Name: automation of bio-atomic force microscope measurements on hundreds of c. albicans cells
Uploaded: 2021-04-02T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Automation of Bio-Atomic Force Microscope Measurements on Hundreds of C. albicans Cells at JoVE.com

我々は、コナシト(メキシコ)、フランス外務省、パリ大学13のFONCYCYTを認めたいが、診断のためのナノ触診、No.263337(メキシコ)とMI5P02(フランス)と名付けられた国際的な共同ECOS-NORDプロジェクトの財政支援。AMRは、プロジェクトNo.20195489を通じてSIP-IPNの財政的支援に感謝したいと思います。SPCは、コチュテッレ契約を通じてCONACYT(288029第1)とIPNの博士課程のフェローシップによってサポートされ、二重PhD証明書(IPN-UPS)を取得します。EDとCFDは、センター・ナショナル・デ・ラ・レシェルシュ・サイエンティフィック(CNRS)の研究者です。

1. 微生物細胞培養
<ol><li>グリセロールストックから細胞を再び再生します。 注 :C.アルビカンは 、大理石の上に、グリセロールストックで-80°Cで保存されています。<ol>
<li>80°Cストックの大理石を選び、酵母ペプトンデキストロース(YPD)寒天にこすります。液体培養前に30°Cで2日間細胞を増殖させます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>液体培養を準備します。<ol>
<li>培養管に5 mLの無菌YPDブロスを...

<ol>
	<li>Cross, S. E., Jin, Y. S., Rao, J., Gimzewski, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanomechanical+analysis+of+cells+from+cancer+patients.">Nanomechanical analysis of cells from cancer patients.</a> Nature Nanotechnology. 2 (12), 780-783 (2007).</li><li>Dague, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+force+and+electron+microscopic-based+study+of+sarcolemmal+surface+of+living+cardiomyocytes+unveils+unexpected+mitochondrial+shift+in+heart+failure.">Atomic force and electron microscopic-based study of sarcolemmal surface of living cardiomyocytes unveils unexpected mitochondrial shift in heart failure.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 74, 162-172 (2014).</li><li>Muller, D. J., Helenius, J., Alsteens, D., Dufrene, Y. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force+probing+surfaces+of+living+cells+to+molecular+resolution.">Force probing surfaces of living cells to molecular resolution.</a> Nature Chemical Biology. 5 (6), 383-390 (2009).</li><li>Dague, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+Force+Microscopy+to+Explore+Electroporation+Effects+on+Cells.">Atomic Force Microscopy to Explore Electroporation Effects on Cells.</a> Handbook of Electroporation. , 1-13 (2016).</li><li>Puntheeranurak, T., Neundlinger, I., Kinne, R. K. H., Hinterdorfer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+recognition+force+spectroscopy+of+transmembrane+transporters+on+living+cells.">Single-molecule recognition force spectroscopy of transmembrane transporters on living cells.</a> Nature Protocols. 6 (9), 1443-1452 (2011).</li><li>Formosa, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoscale+analysis+of+the+effects+of+antibiotics+and+CX1+on+a+Pseudomonas+aeruginosa+multidrug-resistant+strain.">Nanoscale analysis of the effects of antibiotics and CX1 on a Pseudomonas aeruginosa multidrug-resistant strain.</a> Scientific Reports. 2, (2012).</li><li>Pillet, F., Chopinet, L., Formosa, C., Dague, &. #. 2. 0. 1. ;. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+Force+Microscopy+and+pharmacology:+From+microbiology+to+cancerology.">Atomic Force Microscopy and pharmacology: From microbiology to cancerology.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - General Subjects. 1840 (3), 1028-1050 (2014).</li><li>Wu, P. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+methods+to+assess+cell+mechanical+properties.">A comparison of methods to assess cell mechanical properties.</a> Nature Methods. 15 (7), 491-498 (2018).</li><li>Rigato, A., Rico, F., Eghiaian, F., Piel, M., Scheuring, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+Force+Microscopy+Mechanical+Mapping+of+Micropatterned+Cells+Shows+Adhesion+Geometry-Dependent+Mechanical+Response+on+Local+and+Global+Scales.">Atomic Force Microscopy Mechanical Mapping of Micropatterned Cells Shows Adhesion Geometry-Dependent Mechanical Response on Local and Global Scales.</a> ACS Nano. 9 (6), 5846-5856 (2015).</li><li>Favre, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parallel+AFM+imaging+and+force+spectroscopy+using+two-dimensional+probe+arrays+for+applications+in+cell+biology.">Parallel AFM imaging and force spectroscopy using two-dimensional probe arrays for applications in cell biology.</a> Journal of Molecular Recognition. 24 (3), 446-452 (2011).</li><li>Dujardin, A., Wolf, P. D., Lafont, F., Dupres, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+multi-sample+acquisition+and+analysis+using+atomic+force+microscopy+for+biomedical+applications.">Automated multi-sample acquisition and analysis using atomic force microscopy for biomedical applications.</a> PLOS ONE. 14 (3), 0213853 (2019).</li><li>Formosa, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+living+cell+arrays+for+atomic+force+microscopy+studies.">Generation of living cell arrays for atomic force microscopy studies.</a> Nature Protocols. 10 (1), 199-204 (2015).</li><li>Proa-Coronado, S., S&#233;verac, C., Martinez-Rivas, A., Dague, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+the+paradigm+of+nanomechanical+measurements+on+cells+using+AFM:+an+automated+methodology+to+rapidly+analyse+thousands+of+cells.">Beyond the paradigm of nanomechanical measurements on cells using AFM: an automated methodology to rapidly analyse thousands of cells.</a> Nanoscale Horizons. , (2019).</li><li>Foncy, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+polyurethane+and+epoxy+resist+master+mold+for+nanoscale+soft+lithography.">Comparison of polyurethane and epoxy resist master mold for nanoscale soft lithography.</a> Microelectronic Engineering. 110, 183-187 (2013).</li><li>Unsay, J. D., Cosentino, K., Garc&#237;a-S&#225;ez, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+Force+Microscopy+Imaging+and+Force+Spectroscopy+of+Supported+Lipid+Bilayers.">Atomic Force Microscopy Imaging and Force Spectroscopy of Supported Lipid Bilayers.</a> Journal of Visualized Experiments. (101), e52867 (2015).</li><li>Schiavone, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+combined+chemical+and+enzymatic+method+to+determine+quantitatively+the+polysaccharide+components+in+the+cell+wall+of+yeasts.">A combined chemical and enzymatic method to determine quantitatively the polysaccharide components in the cell wall of yeasts.</a> FEMS Yeast Research. 14 (6), 933-947 (2014).</li><li>Formosa, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoscale+Effects+of+Caspofungin+against+Two+Yeast+Species,+Saccharomyces+cerevisiae+and+Candida+albicans.">Nanoscale Effects of Caspofungin against Two Yeast Species, Saccharomyces cerevisiae and Candida albicans.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 57 (8), 3498-3506 (2013).</li><li>El-Kirat-Chatel, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoscale+analysis+of+caspofungin-induced+cell+surface+remodelling+in+Candida+albicans.">Nanoscale analysis of caspofungin-induced cell surface remodelling in Candida albicans.</a> Nanoscale. 5 (3), 1105-1115 (2013).</li><li>Peric, O., Hannebelle, M., Adams, J. D., Fantner, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+bacterial+traps+for+simultaneous+fluorescence+and+atomic+force+microscopy.">Microfluidic bacterial traps for simultaneous fluorescence and atomic force microscopy.</a> Nano Research. 10 (11), 3896-3908 (2017).</li></ol>

この方法論によって提供される主な改善は、一定の時間で測定された細胞の数の有意な増加である。対応する値は、セル当たりのポイント数の減少です。これは、この方法が単一のセルの詳細な分析を提供するように設計されていないことを意味します。この方法は、PDMS スタンプのウェルに収まるセルにのみ適用されます。スタンプは非常に汎用性が高く、1.5 x 1.5 μm2 のウェルが 6 ...

この研究は、原子間力顕微鏡(AFM)を用いて何百もの生きた細胞に対して自動力測定を行う方法を提供する。また、液体環境で行われたAFM実験と互換性のあるPDMSマイクロストラクチャードスタンプ上の微生物を固定化する方法も提供します。
バイオAFMは生物学の応用のために考案された高度に専門化された技術であり、その後、生きた細胞を研究するために使用されます。その時に1つの細胞を分析できる訓練を受けたエンジニアが必要です。これらの条件では、分析できる異なる細胞の数は、むしろ少なく、4〜5時間で典型的な5〜10個の細胞である。しかし、単一のセルに記録された力の量は通常非常に高く、簡単に1000に達することができます。したがって、現在の生細胞のAFM力測定のパラダイムは、数百の力曲線(FC)を記録するが、限られた数の細胞に記録する。
統計的には、このアプローチは疑わしく、サンプルの代表的な問題を提起します。実際、数百個の測定が数百個の細胞に記録されていても、例えば、数個の細胞のみを測定して細胞集団の不均一性を評価することは困難である。しかし、生物物理学、微生物学、ナノメディシン1、2、3において大きな進歩がなされたのはこのパラダイムに基づいています。実際、単一細胞の規模でのナノメートル分析は、細胞ナノメカニクスに関する新しい情報を提供し、膜貫通タンパク質の組織、または抗菌薬または抗癌剤の作用機構4、5、6、7を提供している。しかし最近、細胞に対して行われたいくつかのハイスループットバイオメカニカル試験が8に出現し、このパラダイムを変え、細胞集団の不均一性にアクセスすることに対する科学界の関心を示している。これらのテストはすべて、マイクロ流体システムに依存して細胞を変形させ、応力下での変形を光学的に測定して、表面全体の弾性8の間接的な尺度を得る。しかし、これらの方法の重要な問題は、それらがモノパラメトリックであるということです:唯一の細胞の弾力性をプローブすることができます。さらに、それらは、例えば非循環哺乳類細胞またはバイオフィルムの研究のために制限することができる接着細胞の機械的パラメータの測定を可能にしない。
AFMを含むアプローチは、S.シューリング9 とM.ファーヴル10のチームによって開発されました。Scheuringら. フィブロネクチンパターン9上の固定化細胞は、個々の細胞がパターン9の形状を取ることを強制する。その後、このチームは、14〜18個のセルを代表する平均データを定義するために、いくつかのセルの機械的特性をマッピングしました。Farveららによって行われた開発は、AFM片持ち10を並列化して測定値を多重化することを目的とした。私たちの知る限りでは、多重化方向のこの研究は、生きている細胞の測定につながっていません。
Dujardinのチームが提案した興味深いアプローチは、細胞を識別し、カスタムメイドの井戸の底でそれらをイメージングすることができる自動化されたAFMを提示します。この方法では、細胞の大規模な集団の分析を可能にしませんが、それは各ウェル11で異なる条件の自動テストを可能にします。
この研究における私たちの目的は、平均細胞ではなく、逆に細胞間の不均一性にアクセスするために少なくとも1000個の細胞を測定したかったので、より野心的です。ここで AFM を用いて細胞集団の不均一性にアクセスするために開発した戦略は、限られた数の力曲線が記録されている数百の細胞の分析に基づいています。限られた数のセルに多数の力曲線を記録する「古典的な」アプローチと比較して、このアプローチは同じ情報を提供しないので、補完的なものとして考慮されるべきです。実際、典型的な方法では個々の細胞表面の不均一性を探査することができますが、我々のアプローチを使用して、細胞集団全体の不均一性にアクセスすることができます。この目的を達成するために、微生物(ここでは酵母種 カンジダ・アルビカンス)をPDMSマイクロストラクチャースタンプ12の井戸に直接固定化する方法を組み合わせ、AFM先端を自動的に細胞から細胞13 に移動させ、各細胞の機械的特性を測定するオリジナルプログラムを開発しました。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>AFM cantilever</td>
			<td>Bruker AFM probes</td>
			<td>MLCT</td>
			<td>The cantilevers used were the labeled &#8220;C&#8221; with resonant frequency of 7 to 10 kHz and k: 0.01 N/m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AFM data analysis</td>
			<td>JPK-Bruker</td>
			<td>JPK Data processing version minimum 5.1.8</td>
			<td>Can be downloaded from a JPK-Bruker user acount</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AFM Petri dishes</td>
			<td>WPI</td>
			<td>FluoroDish FD35-100</td>
			<td>The heater was used to monitor the temperature changes during the experiment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Atomic force Microscope (AFM)</td>
			<td>JPK-Bruker</td>
			<td>Nanowizard II or III</td>
			<td>the AFM should be mounted on an inverted optical microscope with a motorized stage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caspofungin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SML0425-5MG</td>
			<td>Caspofungin was used with a concentration of 4 MIC (Minimum Inhibitor Concentration)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Code editor</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td>Visual Studio Code version 1.40.1</td>
			<td>https://code.visualstudio.com/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryobeads</td>
			<td>IFU</td>
			<td>CB12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dessicator/Degassing chamber</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>15594635</td>
			<td>The equipment is used to degassing the PDMS stamps for about 50 minutes any dessicator coupled with a vaccum pump will do.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish heater</td>
			<td>JPK-Bruker</td>
			<td>PetriDishHeater</td>
			<td>This is an add-on to the JPK/Bruker AFM. The heater was used to monitor the temperature changes during the experiment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate buffer pH 5.2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7899</td>
			<td>The solution contains 18 mM sodium acetate, 1 mM CaCl2, and 1 mM MnCl2. Adjust the pH with glacial acetic acid. The solution can be stored at 4 &#176;C for 2 months</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Statistical analysis language</td>
			<td>https://www.r-project.org</td>
			<td>R version 3.6.1</td>
			<td>R is a language and environment for statistical computing and graphics. It is a GNU project which is similar to the S language and environment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Statistical analysis software</td>
			<td>https://rstudio.com</td>
			<td>R studio version 1.1.463</td>
			<td>collaboration between the R Foundation, RStudio, Microsoft, TIBCO, Google, Oracle, HP and others. RStudio and Shiny are affiliated projects of the Foundation for Open Access Statistics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard 184</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>761028</td>
			<td>Polydimethylsiloxane (PDMS) and curing agent in one set</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Peptone D Broth</td>
			<td>Difco</td>
			<td>242820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>YPD Agar</td>
			<td>Difco</td>
			<td>DF0427-17-6</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

automation of bio-atomic force microscope measurements on hundreds of c. albicans cells

本論文では、バイオAFM実験と力曲線の記録を自動化することを目的とした方法を紹介します。この方法を使用すると、1000個のセル上の力のカーブを4時間に自動的に記録することができます。4時間の解析時間を維持するために、セルあたりの力曲線の数は9または16に減少する。このメソッドは、Jython ベースのプログラムと定義されたパターンでセルを組み立てる方法を組み合わせたものです。商用Bio-AFMに実装されたこのプログラムは、配列の最初のセルに先端を中央に配置し、各セルに力曲線を記録しながら自動的にセルからセルに移動することができます。この方法論を用いて、それらの剛性、接着特性などの細胞の生物物理学的パラメータにアクセスすることが可能である。自動化と多数のセルが分析された場合、セルの母集団の動作にアクセスできます。これは、データがこれまでに数十個の細胞に記録されているBio-AFM分野のブレークスルーです。

我々は、カスポフィンの効果を分析するために記載されたプロトコルを使用して、その酵母の形態における日和見ヒト病原体C.アルビカンの生物物理学的特性に及ぼす影響を分析した。カスポフィンは、細胞が抗真菌剤に対して開発する耐性メカニズムのために他の薬物が効果がないときに使用される最後のチャンスです。その作用機序は、ßグルカン合成を担う複雑なfks1/Fks2のサブユ...

Watch this Scientific Journal Video about Automation of Bio-Atomic Force Microscope Measurements on Hundreds of C. albicans Cells at JoVE.com

Automation of Bio-Atomic Force Microscope Measurements on Hundreds of C. albicans Cells

このプロトコルは、数百個の微生物細胞のAFM測定を自動化することを目的としています。まず、微生物をPDMSスタンプ微細構造に固定化し、次に何百もの固定化された細胞に対して力分光測定を自動的に行います。

数百個の C.アルビカン 細胞に対するバイオ原子間力顕微鏡測定の自動化

The method presented in this paper aims to automate Bio-AFM experiments and the recording of force curves. Using this method, it is possible to record ...

原子間力顕微鏡の自動化は、生物医学の応用に向けた技術の進化における重要な革新である。また、細胞集団の生体力学的特性の調査へのアクセスを開きます。我々の方法は、10個の細胞を測定するのに4時間かかる通常の方法と比較して、4時間で1,000細胞のAFM測定値を記録することを可能にする、これは本当に時間の有意な利益である。自動化がこの技術を病院の研究室に持ち込むための前提条件であるならば、この概念実証プロトコルは、特定の医療診断戦略の開発に使用する可能性を示唆しています。このプロトコルは、さまざまな微生物を充填することができる汎用性の高いPDMSステムを使用して、異なるシステムを探索することができます。PDMSスタンプを調製するために、PDMs、オリゴマー、及び硬化剤で10~1質量比でPDMS前ポリマー溶液55グラムを混合し、得られた溶液を真空下で1回10倍から10倍のマイナス10~マイナス2本のバーに5~10分間用いった。すべてのトラップ気泡が取り除かれたら、20グラムの脱気溶液をシリコンマスターモールドに2〜3ミリメートルの厚さに注ぎ、再び脱気します。すべての気泡を取り除いた場合、PDMSを摂氏80度で1時間レキュレートし、メスを使用してPDMSマイクロ構造スタンプを可視のマイクロ構造アレイと平行に切ります。次に、シリコンマスターモールドからスタンプを剥がし、スライドの側面に合わせたマイクロ構造を持つガラススライド上にスタンプマイクロ構造のサイトを置きます。装置用の細胞を調製するために、目的の細胞懸濁液の600マイクロリットルを遠心分離し、スタンプに上清の200マイクロリットルを加える。真空下で上清を約40分間脱気する。すべての気泡が除去されたら、PDMS表面からの上澄み液を200マイクロリットルの再懸濁液溶液に交換し、室温で15分間インキュベーションします。スタンプのマイクロ構造にセルをロードするには、30~50度の角度で保持されたガラススライドを使用して、必要に応じてスタンプ全体にセルを数回広げます。微細構造の高い充填率が達成された場合は、ピペットを使用して細胞懸濁液を除去し、洗浄ごとに1ミリリットルの酢酸バッファーで3回洗浄し、トラップされていない細胞を除去します。最後の洗浄後、窒素流を使用してサンプルの背面を乾燥させ、ペトリ皿にスタンプを入れます。その後、新鮮な酢酸バッファーの2ミリリットルを皿に追加します。原子間力顕微鏡の場合は、原子間力顕微鏡のステージに皿を置き、ステージをゼロからゼロに中央に配置します。ステージが中央に配置されたら、皿を顕微鏡ペトリ皿ホルダーに移動し、ペトリ皿ホルダーのy軸に垂直になるようにスタンプの端を揃えます。次に、先端がスタンプに衝突するのを避けるために、ステッパーモーターが十分に伸びるように注意して、原子顕微鏡の力をステージに置きます。イメージングでは、顕微鏡ノブを使用して、4.5 x 4.5平方メートルのマイクロメーターウェルの左隅に原子間力顕微鏡先端を中央に配置し、顕微鏡ソフトウェアでフォースマッピングモードを選択します。100×100マイクロメートル面積に対して64 x 64力マップを設定するには、相対設定点を3~5ナノニュートン、Z長を4マイクロメートル、Z移動を一定の持続時間に設定し、延長時間を0.01秒に延長し、延長遅延をゼロにし、引き込み遅延をゼロにし、遅延モードを一定力に設定します。、2048ヘルツへのサンプルレート。Z 閉じたループをオフにして、正方形の画像をチェックします。高速アクセスを100マイクロメートル、低速軸を100マイクロメートル、Xオフセットをゼロマイクロメートル、Yオフセットをゼロマイクロメートル、グリッド角度をゼロ度、ピクセルを64 x 64、ピクセル比を1対1に設定します。次に、オートメーションソフトウェアを開きます。ポップアップ ウィンドウで、スクリプト ファイルのパスを選択します。このW1座標は、ギフォンスクリプトの入力ボックスセクションのP1可変線239に、P2変数ライン241にW2座標値を入力する。ピッチ値をスクリプトのピッチ可変行245に帰属させ、ウェル寸法を入力し、ウェルパターンの設計からW-S可変線248に決定することができる。行251の保存ディレクトリへのパスを書き込み、所望の場所にデータを保存し、合計面積可変行254を100マイクロメートルの複数端に設定する。次に、数値スキャン可変行257にウェルごとに記録された力曲線行列行および列を設定し、実行をクリックしてプログラムを開始する。データを分析するには、ビデオスタジオコードソフトウェアを使用してPythonスクリプトを開き、コピーファイルPythonスクリプトを実行してフォースカーブファイルを1つのフォルダに整理します。データが格納される一般フォルダへのパスを入力します。力曲線を解析するために、原子間力顕微鏡メーカーのデータ処理ソフトウェアを開きます。ファイルメニューで、分光法曲線のバッチを選択します。次にファイルと荷重のプロセスを選択し、剛性プロセスを選択します。プロセスの最後のステップを選択し、[維持]をクリックしてすべてのフォースカーブに同じ処理を適用します。Rスクリプトを開くには、データ処理ソフトウェアで抽出された情報を含むファイルをR studioソフトウェアにロードします。環境ウィンドウで[データセットのインポート]をクリックし、ポップアップウィンドウのテキストリーダーから[参照]をクリックして、ドットTSVファイルを見つけます。ファイルが読み込まれたら、コード実行領域を選択し、all を実行してすべてのコードを実行します。ここで、図示したプロトコルを用いて得られる典型的なヒストグラムが示されている。この分析では、957のネイティブセルに剛性再パーティション化を記録し、この分析では574カスパポフィン処理細胞の剛性を測定した。数百のセルを使用すると、値のバイモーダル分布が観察されることを知っています。小さいサンプルでは、一般的に単一の分布が観察され、母集団の不均一性の観察の欠如をもたらす可能性があります。2つの条件を比較すると、細胞の剛性を低下させるカスポフィンの効果が強調されます。天然細胞と処理細胞のANOVA比較によって明らかにされた2つの条件は、非常に、有意に異なる剛性を示す。この値は、多数の分析された細胞のために到達し、得られた結果に対する信頼度が高かった。上澄み物をPDMSスタンプに加えて、スタンプがいっぱいになるまで細胞をウェルに繰り返しフラッシュする前に、分析の成功に不可欠である。この概念実証では、カンディダ・アルビカンス細胞を分析したが、このプロトコルはパターン細胞、分子、または材料の任意のグループに適用することができる。

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Automation of Bio-Atomic Force Microscope Measurements on Hundreds of C. albicans Cells

Multiplexed Single-molecule Force Proteolysis Measurements Using Magnetic Tweezers

磁気ピンセットを用いた多重化単分子フォースタンパク質分解測定

The  generation and detection of mechanical forces is a ubiquitous aspect of cell physiology,  with direct relevance to cancer metastasis1, atherogenesis2 ...

Candida albicans Biofilm Chip (CaBChip) for High-throughput Antifungal Drug Screening

Candida albicans Biofilm Chip CaBChip for High-throughput Antifungal Drug Screening

ハイスループット抗真菌薬スクリーニングのためのカンジダバイオチップ（ カルシウム BChip）

Candida  albicans remains the main etiological agent of candidiasis, which  currently represents the fourth most common nosocomial bloodstream infection ...

Flexural Rigidity Measurements of Biopolymers Using Gliding Assays

グライディングアッセイを用いて生体高分子の曲げ剛性の測定

Microtubules are cytoskeletal polymers which  play a role in cell division, cell mechanics, and intracellular transport. Each of these functions requires ...

Biosensor for Detection of Antibiotic Resistant Staphylococcus Bacteria

抗生物質耐性ブドウ球菌の細菌の検出のためのバイオセンサー

A structurally transformed lytic bacteriophage having a broad host range of Staphylococcus aureus strains and a penicillin-binding protein (PBP 2a) ...

Measuring the Mechanical Properties of Living Cells Using Atomic Force Microscopy

原子間力顕微鏡を用いた生細胞の機械的特性を測定する

Mechanical  properties of cells and extracellular matrix (ECM) play important roles in many  biological processes including stem cell differentiation, ...

Cell Patterning on Photolithographically Defined 
Parylene-C: SiO2 Substrates

Cell Patterning on Photolithographically Defined 
Parylene-C: SiO2 Substrates

はSiO：フォトリソグラフィによって画定されたパリレン-C上の細胞のパターニング<sub&gt; 2</sub&gt;基板

Cell patterning platforms support broad research goals, such as construction of predefined in vitro neuronal networks and the exploration of certain ...

From Fast Fluorescence Imaging to Molecular Diffusion Law on Live Cell Membranes in a Commercial Microscope

商業顕微鏡でのライブ細胞膜上の分子拡散法への高速蛍光イメージングから

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the ...

Atomic Force Microscopy Imaging and Force Spectroscopy of Supported Lipid Bilayers

原子間力顕微鏡イメージングおよびサポートされている脂質二重層のフォーススペクトロスコピー

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient ...

Power Input Measurements in Stirred Bioreactors at Laboratory Scale

実験室規模で撹拌したバイオリアクターでのパワー入力測定

The power input in stirred bioreactors is an important scaling-up parameter and can be measured through the torque that acts on the impeller shaft during ...

Measurement of Force-Sensitive Protein Dynamics in Living Cells Using a Combination of Fluorescent Techniques

蛍光技術の組み合わせを用いた生細胞内力感受性タンパク質ダイナミクスの測定

Cells sense and respond to physical cues in their environment by converting mechanical stimuli into biochemically-detectable signals in a process called ...

数百個の C.アルビカン 細胞に対するバイオ原子間力顕微鏡測定の自動化

数百個の C.アルビカン細胞に対するバイオ原子間力顕微鏡測定の自動化