Name: automation of bio-atomic force microscope measurements on hundreds of c. albicans cells
Uploaded: 2021-04-02T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Automation of Bio-Atomic Force Microscope Measurements on Hundreds of C. albicans Cells at JoVE.com

Vi ønsker å anerkjenne FONCYCYT fra CONACYT (Mexico), Frankrikes utenriksdepartement og Université Paris 13, selv om den økonomiske støtten til det internasjonale samarbeidet ECOS-NORD-prosjektet kalt Nano-palpation for diagnose, No. 263337 (Mexico) og MI5P02 (Frankrike). AMR vil takke den økonomiske støtten til SIP-IPN gjennom prosjektet Nr. 20195489. SPC støttes av et ph.d.-stipend fra CONACYT (nr. 288029) og IPN gjennom cotutelle-avtalen om å få dobbelt ph.d.-sertifikat (IPN-UPS). ED og CFD er forskere ved Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS).

1. Mikrobiell cellekultur
<ol><li>Gjenopplive celler fra en glyserol lager. MERK: C. albicaner lagres ved -80 °C i glyserollagre, på klinkekuler.<ol>
<li>Velg en marmor i -80 °C lager og gni den på gjær peptone dextrose (YPD) agar. Dyrk cellene i 2 dager ved 30 °C, før flytende dyrking.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Forbered flytende kulturer.<ol>
<li>Fyll et kulturrør med 5 ml steril YPD-buljong og tilsett en enkelt koloni av C. albicansceller, dyrket på YPD-agarplaten.</li>
		<li>Dyrk kulturen ...

<ol>
	<li>Cross, S. E., Jin, Y. S., Rao, J., Gimzewski, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanomechanical+analysis+of+cells+from+cancer+patients.">Nanomechanical analysis of cells from cancer patients.</a> Nature Nanotechnology. 2 (12), 780-783 (2007).</li><li>Dague, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+force+and+electron+microscopic-based+study+of+sarcolemmal+surface+of+living+cardiomyocytes+unveils+unexpected+mitochondrial+shift+in+heart+failure.">Atomic force and electron microscopic-based study of sarcolemmal surface of living cardiomyocytes unveils unexpected mitochondrial shift in heart failure.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 74, 162-172 (2014).</li><li>Muller, D. J., Helenius, J., Alsteens, D., Dufrene, Y. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force+probing+surfaces+of+living+cells+to+molecular+resolution.">Force probing surfaces of living cells to molecular resolution.</a> Nature Chemical Biology. 5 (6), 383-390 (2009).</li><li>Dague, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+Force+Microscopy+to+Explore+Electroporation+Effects+on+Cells.">Atomic Force Microscopy to Explore Electroporation Effects on Cells.</a> Handbook of Electroporation. , 1-13 (2016).</li><li>Puntheeranurak, T., Neundlinger, I., Kinne, R. K. H., Hinterdorfer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+recognition+force+spectroscopy+of+transmembrane+transporters+on+living+cells.">Single-molecule recognition force spectroscopy of transmembrane transporters on living cells.</a> Nature Protocols. 6 (9), 1443-1452 (2011).</li><li>Formosa, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoscale+analysis+of+the+effects+of+antibiotics+and+CX1+on+a+Pseudomonas+aeruginosa+multidrug-resistant+strain.">Nanoscale analysis of the effects of antibiotics and CX1 on a Pseudomonas aeruginosa multidrug-resistant strain.</a> Scientific Reports. 2, (2012).</li><li>Pillet, F., Chopinet, L., Formosa, C., Dague, &. #. 2. 0. 1. ;. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+Force+Microscopy+and+pharmacology:+From+microbiology+to+cancerology.">Atomic Force Microscopy and pharmacology: From microbiology to cancerology.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - General Subjects. 1840 (3), 1028-1050 (2014).</li><li>Wu, P. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+methods+to+assess+cell+mechanical+properties.">A comparison of methods to assess cell mechanical properties.</a> Nature Methods. 15 (7), 491-498 (2018).</li><li>Rigato, A., Rico, F., Eghiaian, F., Piel, M., Scheuring, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+Force+Microscopy+Mechanical+Mapping+of+Micropatterned+Cells+Shows+Adhesion+Geometry-Dependent+Mechanical+Response+on+Local+and+Global+Scales.">Atomic Force Microscopy Mechanical Mapping of Micropatterned Cells Shows Adhesion Geometry-Dependent Mechanical Response on Local and Global Scales.</a> ACS Nano. 9 (6), 5846-5856 (2015).</li><li>Favre, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parallel+AFM+imaging+and+force+spectroscopy+using+two-dimensional+probe+arrays+for+applications+in+cell+biology.">Parallel AFM imaging and force spectroscopy using two-dimensional probe arrays for applications in cell biology.</a> Journal of Molecular Recognition. 24 (3), 446-452 (2011).</li><li>Dujardin, A., Wolf, P. D., Lafont, F., Dupres, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+multi-sample+acquisition+and+analysis+using+atomic+force+microscopy+for+biomedical+applications.">Automated multi-sample acquisition and analysis using atomic force microscopy for biomedical applications.</a> PLOS ONE. 14 (3), 0213853 (2019).</li><li>Formosa, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+living+cell+arrays+for+atomic+force+microscopy+studies.">Generation of living cell arrays for atomic force microscopy studies.</a> Nature Protocols. 10 (1), 199-204 (2015).</li><li>Proa-Coronado, S., S&#233;verac, C., Martinez-Rivas, A., Dague, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+the+paradigm+of+nanomechanical+measurements+on+cells+using+AFM:+an+automated+methodology+to+rapidly+analyse+thousands+of+cells.">Beyond the paradigm of nanomechanical measurements on cells using AFM: an automated methodology to rapidly analyse thousands of cells.</a> Nanoscale Horizons. , (2019).</li><li>Foncy, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+polyurethane+and+epoxy+resist+master+mold+for+nanoscale+soft+lithography.">Comparison of polyurethane and epoxy resist master mold for nanoscale soft lithography.</a> Microelectronic Engineering. 110, 183-187 (2013).</li><li>Unsay, J. D., Cosentino, K., Garc&#237;a-S&#225;ez, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+Force+Microscopy+Imaging+and+Force+Spectroscopy+of+Supported+Lipid+Bilayers.">Atomic Force Microscopy Imaging and Force Spectroscopy of Supported Lipid Bilayers.</a> Journal of Visualized Experiments. (101), e52867 (2015).</li><li>Schiavone, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+combined+chemical+and+enzymatic+method+to+determine+quantitatively+the+polysaccharide+components+in+the+cell+wall+of+yeasts.">A combined chemical and enzymatic method to determine quantitatively the polysaccharide components in the cell wall of yeasts.</a> FEMS Yeast Research. 14 (6), 933-947 (2014).</li><li>Formosa, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoscale+Effects+of+Caspofungin+against+Two+Yeast+Species,+Saccharomyces+cerevisiae+and+Candida+albicans.">Nanoscale Effects of Caspofungin against Two Yeast Species, Saccharomyces cerevisiae and Candida albicans.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 57 (8), 3498-3506 (2013).</li><li>El-Kirat-Chatel, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoscale+analysis+of+caspofungin-induced+cell+surface+remodelling+in+Candida+albicans.">Nanoscale analysis of caspofungin-induced cell surface remodelling in Candida albicans.</a> Nanoscale. 5 (3), 1105-1115 (2013).</li><li>Peric, O., Hannebelle, M., Adams, J. D., Fantner, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+bacterial+traps+for+simultaneous+fluorescence+and+atomic+force+microscopy.">Microfluidic bacterial traps for simultaneous fluorescence and atomic force microscopy.</a> Nano Research. 10 (11), 3896-3908 (2017).</li></ol>

Den viktigste forbedringen fra denne metoden er en betydelig økning i antall målte celler på en bestemt tid. Motparten er en reduksjon av antall punkt målt per celle. Det betyr at denne metoden ikke er designet for å gi en detaljert analyse av en enkelt celle. Metoden gjelder bare for celler som får plass i brønnene i PDMS-stempelet. Stempelet er ganske allsidig, mens det inneholder brønner på 1,5 x 1,5 μm2 opp til 6 x 6 μm2. Likevel er det umulig å immobilisere bacillus eller mye størr...

Dette arbeidet gir en metodikk for å utføre automatiske kraftmålinger på hundrevis av levende celler ved hjelp av et atomkraftmikroskop (AFM). Det gir også en metode for å immobilisere mikrober på et PDMS mikrostrukturert stempel som er kompatibelt med AFM-eksperimenter utført i et flytende miljø.
Bio-AFM er en svært spesialisert teknologi unnfanget for applikasjoner i biologi og deretter brukt til å studere levende celler. Det krever en opplært ingeniør som kan analysere en celle om gangen. Under disse forholdene er antall forskjellige celler som kan analyseres ganske lite, typisk 5 til 10 celler på 4-5 timer. Imidlertid er mengden kraftmålinger registrert på en enkelt celle vanligvis svært høy og kan lett nå 1000. Dermed er det nåværende paradigmet for AFM-kraftmålinger på levende celler å registrere hundrevis av kraftkurver (FCs), men på et begrenset antall celler.
Statistisk sett er denne tilnærmingen tvilsom, og reiser spørsmålet om utvalgets representativitet. Faktisk er det vanskelig for eksempel å evaluere heterogeniteten til en cellepopulasjon ved å måle bare noen få celler, selv om hundrevis av målinger er registrert på disse få cellene. Det er imidlertid på grunnlag av dette paradigmet at det er gjort store fremskritt innen biofysikk, mikrobiologi og nanomedisin1,2,3. Faktisk har nanometeranalyse på skalaen av enkeltceller gitt ny informasjon om cellulær nanomekanikk, om organisering av transmembranproteiner, eller virkningsmekanismen for antimikrobielle eller anticancer medisiner4,5,6,7. Nylig har imidlertid flere biomekaniske tester med høy gjennomstrømning utført på celler dukket opp8, som viser det vitenskapelige samfunnets interesse for å endre dette paradigmet og få tilgang til cellepopulasjonens heterogenitet. Disse testene er alle avhengige av mikrofluidiske systemer for å deformere celler og optisk måle deformasjonen under stress for å oppnå et indirekte mål på deres generelle overflateelastisitet8. Et viktig problem med disse metodene er imidlertid at de er monoparametriske: bare celleelastisitet kan undersøkes. Videre tillater de ikke måling av de mekaniske parametrene til tilhengerceller, noe som kan være begrensende for studier av ikke-sirklende pattedyrceller eller biofilmer for eksempel.
Tilnærminger som involverer AFM er utviklet av lagene s. Scheuring9 og M. Favre10. Scheuring et al. immobiliserte celler på fibronectin mønstre9, tvinger individuelle celler til å ta form av mønsteret9. Deretter kartla dette teamet de mekaniske egenskapene til noen få celler for å definere gjennomsnittlige data, representant for 14 til 18 celler. Utviklingen utført av Farve et al. rettet mot multipleksing av målingene ved å parallellisere AFM cantilevers10. Så vidt vi vet har dette arbeidet i multipleksingsretningen ikke ført til målinger på levende celler.
En interessant tilnærming foreslått av Dujardins team presenterer en automatisert AFM som er i stand til å identifisere celler og avbilde dem på bunnen av skreddersydde brønner. Selv om denne metoden ikke tillater analyse av en stor populasjon av celler, tillater den automatisk testing av forskjellige forhold i hver brønn11.
Vårt mål i dette arbeidet er mer ambisiøst siden vi ønsket å måle minst 1000 celler for å få tilgang til ikke en gjennomsnittlig celle, men tvert imot heterogeniteten mellom cellene. Strategien som vi utviklet her for å få tilgang til cellepopulasjons heterogenitet ved hjelp av AFM, er basert på analysen av hundrevis av celler som et begrenset antall kraftkurver registreres på. Sammenlignet med den "klassiske" tilnærmingen til å registrere et stort antall kraftkurver på et begrenset antall celler, bør denne tilnærmingen betraktes som komplementær siden den ikke gir samme informasjon. Faktisk, mens den typiske metoden tillater en å sondere individuell celleoverflate heterogenitet, ved hjelp av vår tilnærming, er vi i stand til å få tilgang til hele cellepopulasjonen heterogenitet. For å oppnå dette målet har vi kombinert en metode som direkte immobiliserer mikrober (her gjærarten Candida albicans) inn i brønnene til et PDMS mikrostrukturert stempel12, og utvikler et originalt program for å flytte AFM-spissen automatisk fra celle til celle13 og måle de mekaniske egenskapene til hver celle.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>AFM cantilever</td>
			<td>Bruker AFM probes</td>
			<td>MLCT</td>
			<td>The cantilevers used were the labeled &#8220;C&#8221; with resonant frequency of 7 to 10 kHz and k: 0.01 N/m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AFM data analysis</td>
			<td>JPK-Bruker</td>
			<td>JPK Data processing version minimum 5.1.8</td>
			<td>Can be downloaded from a JPK-Bruker user acount</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AFM Petri dishes</td>
			<td>WPI</td>
			<td>FluoroDish FD35-100</td>
			<td>The heater was used to monitor the temperature changes during the experiment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Atomic force Microscope (AFM)</td>
			<td>JPK-Bruker</td>
			<td>Nanowizard II or III</td>
			<td>the AFM should be mounted on an inverted optical microscope with a motorized stage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caspofungin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SML0425-5MG</td>
			<td>Caspofungin was used with a concentration of 4 MIC (Minimum Inhibitor Concentration)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Code editor</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td>Visual Studio Code version 1.40.1</td>
			<td>https://code.visualstudio.com/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryobeads</td>
			<td>IFU</td>
			<td>CB12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dessicator/Degassing chamber</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>15594635</td>
			<td>The equipment is used to degassing the PDMS stamps for about 50 minutes any dessicator coupled with a vaccum pump will do.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish heater</td>
			<td>JPK-Bruker</td>
			<td>PetriDishHeater</td>
			<td>This is an add-on to the JPK/Bruker AFM. The heater was used to monitor the temperature changes during the experiment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate buffer pH 5.2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7899</td>
			<td>The solution contains 18 mM sodium acetate, 1 mM CaCl2, and 1 mM MnCl2. Adjust the pH with glacial acetic acid. The solution can be stored at 4 &#176;C for 2 months</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Statistical analysis language</td>
			<td>https://www.r-project.org</td>
			<td>R version 3.6.1</td>
			<td>R is a language and environment for statistical computing and graphics. It is a GNU project which is similar to the S language and environment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Statistical analysis software</td>
			<td>https://rstudio.com</td>
			<td>R studio version 1.1.463</td>
			<td>collaboration between the R Foundation, RStudio, Microsoft, TIBCO, Google, Oracle, HP and others. RStudio and Shiny are affiliated projects of the Foundation for Open Access Statistics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard 184</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>761028</td>
			<td>Polydimethylsiloxane (PDMS) and curing agent in one set</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Peptone D Broth</td>
			<td>Difco</td>
			<td>242820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>YPD Agar</td>
			<td>Difco</td>
			<td>DF0427-17-6</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

automation of bio-atomic force microscope measurements on hundreds of c. albicans cells

Metoden som presenteres i denne artikkelen tar sikte på å automatisere Bio-AFM-eksperimenter og opptak av kraftkurver. Ved hjelp av denne metoden er det mulig å registrere krefter kurver på 1000 celler på 4 timer automatisk. For å opprettholde en 4 timers analysetid reduseres antall kraftkurver per celle til 9 eller 16. Metoden kombinerer et Jython-basert program og en strategi for å sette sammen celler på definerte mønstre. Programmet, implementert på en kommersiell Bio-AFM, kan midtstille spissen på den første cellen i matrisen og deretter flytte, automatisk, fra celle til celle mens du registrerer kraftkurver på hver celle. Ved hjelp av denne metoden er det mulig å få tilgang til de biofysiske parametrene til cellene som stivhet, deres limegenskaper, etc. Med automatiseringen og det store antallet celler analysert, kan man få tilgang til oppførselen til cellepopulasjonen. Dette er et gjennombrudd i Bio-AFM-feltet der data så langt har blitt registrert på bare noen få titalls celler.

Vi brukte den beskrevne protokollen til å analysere effekten av caspofungin på de biofysiske egenskapene til det opportunistiske menneskelige patogenet C. albicans i gjærformen. Caspofungin er en siste sjanse antifungal molekyl som brukes når andre stoffer er ineffektive på grunn av motstandsmekanismer celler utvikler mot antifungals. Virkningsmekanismen er basert på hemming av underenheten Fks2 av komplekse fks1 / Fks2 som er ansvarlig for ß glukansyntese. Som ß glukaner er en viktig komponent i soppcel...

Watch this Scientific Journal Video about Automation of Bio-Atomic Force Microscope Measurements on Hundreds of C. albicans Cells at JoVE.com

Automation of Bio-Atomic Force Microscope Measurements on Hundreds of C. albicans Cells

Denne protokollen tar sikte på å automatisere AFM-målinger på hundrevis av mikrobielle celler. For det første blir mikrober immobilisert til PDMS-stempelmikrostrukturer, og deretter utføres kraftspektroskopimålinger automatisk på hundrevis av immobiliserte celler.

Automatisering av bioatomkraftmikroskopmålinger på hundrevis av C. albicansceller

The method presented in this paper aims to automate Bio-AFM experiments and the recording of force curves. Using this method, it is possible to record ...

Atomkraftmikroskopautomatisering er en viktig innovasjon i utviklingen av teknologien mot biomedisinske anvendelser. Det åpner også tilgang til undersøkelsen av de biomekaniske egenskapene til cellepopulasjoner. Vår metode gjør det mulig å registrere AFM-målinger for 1000 celler på fire timer, sammenlignet med de vanlige metodene, som tar fire timer å måle 10 celler, dette er virkelig en betydelig gevinst på tid.Hvis automatisering er en forutsetning for å bringe denne teknologien inn i sykehuslaboratorier, antyder denne konseptbevisprotokollen sitt potensial for bruk i utviklingen av spesifikke medisinske diagnostiske strategier. Denne protokollen bruker en allsidig PDMS-stamme som kan fylles med forskjellige mikrober, slik at forskjellige systemer kan utforskes. For å forberede PDMS-stempelet blander du 55 gram PDMS prepolymerløsning med et 10 til ett masseforhold i PDMer, oligomerer og herdemiddel og degas den resulterende løsningen under vakuum på en gang 10 til den negative en til en ganger 10 til de negative to stolpene i fem til ti minutter.Når alle felleboblene er fjernet, hell 20 gram av den avgassede løsningen på en silisiummesterform til en to til tre millimeter tykkelse og degas igjen. Når alle boblene er fjernet, retikulerer du PDMS ved 80 grader Celsius i en time og bruker en skalpell til å kutte PDMS mikrostrukturert stempel parallelt med de synlige mikrostrukturmatrisene. Skrell deretter stempelet fra silisiummesterformen og legg stempelmikrostrukturstedet opp på et glasssklie med mikrostrukturene på linje med siden av lysbildet.For å forberede cellene til enheten, sentrifuger 600 mikroliter av cellefjæringen av interesse og legg til 200 mikroliter av supernatanten på stempelet. Degas den supernatante under vakuum i ca 40 minutter. Når alle boblene er fjernet, må du erstatte supernatanten fra PDMS-overflaten med 200 mikroliter av den resuspenderte celleløsningen for en 15 minutters inkubasjon ved romtemperatur.For å laste cellene inn i stempelets mikrostrukturer, Bruk en glasssklie holdt i en vinkel på 30 til 50 grader for å spre cellene over stempelet i begge retninger, flere ganger etter behov. Når en høy fyllingshastighet på mikrostrukturene er oppnådd, bruk en pipette for å fjerne celleopphenget og vask de tre gangene med en milliliter acetatbuffer per vask for å fjerne utrappede celler. Etter den siste vasken, bruk nitrogenstrøm for å tørke baksiden av prøven og legg stempelet i en Petri-tallerken.Tilsett deretter to milliliter fersk acetatbuffer til parabolen. For atomkraftmikroskopi av cellene, plasser parabolen på atomkraftmikroskopstadiet og sentrer scenen på null til null. Når scenen er sentrert, flytter du parabolen inn i mikroskopet Petri-tallerkenholderen og justerer kanten av stempelet slik at det er vinkelrett på y-aksen til Petri-tallerkenholderen.Plasser deretter atommikroskopkrafthodet på scenen, og pass på at steppermotorene er tilstrekkelig utvidet for å unngå at spissen krasjer på stempelet. For avbildning, bruk mikroskopknappene til å sentrere atomkraftmikroskopspissen over venstre hjørne av brønnene på 4,5 x 4,5 kvadrert mikrometer og velg kraftkartleggingsmodus i mikroskopprogramvaren. For å sette et 64 x 64 kraftkart over et 100 x 100 mikrometer område, sett det relative settpunktet til tre til fem nano Newtons, Z-lengden til fire mikrometer, Z-bevegelsen til konstant varighet, forlenge tiden til 0,01 sekunder, utvidelsesforsinkelsen til null, tilbaketrekningsforsinkelsen til null, forsinkelsesmodusen for konstant kraft , samplingsfrekvensen til 2048 Hertz.Fjern merket for Z lukket sløyfe og sjekk firkantet bilde. Sett den raske tilgangen til 100 mikrometer, den langsomme aksen til 100 mikrometer, X-forskyvningen til null mikrometer, Y-forskyvningen til null mikrometer, rutenettvinkelen til null grader, pikslene til 64 x 64 og pikselforholdet til en til en. Deretter åpner du automatiseringsprogramvaren.Velg banen mot skriptfilen i popup-vinduet. Angi W1-koordinaten i P1-variabellinje 239 i inndataboksdelen i gyfonskriptet og W2-koordinatverdien i P2-variabellinje 241. Tilskrive tonehøydeverdien til tonehøydevariabelen linje 245 i skriptet og legge inn brønndimensjonen, som kan bestemmes ut fra utformingen av brønnmønstrene i W-S-variabellinje 248.Skriv bane til lagringskatalogen i linje 251 for å lagre dataene på ønsket sted og sett den totale arealvariabelen linje 254 til ønsket om flere ender av de 100 mikrometerne. Angi deretter kraftkurvene matriserad og kolonne registrert per brønn i tallet skanner variabel linje 257 og klikk kjør for å starte programmet. For å analysere dataene, bruk videostudiokodeprogramvaren til å åpne Python-skriptet og utføre kopifilene Python-skriptet for å organisere kraftkurvefilene i en mappe.Skriv inn banen til den generelle mappen der dataene skal lagres. For å analysere kraftkurvene, åpne atomkraftmikroskopprodusentens databehandlingsprogramvare. Velg en gruppe spektroskopikurver på Fil-menyen.Velg deretter fil- og innlastingsprosess, og velg stivhetsprosessen. Velg det siste trinnet i prosessen, og klikk behold og bruk på alle slik at alle kraftkurvene får samme behandling. Hvis du vil åpne R-skriptet, laster du inn deg filer som inneholder informasjonen som er hentet ut med databehandlingsprogramvaren, i R studio-programvaren.I miljøvinduet klikker du på importdatasett og fra tekstleser i popup-vinduet, klikk bla gjennom for å finne dot TSV-filen. Når filen er lastet inn, velger du kodekjøringsområde og kjører alle for å kjøre all koden. Her vises typiske histogrammer oppnådd ved hjelp av protokollen som vist.I denne analysen ble stivhetsrepartisjoneringen registrert på 957 innfødte celler, Mens i denne analysen ble stivheten til 574 caspofunginbehandlede celler målt. Vit at bruk av hundrevis av celler gjør det mulig å observere en bimodal fordeling av verdiene. I mindre utvalg observeres vanligvis en enkelt fordeling og kan føre til mangel på observasjon av befolkningens heterogenitet.En sammenligning av de to forholdene fremhever effekten av Caspofungin på å redusere cellestivheten. En avslørt av ANOVA sammenligning av de innfødte og behandlede cellene, viser de to forholdene svært, betydelig forskjellige stivheter. Denne verdien ble nådd på grunn av det store antallet analyserte celler, noe som gir større tillit til de oppnådde resultatene.Å legge supernatanten til PDMS-stempelet før cellene tømmes gjentatte ganger i brønnene til stempelet er fullt, er avgjørende for at analysen skal lykkes. I dette konseptbeviset ble Candida albicans celler analysert, men protokollen kan brukes på en hvilken som helst gruppe mønsterceller, molekyler eller materialer.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Automation of Bio-Atomic Force Microscope Measurements on Hundreds of C. albicans Cells

Multiplexed Single-molecule Force Proteolysis Measurements Using Magnetic Tweezers

Multiplexed Single-molekyl kraft proteolyse målinger ved hjelp av Magnetic pinsett

The  generation and detection of mechanical forces is a ubiquitous aspect of cell physiology,  with direct relevance to cancer metastasis1, atherogenesis2 ...

Candida albicans Biofilm Chip (CaBChip) for High-throughput Antifungal Drug Screening

Candida albicans Biofilm Chip CaBChip for High-throughput Antifungal Drug Screening

Candida albicans Biofilm Chip (Ca BChip) for High-throughput antifungal Drug Screening

Candida  albicans remains the main etiological agent of candidiasis, which  currently represents the fourth most common nosocomial bloodstream infection ...

Flexural Rigidity Measurements of Biopolymers Using Gliding Assays

Microtubules are cytoskeletal polymers which  play a role in cell division, cell mechanics, and intracellular transport. Each of these functions requires ...

Biosensor for Detection of Antibiotic Resistant Staphylococcus Bacteria

Biosensor for påvisning av antibiotikaresistens resistente Staphylococcus bakterier

A structurally transformed lytic bacteriophage having a broad host range of Staphylococcus aureus strains and a penicillin-binding protein (PBP 2a) ...

Measuring the Mechanical Properties of Living Cells Using Atomic Force Microscopy

Måling av mekaniske egenskaper Living Cells hjelp Atomic Force Mikroskopi

Mechanical  properties of cells and extracellular matrix (ECM) play important roles in many  biological processes including stem cell differentiation, ...

Cell Patterning on Photolithographically Defined 
Parylene-C: SiO2 Substrates

Cell Patterning on Photolithographically Defined 
Parylene-C: SiO2 Substrates

Cell Mønster på Photolithographically Definert Parylene-C: SiO<sub&gt; 2</sub&gt; Underlag

Cell patterning platforms support broad research goals, such as construction of predefined in vitro neuronal networks and the exploration of certain ...

From Fast Fluorescence Imaging to Molecular Diffusion Law on Live Cell Membranes in a Commercial Microscope

Fra Fast Fluorescens Imaging til Molecular Diffusion Lov om Aktive cellemembraner i et kommersielt mikroskop

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the ...

Atomic Force Microscopy Imaging and Force Spectroscopy of Supported Lipid Bilayers

Atomic Force Microscopy Imaging and Force spektroskopi av Supported lipidbilag

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient ...

Power Input Measurements in Stirred Bioreactors at Laboratory Scale

Makt inn mål i rørt Bioreactors på laboratoriet skala

The power input in stirred bioreactors is an important scaling-up parameter and can be measured through the torque that acts on the impeller shaft during ...

Measurement of Force-Sensitive Protein Dynamics in Living Cells Using a Combination of Fluorescent Techniques

Måling av Force-Sensitive Protein dynamikk i levende celler ved hjelp av en kombinasjon av fluorescerende teknikker

Cells sense and respond to physical cues in their environment by converting mechanical stimuli into biochemically-detectable signals in a process called ...