).</li><li>Dague, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+force+and+electron+microscopic-based+study+of+sarcolemmal+surface+of+living+cardiomyocytes+unveils+unexpected+mitochondrial+shift+in+heart+failure.">Atomic force and electron microscopic-based study of sarcolemmal surface of living cardiomyocytes unveils unexpected mitochondrial shift in heart failure.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 74, 162-172 (2014).</li><li>Muller, D. J., Helenius, J., Alsteens, D., Dufrene, Y. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force+probing+surfaces+of+living+cells+to+molecular+resolution.">Force probing surfaces of living cells to molecular resolution.</a> Nature Chemical Biology. 5 (6), 383-390 (2009).</li><li>Dague, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+Force+Microscopy+to+Explore+Electroporation+Effects+on+Cells.">Atomic Force Microscopy to Explore Electroporation Effects on Cells.</a> Handbook of Electroporation. , 1-13 (2016).</li><li>Puntheeranurak, T., Neundlinger, I., Kinne, R. K. H., Hinterdorfer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+recognition+force+spectroscopy+of+transmembrane+transporters+on+living+cells.">Single-molecule recognition force spectroscopy of transmembrane transporters on living cells.</a> Nature Protocols. 6 (9), 1443-1452 (2011).</li><li>Formosa, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoscale+analysis+of+the+effects+of+antibiotics+and+CX1+on+a+Pseudomonas+aeruginosa+multidrug-resistant+strain.">Nanoscale analysis of the effects of antibiotics and CX1 on a Pseudomonas aeruginosa multidrug-resistant strain.</a> Scientific Reports. 2, (2012).</li><li>Pillet, F., Chopinet, L., Formosa, C., Dague, &. #. 2. 0. 1. ;. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+Force+Microscopy+and+pharmacology:+From+microbiology+to+cancerology.">Atomic Force Microscopy and pharmacology: From microbiology to cancerology.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - General Subjects. 1840 (3), 1028-1050 (2014).</li><li>Wu, P. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+methods+to+assess+cell+mechanical+properties.">A comparison of methods to assess cell mechanical properties.</a> Nature Methods. 15 (7), 491-498 (2018).</li><li>Rigato, A., Rico, F., Eghiaian, F., Piel, M., Scheuring, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+Force+Microscopy+Mechanical+Mapping+of+Micropatterned+Cells+Shows+Adhesion+Geometry-Dependent+Mechanical+Response+on+Local+and+Global+Scales.">Atomic Force Microscopy Mechanical Mapping of Micropatterned Cells Shows Adhesion Geometry-Dependent Mechanical Response on Local and Global Scales.</a> ACS Nano. 9 (6), 5846-5856 (2015).</li><li>Favre, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parallel+AFM+imaging+and+force+spectroscopy+using+two-dimensional+probe+arrays+for+applications+in+cell+biology.">Parallel AFM imaging and force spectroscopy using two-dimensional probe arrays for applications in cell biology.</a> Journal of Molecular Recognition. 24 (3), 446-452 (2011).</li><li>Dujardin, A., Wolf, P. D., Lafont, F., Dupres, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+multi-sample+acquisition+and+analysis+using+atomic+force+microscopy+for+biomedical+applications.">Automated multi-sample acquisition and analysis using atomic force microscopy for biomedical applications.</a> PLOS ONE. 14 (3), 0213853 (2019).</li><li>Formosa, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+living+cell+arrays+for+atomic+force+microscopy+studies.">Generation of living cell arrays for atomic force microscopy studies.</a> Nature Protocols. 10 (1), 199-204 (2015).</li><li>Proa-Coronado, S., S&#233;verac, C., Martinez-Rivas, A., Dague, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+the+paradigm+of+nanomechanical+measurements+on+cells+using+AFM:+an+automated+methodology+to+rapidly+analyse+thousands+of+cells.">Beyond the paradigm of nanomechanical measurements on cells using AFM: an automated methodology to rapidly analyse thousands of cells.</a> Nanoscale Horizons. , (2019).</li><li>Foncy, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+polyurethane+and+epoxy+resist+master+mold+for+nanoscale+soft+lithography.">Comparison of polyurethane and epoxy resist master mold for nanoscale soft lithography.</a> Microelectronic Engineering. 110, 183-187 (2013).</li><li>Unsay, J. D., Cosentino, K., Garc&#237;a-S&#225;ez, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+Force+Microscopy+Imaging+and+Force+Spectroscopy+of+Supported+Lipid+Bilayers.">Atomic Force Microscopy Imaging and Force Spectroscopy of Supported Lipid Bilayers.</a> Journal of Visualized Experiments. (101), e52867 (2015).</li><li>Schiavone, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+combined+chemical+and+enzymatic+method+to+determine+quantitatively+the+polysaccharide+components+in+the+cell+wall+of+yeasts.">A combined chemical and enzymatic method to determine quantitatively the polysaccharide components in the cell wall of yeasts.</a> FEMS Yeast Research. 14 (6), 933-947 (2014).</li><li>Formosa, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoscale+Effects+of+Caspofungin+against+Two+Yeast+Species,+Saccharomyces+cerevisiae+and+Candida+albicans.">Nanoscale Effects of Caspofungin against Two Yeast Species, Saccharomyces cerevisiae and Candida albicans.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 57 (8), 3498-3506 (2013).</li><li>El-Kirat-Chatel, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoscale+analysis+of+caspofungin-induced+cell+surface+remodelling+in+Candida+albicans.">Nanoscale analysis of caspofungin-induced cell surface remodelling in Candida albicans.</a> Nanoscale. 5 (3), 1105-1115 (2013).</li><li>Peric, O., Hannebelle, M., Adams, J. D., Fantner, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+bacterial+traps+for+simultaneous+fluorescence+and+atomic+force+microscopy.">Microfluidic bacterial traps for simultaneous fluorescence and atomic force microscopy.</a> Nano Research. 10 (11), 3896-3908 (2017).</li></ol>

Il principale miglioramento fornito da questa metodologia è un aumento significativo del numero di cellule misurate in un determinato lasso di tempo. La controparte è una riduzione del numero di punti misurati per cella. Significa che questo metodo non è progettato per fornire un'analisi dettagliata di una singola cella. Il metodo si applica solo alle celle che possono essere adatte ai pozzi del timbro PDMS. Il timbro è abbastanza versatile, mentre contiene pozzi di 1,5 x 1,5 μm2 fino a 6 x 6 μm2</s...

Questo lavoro fornisce una metodologia per eseguire misurazioni automatiche della forza su centinaia di cellule viventi utilizzando un microscopio a forza atomica (AFM). Fornisce anche un metodo per immobilizzare i microbi su un timbro microstrutturato PDMS compatibile con gli esperimenti AFM condotti in un ambiente liquido.
Bio-AFM è una tecnologia altamente specializzata concepita per applicazioni in biologia e poi utilizzata per studiare le cellule viventi. Richiede un ingegnere addestrato in grado di analizzare una cella alla volta. In queste condizioni, il numero di cellule diverse che possono essere analizzate è piuttosto piccolo, tipico da 5 a 10 cellule in 4-5 ore. Tuttavia, la quantità di misurazioni della forza registrate su una singola cella è solitamente molto alta e può facilmente raggiungere 1000. Pertanto, l'attuale paradigma delle misurazioni della forza AFM sulle cellule viventi è registrare centinaia di curve di forza (HC) ma su un numero limitato di cellule.
Statisticamente, questo approccio è discutibile e solleva la questione della rappresentatività del campione. In effetti, è difficile, ad esempio, valutare l'eterogeneità di una popolazione cellulare misurando solo poche cellule, anche se su queste poche cellule vengono registrate centinaia di misurazioni. Tuttavia, è sulla base di questo paradigma che sono stati fatti importanti progressi in biofisica, microbiologia e nanomedicina1,2,3. Infatti, l'analisi nanometrica su scala di singole cellule ha fornito nuove informazioni sulla nanomeccanica cellulare, sull'organizzazione delle proteine transmembrana, o sul meccanismo d'azione dei farmaci antimicrobici o anticancro4,5,6,7. Recentemente, tuttavia, sono emersi diversi test biomeccanici ad alta produttività condottisu cellule 8, che mostrano l'interesse della comunità scientifica a cambiare questo paradigma e ad accedere all'eterogeneità della popolazione cellulare. Tutti questi test si basano su sistemi microfluidici per deformare le cellule e misurarne otticamente la deformazione sotto stress per ottenere una misura indiretta della loro elasticità superficialecomplessiva 8. Tuttavia, una questione importante con questi metodi è che sono mono-parametrici: solo l'elasticità cellulare può essere sondata. Inoltre, non consentono la misurazione dei parametri meccanici delle cellule aderenti, che possono essere limitanti per gli studi di cellule di mammifero non circolanti o biofilm, ad esempio.
Gli approcci che coinvolgono AFM sono stati sviluppati dai team di S. Scheuring9 e M. Favre10. cellule immobilizzate su modelli di fibronectina9,costringendo le singole cellule a prendere la forma del modello9. Quindi questo team ha mappato le proprietà meccaniche di alcune celle per definire i dati medi, rappresentativi da 14 a 18 celle. Lo sviluppo effettuato da Farve et al. Per quanto ne siamo a conoscenza, questo lavoro nella direzione del multiplexing non ha portato a misurazioni su cellule viventi.
Un approccio interessante proposto dal team di Dujardin presenta un AFM automatizzato in grado di identificare le cellule e di identificarle nella parte inferiore di pozzi su misura. Sebbene questo metodo non consenta l'analisi di una grande popolazione di cellule, consente il test automatico di condizioni diverse in ogni pozzo11.
Il nostro obiettivo in questo lavoro è più ambizioso poiché volevamo misurare almeno 1000 cellule per accedere non a una cellula media, ma, al contrario, all'eterogeneità tra le cellule. La strategia che abbiamo sviluppato qui per accedere all'eterogeneità della popolazione cellulare usando AFM si basa sull'analisi di centinaia di cellule su cui viene registrato un numero limitato di curve di forza. Rispetto all'approccio "classico" di registrare un gran numero di curve di forza su un numero limitato di celle, questo approccio dovrebbe essere considerato complementare in quanto non fornisce le stesse informazioni. Infatti, mentre il metodo tipico consente di sondare l'eterogeneità della superficie cellulare individuale, utilizzando il nostro approccio, siamo in grado di accedere all'intera eterogeneità della popolazione cellulare. Per raggiungere questo obiettivo, abbiamo combinato un metodo che immobilizza direttamente i microbi (qui la specie di lievito Candida albicans)nei pozzi di un timbro microstrutturato PDMS12, esviluppa un programma originale per spostare la punta AFM, automaticamente, dalla cella allacella 13 e misurare le proprietà meccaniche di ogni cellula.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>AFM cantilever</td>
			<td>Bruker AFM probes</td>
			<td>MLCT</td>
			<td>The cantilevers used were the labeled &#8220;C&#8221; with resonant frequency of 7 to 10 kHz and k: 0.01 N/m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AFM data analysis</td>
			<td>JPK-Bruker</td>
			<td>JPK Data processing version minimum 5.1.8</td>
			<td>Can be downloaded from a JPK-Bruker user acount</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AFM Petri dishes</td>
			<td>WPI</td>
			<td>FluoroDish FD35-100</td>
			<td>The heater was used to monitor the temperature changes during the experiment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Atomic force Microscope (AFM)</td>
			<td>JPK-Bruker</td>
			<td>Nanowizard II or III</td>
			<td>the AFM should be mounted on an inverted optical microscope with a motorized stage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caspofungin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SML0425-5MG</td>
			<td>Caspofungin was used with a concentration of 4 MIC (Minimum Inhibitor Concentration)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Code editor</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td>Visual Studio Code version 1.40.1</td>
			<td>https://code.visualstudio.com/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryobeads</td>
			<td>IFU</td>
			<td>CB12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dessicator/Degassing chamber</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>15594635</td>
			<td>The equipment is used to degassing the PDMS stamps for about 50 minutes any dessicator coupled with a vaccum pump will do.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish heater</td>
			<td>JPK-Bruker</td>
			<td>PetriDishHeater</td>
			<td>This is an add-on to the JPK/Bruker AFM. The heater was used to monitor the temperature changes during the experiment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate buffer pH 5.2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7899</td>
			<td>The solution contains 18 mM sodium acetate, 1 mM CaCl2, and 1 mM MnCl2. Adjust the pH with glacial acetic acid. The solution can be stored at 4 &#176;C for 2 months</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Statistical analysis language</td>
			<td>https://www.r-project.org</td>
			<td>R version 3.6.1</td>
			<td>R is a language and environment for statistical computing and graphics. It is a GNU project which is similar to the S language and environment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Statistical analysis software</td>
			<td>https://rstudio.com</td>
			<td>R studio version 1.1.463</td>
			<td>collaboration between the R Foundation, RStudio, Microsoft, TIBCO, Google, Oracle, HP and others. RStudio and Shiny are affiliated projects of the Foundation for Open Access Statistics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard 184</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>761028</td>
			<td>Polydimethylsiloxane (PDMS) and curing agent in one set</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Peptone D Broth</td>
			<td>Difco</td>
			<td>242820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>YPD Agar</td>
			<td>Difco</td>
			<td>DF0427-17-6</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

automation of bio-atomic force microscope measurements on hundreds of c. albicans cells

Il metodo presentato in questo documento mira ad automatizzare gli esperimenti Bio-AFM e la registrazione delle curve di forza. Utilizzando questo metodo, è possibile registrare automaticamente le curve di forza su 1000 celle in 4 ore. Per mantenere un tempo di analisi di 4 ore, il numero di curve di forza per cella viene ridotto a 9 o 16. Il metodo combina un programma basato su Jython e una strategia per assemblare celle su modelli definiti. Il programma, implementato su un Bio-AFM commerciale, può centrare la punta sulla prima cella dell'array e quindi spostarsi, automaticamente, da cella a cella durante la registrazione delle curve di forza su ogni cella. Utilizzando questa metodologia, è possibile accedere ai parametri biofisici delle cellule come la loro rigidità, le loro proprietà adesive, ecc. Con l'automazione e il gran numero di celle analizzate, si può accedere al comportamento della popolazione cellulare. Si tratta di una svolta nel campo bio-AFM, dove finora sono stati registrati dati solo su poche decine di cellule.

Abbiamo usato il protocollo descritto per analizzare l'effetto della caspofungina sulle proprietà biofisiche dell'agente patogeno umano opportunistico C. albicans nella sua forma di lievito. Caspofungin è un'ultima molecola antimicotico utilizzata quando altri farmaci sono inefficaci a causa dei meccanismi di resistenza che le cellule sviluppano verso gli antifungini. Il suo meccanismo d'azione si basa sull'inibizione della subunità Fks2 del complesso fks1/Fks2 responsabile della sintesi ß glucano. Poiché i...

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Automation of Bio-Atomic Force Microscope Measurements on Hundreds of C. albicans Cells

Questo protocollo mira ad automatizzare le misurazioni AFM su centinaia di cellule microbiche. In primo luogo, i microbi vengono immobilizzati nelle microstrutture di francobolli PDMS e quindi le misurazioni della spettroscopia di forza vengono eseguite automaticamente su centinaia di cellule immobilizzate.

Automazione delle misurazioni del microscopio a forza bio-atomica su centinaia di cellule C. albicans

The method presented in this paper aims to automate Bio-AFM experiments and the recording of force curves. Using this method, it is possible to record ...

L'automazione del microscopio a forza atomica è un'innovazione chiave nell'evoluzione della tecnologia verso applicazioni biomediche. Apre inoltre l'accesso allo studio delle proprietà biomeccaniche delle popolazioni cellulari. Il nostro metodo consente di registrare le misurazioni AFM per 1.000 cellule in quattro ore, rispetto ai metodi usuali, che ci vengono necessarie quattro ore per misurare 10 cellule, questo è davvero un guadagno significativo di tempo.Se l'automazione è un prerequisito per portare questa tecnologia nei laboratori ospedalieri, questo protocollo proof of concept suggerisce il suo potenziale per l'uso nello sviluppo di specifiche strategie diagnostiche mediche. Questo protocollo utilizza uno stelo PDMS versatile che può essere riempito con vari microbi che consentono di esplorare diversi sistemi. Per preparare il timbro PDMS, mescolare 55 grammi di soluzione prepolimeria PDMS con un rapporto di massa 10 a uno in PDM, oligomeri e agente polimerizzante e degasare la soluzione risultante sotto vuoto a uno per 10 a quello negativo a uno per 10 alle due barre negative per cinque-10 minuti.Quando tutte le trappole sono state rimosse, versare 20 grammi della soluzione degassata su uno stampo master in silicio a uno spessore da due a tre millimetri e degasare di nuovo. Una volta rimosse tutte le bolle, reticolare il PDMS a 80 gradi Celsius per un'ora e utilizzare un bisturi per tagliare il timbro micro strutturato PDMS parallelo agli array di microstrutture visibili. Quindi sbucciare il timbro dallo stampo principale in silicio e posizionare il sito della microstruttura del timbro su uno scivolo di vetro con le micro strutture allineate con il lato della diapositiva.Per preparare le celle per il dispositivo, centrifugare 600 microlitri della sospensione cellulare di interesse e aggiungere 200 microlitri del supernatante sul timbro. Degasare il supernatante sotto vuoto per circa 40 minuti. Una volta rimosse tutte le bolle, sostituire il supernatante dalla superficie PDMS con 200 microlitri della soluzione cellulare rimorsinata per un'incubazione di 15 minuti a temperatura ambiente.Per caricare le celle nelle micro strutture del timbro, utilizzare una diapositiva di vetro tenuta con un angolo da 30 a 50 gradi per distribuire le celle attraverso il timbro in entrambe le direzioni, più volte se necessario. Quando è stata raggiunta un'elevata velocità di riempimento delle microstrutture, utilizzare una pipetta per rimuovere la sospensione cellulare e lavare tre volte con un millilitro di tampone di acetato per lavaggio per rimuovere eventuali celle non tracciate. Dopo l'ultimo lavaggio, utilizzare il flusso di azoto per asciugare la parte posteriore del campione e posizionare il timbro in una piastra di Petri.Quindi aggiungere due millilitri di tampone di acetato fresco al piatto. Per la microscopia a forza atomica delle cellule, posizionare il piatto sullo stadio del microscopio a forza atomica e centrare lo stadio da zero a zero. Una volta centrato il palco, spostare la piastra nel supporto della piastra di Petri al microscopio e allineare il bordo del timbro in modo che sia perpendicolare all'asse y del portapiacchi di Petri.Quindi posizionare la testa di forza del microscopio atomico sul palco, facendo attenzione che i motori stepper siano sufficientemente estesi per evitare che la punta si schianti sul timbro. Per l'imaging, utilizzare le manopole del microscopio per centrare la punta del microscopio a forza atomica sull'angolo sinistro dei pozzi del micrometro quadrati da 4,5 per 4,5 e selezionare la modalità di mappatura della forza nel software del microscopio. Per impostare una mappa di forza 64 per 64 su un'area di 100 per 100 micrometri, impostare il set point relativo su tre o cinque nano Newton, la lunghezza Z a quattro micrometri, il movimento Z a durata costante, il tempo di estensione a 0,01 secondi, il ritardo di estensione a zero, il ritardo di retrazione a zero, la modalità di ritardo alla forza costante , la frequenza di campionamento a 2048 Hertz.Deselezionare Z ciclo chiuso e controllare l'immagine quadrata. Impostare l'accesso rapido a 100 micrometri, l'asse lento a 100 micrometri, l'offset X a zero micrometri, l'offset Y a zero micrometri, l'angolo della griglia a zero gradi, i pixel a 64 per 64 e il rapporto pixel a uno a uno. Aprire quindi il software di automazione.Nella finestra popup selezionare il percorso verso il file di script. Immettete la coordinata W1 nella linea variabile P1 239 della sezione della casella di input dello script gyfon e il valore della coordinata W2 nella linea variabile P2 241. Attribui il valore di intonazione alla linea variabile di passo 245 dello script e inserisci la dimensione del pozzo, che può essere determinata dalla progettazione dei modelli di pozzo nella linea variabile W-S 248.Scrivere il percorso della directory di salvataggio nella riga 251 per salvare i dati nel punto desiderato e impostare la linea variabile dell'area totale 254 sul desiderio di più estremità dei 100 micrometri. Quindi impostare la riga della matrice delle curve di forza e la colonna registrata per pozzo nella linea variabile 257 di scand elenco numeri e fare clic su Esegui per avviare il programma. Per analizzare i dati, usa il software di codice dello studio video per aprire lo script Python ed eseguire lo script Python dei file di copia per organizzare i file della curva di forza in un'unica cartella.Immettere il percorso della cartella generale in cui verranno archiviati i dati. per analizzare le curve di forza, aprire il software di elaborazione dei dati del produttore del microscopio a forza atomica. Nel menu file, selezionate batch di curve di spettroscopia.Selezionare quindi il processo di file e caricamento e selezionare il processo di rigidità. Selezionare l'ultimo passaggio del processo e fare clic su Mantieni e applica a tutti in modo che tutte le curve di forza ricevano lo stesso trattamento. Per aprire lo script R, caricare i file contenenti le informazioni estratte con il software di elaborazione dati nel software R studio.Nella finestra dell'ambiente fare clic su Importa set di dati e dal lettore di testo nella finestra popup fare clic su sfoglia per individuare il file TSV punto. Una volta caricato il file, selezionare l'area di esecuzione del codice ed eseguire tutto per eseguire tutto il codice. Qui vengono mostrati gli istogrammi tipici ottenuti utilizzando il protocollo come dimostrato.In questa analisi, la ripartizione della rigidità è stata registrata su 957 cellule native, mentre in questa analisi è stata misurata la rigidità di 574 cellule trattate con caspofungin. Sappiate che l'utilizzo di centinaia di cellule consente di osservare una distribuzione bidomobile dei valori. Nei campioni più piccoli, una singola distribuzione è tipicamente osservata e può causare la mancanza di osservazione dell'eterogeneità della popolazione.Un confronto delle due condizioni evidenzia gli effetti di Caspofungin sulla riduzione della rigidità cellulare. Rivelato dal confronto ANOVA delle cellule native e trattate, le due condizioni mostrano rigidità molto, significativamente diverse. Questo valore è stato raggiunto a causa del gran numero di cellule analizzate, fornendo una maggiore fiducia nei risultati ottenuti.L'aggiunta del supernatante al timbro PDMS prima di sciacquare ripetutamente le celle nei pozzi fino a quando il timbro non è pieno, è fondamentale per il successo dell'analisi. In questa dimostrazione di concetto, le cellule di Candida albicans sono state analizzate, ma il protocollo può essere applicato a qualsiasi gruppo di cellule pattern, molecole o materiali.

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Cell patterning platforms support broad research goals, such as construction of predefined in vitro neuronal networks and the exploration of certain ...

From Fast Fluorescence Imaging to Molecular Diffusion Law on Live Cell Membranes in a Commercial Microscope

Da Veloce imaging di fluorescenza di Molecular legge Diffusione su membrane cellulare dal vivo in un microscopio commerciale

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the ...

Atomic Force Microscopy Imaging and Force Spectroscopy of Supported Lipid Bilayers

Atomic Force Microscopy Imaging e Spettroscopia Forza supportati doppi strati lipidici

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient ...

Power Input Measurements in Stirred Bioreactors at Laboratory Scale

Misure di potenza ingresso in bioreattori agitate a scala di laboratorio

The power input in stirred bioreactors is an important scaling-up parameter and can be measured through the torque that acts on the impeller shaft during ...

Measurement of Force-Sensitive Protein Dynamics in Living Cells Using a Combination of Fluorescent Techniques

Misurazione delle dinamiche di sensibili alla forza della proteina in cellule viventi, utilizzando una combinazione di tecniche di fluorescenza

Cells sense and respond to physical cues in their environment by converting mechanical stimuli into biochemically-detectable signals in a process called ...