Name: automation of bio-atomic force microscope measurements on hundreds of c. albicans cells
Uploaded: 2021-04-02T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Automation of Bio-Atomic Force Microscope Measurements on Hundreds of C. albicans Cells at JoVE.com

Queremos reconhecer o FONCYCYT da CONACYT (México), o Ministério das Relações Exteriores da França e a Université Paris 13, embora o apoio financeiro do projeto internacional colaborativo ECOS-NORD chamado Nano-palpaation for diagnosis, No. 263337 (México) e MI5P02 (França). A AMR agradece o apoio financeiro da SIP-IPN através do projeto nº 20195489. O SPC é apoiado por uma bolsa de doutorado da CONACYT (No. 288029) e da IPN através do acordo cotutelle para obter certificado de doutorado duplo (IPN-UPS). Ed e CFD são pesquisadores do Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS).

1. Cultura celular microbiana
<ol><li>Reviva células de um estoque de glicerol. NOTA: Os albicanos C. são armazenados a -80 °C em estoques de glicerol, em mármores.<ol>
<li>Escolha uma bola de gude no caldo -80 °C e esfregue-o no ágar peptone dextrose (YPD) de levedura. Cresça as células por 2 dias a 30 °C, antes do cultivo líquido.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Prepare culturas líquidas.<ol>
<li>Encha um tubo de cultura com 5 mL de caldo YPD estéril e adicione uma única colônia de células C. al...

<ol>
	<li>Cross, S. E., Jin, Y. S., Rao, J., Gimzewski, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanomechanical+analysis+of+cells+from+cancer+patients.">Nanomechanical analysis of cells from cancer patients.</a> Nature Nanotechnology. 2 (12), 780-783 (2007).</li><li>Dague, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+force+and+electron+microscopic-based+study+of+sarcolemmal+surface+of+living+cardiomyocytes+unveils+unexpected+mitochondrial+shift+in+heart+failure.">Atomic force and electron microscopic-based study of sarcolemmal surface of living cardiomyocytes unveils unexpected mitochondrial shift in heart failure.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 74, 162-172 (2014).</li><li>Muller, D. J., Helenius, J., Alsteens, D., Dufrene, Y. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force+probing+surfaces+of+living+cells+to+molecular+resolution.">Force probing surfaces of living cells to molecular resolution.</a> Nature Chemical Biology. 5 (6), 383-390 (2009).</li><li>Dague, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+Force+Microscopy+to+Explore+Electroporation+Effects+on+Cells.">Atomic Force Microscopy to Explore Electroporation Effects on Cells.</a> Handbook of Electroporation. , 1-13 (2016).</li><li>Puntheeranurak, T., Neundlinger, I., Kinne, R. K. H., Hinterdorfer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+recognition+force+spectroscopy+of+transmembrane+transporters+on+living+cells.">Single-molecule recognition force spectroscopy of transmembrane transporters on living cells.</a> Nature Protocols. 6 (9), 1443-1452 (2011).</li><li>Formosa, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoscale+analysis+of+the+effects+of+antibiotics+and+CX1+on+a+Pseudomonas+aeruginosa+multidrug-resistant+strain.">Nanoscale analysis of the effects of antibiotics and CX1 on a Pseudomonas aeruginosa multidrug-resistant strain.</a> Scientific Reports. 2, (2012).</li><li>Pillet, F., Chopinet, L., Formosa, C., Dague, &. #. 2. 0. 1. ;. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+Force+Microscopy+and+pharmacology:+From+microbiology+to+cancerology.">Atomic Force Microscopy and pharmacology: From microbiology to cancerology.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - General Subjects. 1840 (3), 1028-1050 (2014).</li><li>Wu, P. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+methods+to+assess+cell+mechanical+properties.">A comparison of methods to assess cell mechanical properties.</a> Nature Methods. 15 (7), 491-498 (2018).</li><li>Rigato, A., Rico, F., Eghiaian, F., Piel, M., Scheuring, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+Force+Microscopy+Mechanical+Mapping+of+Micropatterned+Cells+Shows+Adhesion+Geometry-Dependent+Mechanical+Response+on+Local+and+Global+Scales.">Atomic Force Microscopy Mechanical Mapping of Micropatterned Cells Shows Adhesion Geometry-Dependent Mechanical Response on Local and Global Scales.</a> ACS Nano. 9 (6), 5846-5856 (2015).</li><li>Favre, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parallel+AFM+imaging+and+force+spectroscopy+using+two-dimensional+probe+arrays+for+applications+in+cell+biology.">Parallel AFM imaging and force spectroscopy using two-dimensional probe arrays for applications in cell biology.</a> Journal of Molecular Recognition. 24 (3), 446-452 (2011).</li><li>Dujardin, A., Wolf, P. D., Lafont, F., Dupres, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+multi-sample+acquisition+and+analysis+using+atomic+force+microscopy+for+biomedical+applications.">Automated multi-sample acquisition and analysis using atomic force microscopy for biomedical applications.</a> PLOS ONE. 14 (3), 0213853 (2019).</li><li>Formosa, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+living+cell+arrays+for+atomic+force+microscopy+studies.">Generation of living cell arrays for atomic force microscopy studies.</a> Nature Protocols. 10 (1), 199-204 (2015).</li><li>Proa-Coronado, S., S&#233;verac, C., Martinez-Rivas, A., Dague, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+the+paradigm+of+nanomechanical+measurements+on+cells+using+AFM:+an+automated+methodology+to+rapidly+analyse+thousands+of+cells.">Beyond the paradigm of nanomechanical measurements on cells using AFM: an automated methodology to rapidly analyse thousands of cells.</a> Nanoscale Horizons. , (2019).</li><li>Foncy, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+polyurethane+and+epoxy+resist+master+mold+for+nanoscale+soft+lithography.">Comparison of polyurethane and epoxy resist master mold for nanoscale soft lithography.</a> Microelectronic Engineering. 110, 183-187 (2013).</li><li>Unsay, J. D., Cosentino, K., Garc&#237;a-S&#225;ez, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+Force+Microscopy+Imaging+and+Force+Spectroscopy+of+Supported+Lipid+Bilayers.">Atomic Force Microscopy Imaging and Force Spectroscopy of Supported Lipid Bilayers.</a> Journal of Visualized Experiments. (101), e52867 (2015).</li><li>Schiavone, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+combined+chemical+and+enzymatic+method+to+determine+quantitatively+the+polysaccharide+components+in+the+cell+wall+of+yeasts.">A combined chemical and enzymatic method to determine quantitatively the polysaccharide components in the cell wall of yeasts.</a> FEMS Yeast Research. 14 (6), 933-947 (2014).</li><li>Formosa, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoscale+Effects+of+Caspofungin+against+Two+Yeast+Species,+Saccharomyces+cerevisiae+and+Candida+albicans.">Nanoscale Effects of Caspofungin against Two Yeast Species, Saccharomyces cerevisiae and Candida albicans.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 57 (8), 3498-3506 (2013).</li><li>El-Kirat-Chatel, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoscale+analysis+of+caspofungin-induced+cell+surface+remodelling+in+Candida+albicans.">Nanoscale analysis of caspofungin-induced cell surface remodelling in Candida albicans.</a> Nanoscale. 5 (3), 1105-1115 (2013).</li><li>Peric, O., Hannebelle, M., Adams, J. D., Fantner, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+bacterial+traps+for+simultaneous+fluorescence+and+atomic+force+microscopy.">Microfluidic bacterial traps for simultaneous fluorescence and atomic force microscopy.</a> Nano Research. 10 (11), 3896-3908 (2017).</li></ol>

A principal melhoria proporcionada por essa metodologia é um aumento significativo no número de células medidas em um determinado período de tempo. A contrapartida é a redução do número de pontos medidos por célula. Significa que este método não foi projetado para fornecer uma análise detalhada de uma única célula. O método só se aplica a células que podem caber nos poços do selo PDMS. O selo é bastante versátil, enquanto contém poços de 1,5 x 1,5 μm2 até 6 x 6 μm2. Ainda as...

Este trabalho fornece uma metodologia para realizar medições automáticas de força em centenas de células vivas usando um microscópio de força atômica (AFM). Também fornece um método para imobilizar micróbios em um selo microestruturado PDMS compatível com experimentos AFM realizados em um ambiente líquido.
Bio-AFM é uma tecnologia altamente especializada concebida para aplicações em biologia e, em seguida, usada para estudar células vivas. Requer um engenheiro treinado que possa analisar uma célula no momento. Nessas condições, o número de células diferentes que podem ser analisadas é bastante pequeno, típico de 5 a 10 células em 4-5 horas. No entanto, a quantidade de medidas de força registradas em uma única célula são geralmente muito altas e podem facilmente chegar a 1000. Assim, o paradigma atual das medições de força afm em células vivas é registrar centenas de curvas de força (FCs), mas em um número limitado de células.
Estatisticamente, essa abordagem é questionável e levanta a questão da representatividade da amostra. De fato, é difícil, por exemplo, avaliar a heterogeneidade de uma população celular medindo apenas algumas células, mesmo que centenas de medidas sejam registradas nessas poucas células. No entanto, é com base nesse paradigma que grandes avanços têm sido feitos na biofísica, microbiologia e nanomedicina1,2,3. De fato, a análise de nanômetros na escala de células únicas forneceu novas informações sobre a nanomecânica celular, sobre a organização de proteínas transmembranas, ou o mecanismo de ação de drogas antimicrobianas ou anticancerígenas4,5,6,7. Recentemente, no entanto, vários testes biomecânicos de alto rendimento realizados em células surgiram8, mostrando o interesse da comunidade científica em mudar esse paradigma e acessar a heterogeneidade da população celular. Todos esses testes dependem de sistemas microfluidos para deformar as células e medir opticamente sua deformação sob estresse para obter uma medida indireta de sua elasticidade superficial global8. No entanto, uma questão importante com esses métodos é que eles são mono-paramétricos: apenas a elasticidade celular pode ser sondada. Além disso, não permitem a medição dos parâmetros mecânicos das células aderentes, o que pode ser limitador para os estudos de células mamíferas não circulantes ou biofilmes, por exemplo.
Abordagens envolvendo AFM foram desenvolvidas pelas equipes de S. Scheuring9 e M. Favre10. Scheuring et al. células imobilizadas nos padrões de fibronectina9, forçando as células individuais a tomar a forma do padrão9. Em seguida, esta equipe mapeou as propriedades mecânicas de algumas células para definir dados médios, representativos de 14 a 18 células. O desenvolvimento realizado pela Farve et al. teve como objetivo multiplexar as medidas, paralelaizando as cantilevers AFM10. Pelo que sabemos, esse trabalho na direção multiplexa-se não levou a medições em células vivas.
Uma abordagem interessante proposta pela equipe de Dujardin apresenta um AFM automatizado capaz de identificar células e imagens na parte inferior de poços feitos sob medida. Embora este método não permita a análise de uma grande população de células, permite o teste automático de diferentes condições em cada poço11.
Nosso objetivo neste trabalho é mais ambicioso, pois queríamos medir pelo menos 1000 células para acessar não uma célula média, mas, pelo contrário, a heterogeneidade entre as células. A estratégia que desenvolvemos aqui para acessar a heterogeneidade da população celular usando a AFM baseia-se na análise de centenas de células nas quais um número limitado de curvas de força são registradas. Em comparação com a abordagem "clássica" de registrar um grande número de curvas de força em um número limitado de células, essa abordagem deve ser considerada complementar, uma vez que não fornece as mesmas informações. De fato, enquanto o método típico permite sondar a heterogeneidade da superfície celular individual, usando nossa abordagem, somos capazes de acessar toda a heterogeneidade da população celular. Para alcançar esse objetivo, combinamos um método que imobiliza diretamente micróbios (aqui a espécie de levedura Candida albicans) nos poços de um selo microestruturado PDMS12, e desenvolve um programa original para mover a ponta AFM, automaticamente, de célula para célula13 e medir as propriedades mecânicas de cada célula.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>AFM cantilever</td>
			<td>Bruker AFM probes</td>
			<td>MLCT</td>
			<td>The cantilevers used were the labeled &#8220;C&#8221; with resonant frequency of 7 to 10 kHz and k: 0.01 N/m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AFM data analysis</td>
			<td>JPK-Bruker</td>
			<td>JPK Data processing version minimum 5.1.8</td>
			<td>Can be downloaded from a JPK-Bruker user acount</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AFM Petri dishes</td>
			<td>WPI</td>
			<td>FluoroDish FD35-100</td>
			<td>The heater was used to monitor the temperature changes during the experiment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Atomic force Microscope (AFM)</td>
			<td>JPK-Bruker</td>
			<td>Nanowizard II or III</td>
			<td>the AFM should be mounted on an inverted optical microscope with a motorized stage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caspofungin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SML0425-5MG</td>
			<td>Caspofungin was used with a concentration of 4 MIC (Minimum Inhibitor Concentration)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Code editor</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td>Visual Studio Code version 1.40.1</td>
			<td>https://code.visualstudio.com/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryobeads</td>
			<td>IFU</td>
			<td>CB12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dessicator/Degassing chamber</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>15594635</td>
			<td>The equipment is used to degassing the PDMS stamps for about 50 minutes any dessicator coupled with a vaccum pump will do.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish heater</td>
			<td>JPK-Bruker</td>
			<td>PetriDishHeater</td>
			<td>This is an add-on to the JPK/Bruker AFM. The heater was used to monitor the temperature changes during the experiment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate buffer pH 5.2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7899</td>
			<td>The solution contains 18 mM sodium acetate, 1 mM CaCl2, and 1 mM MnCl2. Adjust the pH with glacial acetic acid. The solution can be stored at 4 &#176;C for 2 months</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Statistical analysis language</td>
			<td>https://www.r-project.org</td>
			<td>R version 3.6.1</td>
			<td>R is a language and environment for statistical computing and graphics. It is a GNU project which is similar to the S language and environment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Statistical analysis software</td>
			<td>https://rstudio.com</td>
			<td>R studio version 1.1.463</td>
			<td>collaboration between the R Foundation, RStudio, Microsoft, TIBCO, Google, Oracle, HP and others. RStudio and Shiny are affiliated projects of the Foundation for Open Access Statistics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard 184</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>761028</td>
			<td>Polydimethylsiloxane (PDMS) and curing agent in one set</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Peptone D Broth</td>
			<td>Difco</td>
			<td>242820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>YPD Agar</td>
			<td>Difco</td>
			<td>DF0427-17-6</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

automation of bio-atomic force microscope measurements on hundreds of c. albicans cells

O método apresentado neste artigo visa automatizar experimentos Bio-AFM e o registro de curvas de força. Usando este método, é possível registrar curvas de forças em 1000 células em 4 horas automaticamente. Para manter um tempo de análise de 4 horas, o número de curvas de força por célula é reduzido para 9 ou 16. O método combina um programa baseado em Jython e uma estratégia para a montagem de células em padrões definidos. O programa, implementado em um Bio-AFM comercial, pode centralizar a ponta na primeira célula da matriz e, em seguida, mover-se, automaticamente, de célula para célula enquanto grava curvas de força em cada célula. Utilizando essa metodologia, é possível acessar os parâmetros biofísicos das células, como sua rigidez, suas propriedades adesivas, etc. Com a automação e o grande número de células analisadas, pode-se acessar o comportamento da população celular. Este é um avanço no campo Bio-AFM onde os dados foram, até agora, registrados em apenas algumas dezenas de células.

Utilizamos o protocolo descrito para analisar o efeito da caspofungin nas propriedades biofísicas do patógeno humano oportunista C. albicans em sua forma de levedura. Caspofungin é uma última chance de molécula antifúngica usada quando outras drogas são ineficazes devido aos mecanismos de resistência que as células desenvolvem em relação aos antifúngicos. Seu mecanismo de ação baseia-se na inibição da subunidade Fks2 do complexo fks1/Fks2 responsável pela síntese ß glucan. Como os glucas são ...

Watch this Scientific Journal Video about Automation of Bio-Atomic Force Microscope Measurements on Hundreds of C. albicans Cells at JoVE.com

Automation of Bio-Atomic Force Microscope Measurements on Hundreds of C. albicans Cells

Este protocolo visa automatizar as medições de AFM em centenas de células microbianas. Primeiro, micróbios são imobilizados em microestruturas de selo PDMS e, em seguida, as medições de espectroscopia de força são realizadas automaticamente em centenas de células imobilizadas.

Automação de Medições de Microscópio de Força Bio-Atômica em centenas de células de C. albicans

The method presented in this paper aims to automate Bio-AFM experiments and the recording of force curves. Using this method, it is possible to record ...

A automação de microscópios de força atômica é uma inovação fundamental na evolução da tecnologia para aplicações biomédicas. Também abre o acesso à investigação das propriedades biomecânicas das populações celulares. Nosso método permite gravar medições de AFM para 1.000 células em quatro horas, em comparação com os métodos usuais, que levam quatro horas para medir 10 células, este é realmente um ganho significativo de tempo.Se a automação é um pré-requisito para trazer essa tecnologia para laboratórios hospitalares, esse protocolo de prova de conceito sugere seu potencial de uso no desenvolvimento de estratégias específicas de diagnóstico médico. Este protocolo usa uma haste PDMS versátil que pode ser preenchida com vários micróbios permitindo que diferentes sistemas sejam explorados. Para preparar o selo PDMS, misture 55 gramas de solução pré-polímero PDMS a uma relação de massa de 10 para um em PDMs, oligômeros e agente de cura e degas a solução resultante sob vácuo em uma vez 10 para o negativo de uma a uma vezes 10 para as duas barras negativas por cinco a 10 minutos.Quando todas as bolhas de armadilhas tiverem sido removidas, despeje 20 gramas da solução desgaseada em um molde mestre de silício para uma espessura de dois a três milímetros e degas novamente. Quando todas as bolhas tiverem sido removidas, reticule o PDMS a 80 graus Celsius por uma hora e use um bisturi para cortar o selo micro estruturado PDMS paralelo às matrizes de microestrutura visível. Em seguida, retire o carimbo do molde mestre de silício e coloque o local da microestrutura de selo em um escorregador de vidro com as micro estruturas alinhadas com o lado do slide.Para preparar as células para o dispositivo, centrífugas 600 microliters da suspensão celular de interesse e adicionar 200 microliters do supernatante ao selo. Degas o supernatante sob vácuo por cerca de 40 minutos. Quando todas as bolhas tiverem sido removidas, substitua o supernascer da superfície PDMS por 200 microliters da solução celular resuspended para uma incubação de 15 minutos à temperatura ambiente.Para carregar as células nas micro estruturas do selo, use um slide de vidro mantido em um ângulo de 30 a 50 graus para espalhar as células através do selo em ambas as direções, várias vezes conforme necessário. Quando uma alta taxa de enchimento das microestruturas for alcançada, use uma pipeta para remover a suspensão celular e lave as três vezes com um mililitro de tampão de acetato por lavagem para remover quaisquer células não arrastadas. Após a última lavagem, use o fluxo de nitrogênio para secar a parte de trás da amostra e coloque o carimbo em uma placa de Petri.Em seguida, adicione dois mililitros de tampão de acetato fresco ao prato. Para microscopia de força atômica das células, coloque o prato no estágio do microscópio de força atômica e centralizar o palco de zero a zero. Quando o palco estiver centrado, mova a placa para o suporte da placa de Petri do microscópio e alinhe a borda do selo para que seja perpendicular ao eixo y do suporte da placa de Petri.Em seguida, coloque a força do microscópio atômico de cabeça para o palco, tomando cuidado para que os motores do estepe sejam suficientemente estendidos para evitar que a ponta caia sobre o selo. Para imagens, use os botões do microscópio para centralizar a ponta do microscópio de força atômica sobre o canto esquerdo dos poços de micrometro quadrado 4,5 por 4,5 e selecione o modo de mapeamento de força no software do microscópio. Para definir um mapa de força de 64 por 64 sobre uma área de 100 por 100 micrômetros, ajuste o ponto de ajuste relativo para três a cinco nano Newtons, o comprimento Z para quatro micrômetros, o movimento Z para a duração constante, o tempo de extensão para 0,01 segundos, o atraso de extensão a zero, o atraso para zero, o modo de atraso para a força constante , a taxa amostral para 2048 Hertz.Desmarque o laço fechado Z e verifique a imagem quadrada. Defina o acesso rápido a 100 micrômetros, o eixo lento para 100 micrômetros, o X deslocado para zero micrômetros, o Y deslocado para zero micrômetros, o ângulo da grade para zero graus, os pixels para 64 por 64, e a proporção de pixels para um para um. Em seguida, abra o software de automação.Na janela pop-up, selecione o caminho para o arquivo de script. Digite a coordenada W1 na linha variável P1 239 da seção caixa de entradas do script gyfon e o valor de coordenada W2 na linha variável P2 241. Atribua o valor do tom à linha variável de tom 245 do script e insira a dimensão do poço, que pode ser determinada a partir do desenho dos padrões do poço para a linha variável W-S 248.Escreva caminho para o diretório de salvamento na linha 251 para salvar os dados no local desejado e definir a linha variável de área total 254 para o desejo de várias extremidades dos 100 micrômetros. Em seguida, defina a linha de matriz das curvas de força e a coluna registradas por poço na linha variável 257 e clique em execução para iniciar o programa. Para analisar os dados, use o software de código do estúdio de vídeo para abrir o script Python e executar os arquivos de cópia do script Python para organizar os arquivos de curva de força em uma pasta.Insira o caminho para a pasta geral onde os dados serão armazenados. para analisar as curvas de força, abrir o software de processamento de dados do fabricante de microscópio de força atômica. No menu de arquivos, selecione o lote de curvas de espectroscopia.Selecione o processo de arquivo e carga e selecione o processo de rigidez. Selecione a última etapa do processo e clique em manter e aplicar a todos para que todas as curvas de força recebam o mesmo tratamento. Para abrir o script R, carregue os arquivos contendo as informações extraídas com o software de processamento de dados no software do estúdio R.Na janela do ambiente, clique em importar conjunto de dados e, do leitor de texto na janela pop-up, clique em procurar para localizar o arquivo ponto TSV. Uma vez que o arquivo tenha carregado, selecione a região de execução de código e execute tudo para executar todo o código. Aqui, histogramas típicos obtidos usando o protocolo como demonstrado são mostrados.Nesta análise, a repartição da rigidez foi registrada em 957 células nativas, enquanto nesta análise, foi medida a rigidez de 574 células tratadas caspofungin. Saiba que o uso de centenas de células permite que uma distribuição bimodal dos valores seja observada. Em amostras menores, uma única distribuição é tipicamente observada e pode resultar em falta de observação da heterogeneidade populacional.Uma comparação das duas condições destaca os efeitos do Caspofungin na redução da rigidez celular. Reveladas pela comparação ANOVA das células nativas e tratadas, as duas condições apresentam rigidezs altamente, significativamente diferentes. Esse valor foi alcançado devido ao grande número de células analisadas, proporcionando maior confiança nos resultados obtidos.Adicionar o supernante ao selo PDMS antes de jogar repetidamente as células nos poços até que o selo esteja cheio, é fundamental para o sucesso da análise. Nesta prova de conceito, foram analisadas células de candida albicans, mas o protocolo pode ser aplicado a qualquer grupo de células padrão, moléculas ou materiais.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Automation of Bio-Atomic Force Microscope Measurements on Hundreds of C. albicans Cells

Multiplexed Single-molecule Force Proteolysis Measurements Using Magnetic Tweezers

Multiplexados molécula única Força Medidas proteólise, usando uma pinça magnética

The  generation and detection of mechanical forces is a ubiquitous aspect of cell physiology,  with direct relevance to cancer metastasis1, atherogenesis2 ...

Bioengenharia

Candida albicans Biofilm Chip (CaBChip) for High-throughput Antifungal Drug Screening

Candida albicans Biofilm Chip CaBChip for High-throughput Antifungal Drug Screening

Candida albicans biofilme Chip (Ca BChip) para seleção de alto rendimento antifúngico

Candida  albicans remains the main etiological agent of candidiasis, which  currently represents the fourth most common nosocomial bloodstream infection ...

Flexural Rigidity Measurements of Biopolymers Using Gliding Assays

Flexão Medidas rigidez de Biopolímeros usando ensaios de deslizamento

Microtubules are cytoskeletal polymers which  play a role in cell division, cell mechanics, and intracellular transport. Each of these functions requires ...

Biosensor for Detection of Antibiotic Resistant Staphylococcus Bacteria

Biossensor para detecção de bactérias Staphylococcus resistente a antibióticos

A structurally transformed lytic bacteriophage having a broad host range of Staphylococcus aureus strains and a penicillin-binding protein (PBP 2a) ...

Measuring the Mechanical Properties of Living Cells Using Atomic Force Microscopy

Medir as propriedades mecânicas das células vivas Usando Microscopia de Força Atômica

Mechanical  properties of cells and extracellular matrix (ECM) play important roles in many  biological processes including stem cell differentiation, ...

Cell Patterning on Photolithographically Defined 
Parylene-C: SiO2 Substrates

Cell Patterning on Photolithographically Defined 
Parylene-C: SiO2 Substrates

Padronização celular em photolithographically Definido Parylene-C: SiO<sub&gt; 2</sub&gt; Substratos

Cell patterning platforms support broad research goals, such as construction of predefined in vitro neuronal networks and the exploration of certain ...

From Fast Fluorescence Imaging to Molecular Diffusion Law on Live Cell Membranes in a Commercial Microscope

De fast imagens de fluorescência com a Lei difusão molecular em membranas de células vivas em um microscópio comercial

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the ...

Atomic Force Microscopy Imaging and Force Spectroscopy of Supported Lipid Bilayers

Projeção de imagem atômica e força Espectroscopia de Bicamadas Lipídicas suportados

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient ...

Power Input Measurements in Stirred Bioreactors at Laboratory Scale

Entrada de poder de medições em biorreatores mexidas em escala de laboratório

The power input in stirred bioreactors is an important scaling-up parameter and can be measured through the torque that acts on the impeller shaft during ...

Measurement of Force-Sensitive Protein Dynamics in Living Cells Using a Combination of Fluorescent Techniques

Medição da dinâmica de força-sensível da proteína em células vivas, usando uma combinação de técnicas fluorescentes

Cells sense and respond to physical cues in their environment by converting mechanical stimuli into biochemically-detectable signals in a process called ...