Name: automation of bio-atomic force microscope measurements on hundreds of c. albicans cells
Uploaded: 2021-04-02T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Automation of Bio-Atomic Force Microscope Measurements on Hundreds of C. albicans Cells at JoVE.com

Мы хотим отметить FONCYCYT CONACYT (Мексика), Министерство иностранных дел Франции и Университет Париж 13, а также финансовую поддержку международного совместного проекта ECOS-NORD под названием Nano-palpation for diagnostic, No 263337 (Мексика) и MI5P02 (Франция). ЕОМ благодарит SIP-IPN за финансовую поддержку проекта No 20195489. SPC поддерживается стипендией PhD от CONACYT (No 288029) и IPN через соглашение cotutelle для получения двойного сертификата PhD (IPN-UPS). ED и CFD являются исследователями в Национальном центре научных исследований (CNRS).

1. Культура микробных клеток
<ol><li>Оживите клетки из глицеринового запаса. ПРИМЕЧАНИЕ: C. albicans хранят при -80 °C в глицериновых бульонах, на мраморе.<ol>
<li>Выберите шарик при -80 °C и натрите его дрожжевым агаром пептон декстрозы (YPD). Выращивайте клетки в течение 2 дней при 30 °C, перед жидки?...

<ol>
	<li>Cross, S. E., Jin, Y. S., Rao, J., Gimzewski, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanomechanical+analysis+of+cells+from+cancer+patients.">Nanomechanical analysis of cells from cancer patients.</a> Nature Nanotechnology. 2 (12), 780-783 (2007).</li><li>Dague, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+force+and+electron+microscopic-based+study+of+sarcolemmal+surface+of+living+cardiomyocytes+unveils+unexpected+mitochondrial+shift+in+heart+failure.">Atomic force and electron microscopic-based study of sarcolemmal surface of living cardiomyocytes unveils unexpected mitochondrial shift in heart failure.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 74, 162-172 (2014).</li><li>Muller, D. J., Helenius, J., Alsteens, D., Dufrene, Y. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force+probing+surfaces+of+living+cells+to+molecular+resolution.">Force probing surfaces of living cells to molecular resolution.</a> Nature Chemical Biology. 5 (6), 383-390 (2009).</li><li>Dague, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+Force+Microscopy+to+Explore+Electroporation+Effects+on+Cells.">Atomic Force Microscopy to Explore Electroporation Effects on Cells.</a> Handbook of Electroporation. , 1-13 (2016).</li><li>Puntheeranurak, T., Neundlinger, I., Kinne, R. K. H., Hinterdorfer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+recognition+force+spectroscopy+of+transmembrane+transporters+on+living+cells.">Single-molecule recognition force spectroscopy of transmembrane transporters on living cells.</a> Nature Protocols. 6 (9), 1443-1452 (2011).</li><li>Formosa, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoscale+analysis+of+the+effects+of+antibiotics+and+CX1+on+a+Pseudomonas+aeruginosa+multidrug-resistant+strain.">Nanoscale analysis of the effects of antibiotics and CX1 on a Pseudomonas aeruginosa multidrug-resistant strain.</a> Scientific Reports. 2, (2012).</li><li>Pillet, F., Chopinet, L., Formosa, C., Dague, &. #. 2. 0. 1. ;. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+Force+Microscopy+and+pharmacology:+From+microbiology+to+cancerology.">Atomic Force Microscopy and pharmacology: From microbiology to cancerology.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - General Subjects. 1840 (3), 1028-1050 (2014).</li><li>Wu, P. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+methods+to+assess+cell+mechanical+properties.">A comparison of methods to assess cell mechanical properties.</a> Nature Methods. 15 (7), 491-498 (2018).</li><li>Rigato, A., Rico, F., Eghiaian, F., Piel, M., Scheuring, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+Force+Microscopy+Mechanical+Mapping+of+Micropatterned+Cells+Shows+Adhesion+Geometry-Dependent+Mechanical+Response+on+Local+and+Global+Scales.">Atomic Force Microscopy Mechanical Mapping of Micropatterned Cells Shows Adhesion Geometry-Dependent Mechanical Response on Local and Global Scales.</a> ACS Nano. 9 (6), 5846-5856 (2015).</li><li>Favre, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parallel+AFM+imaging+and+force+spectroscopy+using+two-dimensional+probe+arrays+for+applications+in+cell+biology.">Parallel AFM imaging and force spectroscopy using two-dimensional probe arrays for applications in cell biology.</a> Journal of Molecular Recognition. 24 (3), 446-452 (2011).</li><li>Dujardin, A., Wolf, P. D., Lafont, F., Dupres, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+multi-sample+acquisition+and+analysis+using+atomic+force+microscopy+for+biomedical+applications.">Automated multi-sample acquisition and analysis using atomic force microscopy for biomedical applications.</a> PLOS ONE. 14 (3), 0213853 (2019).</li><li>Formosa, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+living+cell+arrays+for+atomic+force+microscopy+studies.">Generation of living cell arrays for atomic force microscopy studies.</a> Nature Protocols. 10 (1), 199-204 (2015).</li><li>Proa-Coronado, S., S&#233;verac, C., Martinez-Rivas, A., Dague, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+the+paradigm+of+nanomechanical+measurements+on+cells+using+AFM:+an+automated+methodology+to+rapidly+analyse+thousands+of+cells.">Beyond the paradigm of nanomechanical measurements on cells using AFM: an automated methodology to rapidly analyse thousands of cells.</a> Nanoscale Horizons. , (2019).</li><li>Foncy, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+polyurethane+and+epoxy+resist+master+mold+for+nanoscale+soft+lithography.">Comparison of polyurethane and epoxy resist master mold for nanoscale soft lithography.</a> Microelectronic Engineering. 110, 183-187 (2013).</li><li>Unsay, J. D., Cosentino, K., Garc&#237;a-S&#225;ez, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+Force+Microscopy+Imaging+and+Force+Spectroscopy+of+Supported+Lipid+Bilayers.">Atomic Force Microscopy Imaging and Force Spectroscopy of Supported Lipid Bilayers.</a> Journal of Visualized Experiments. (101), e52867 (2015).</li><li>Schiavone, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+combined+chemical+and+enzymatic+method+to+determine+quantitatively+the+polysaccharide+components+in+the+cell+wall+of+yeasts.">A combined chemical and enzymatic method to determine quantitatively the polysaccharide components in the cell wall of yeasts.</a> FEMS Yeast Research. 14 (6), 933-947 (2014).</li><li>Formosa, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoscale+Effects+of+Caspofungin+against+Two+Yeast+Species,+Saccharomyces+cerevisiae+and+Candida+albicans.">Nanoscale Effects of Caspofungin against Two Yeast Species, Saccharomyces cerevisiae and Candida albicans.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 57 (8), 3498-3506 (2013).</li><li>El-Kirat-Chatel, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoscale+analysis+of+caspofungin-induced+cell+surface+remodelling+in+Candida+albicans.">Nanoscale analysis of caspofungin-induced cell surface remodelling in Candida albicans.</a> Nanoscale. 5 (3), 1105-1115 (2013).</li><li>Peric, O., Hannebelle, M., Adams, J. D., Fantner, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+bacterial+traps+for+simultaneous+fluorescence+and+atomic+force+microscopy.">Microfluidic bacterial traps for simultaneous fluorescence and atomic force microscopy.</a> Nano Research. 10 (11), 3896-3908 (2017).</li></ol>

Основным улучшением, обеспечиваемым данной методологией, является значительное увеличение количества измеряемых клеток за определенный промежуток времени. Аналогом является уменьшение количества точек, измеренных на ячейку. Это означает, что этот метод не предназначен для обеспече?...

Эта работа предоставляет методологию для выполнения автоматических измерений силы на сотнях живых клеток с использованием атомно-силового микроскопа (AFM). Он также предоставляет метод иммобилизации микробов на микроструктурированной марке PDMS, который совместим с экспериментами AFM, проводимыми в жидкой среде.
Bio-AFM - это узкоспециализированная технология, разработанная для применения в биологии, а затем используемая для изучения живых клеток. Для этого требуется обученный инженер, который может анализировать одну клетку в то время. В этих условиях количество различных клеток, которые могут быть проанализированы, довольно мало, типично от 5 до 10 клеток за 4-5 часов. Однако количество измерений силы, регистрируемых на одной ячейке, обычно очень велико и может легко достигать 1000. Таким образом, текущая парадигма измерения силы AFM на живых клетках заключается в регистрации сотен кривых силы (ФК), но на ограниченном числе клеток.
Статистически такой подход вызывает сомнения, и поднимает вопрос о репрезентативности выборки. Действительно, трудно, например, оценить гетерогенность клеточной популяции, измеряя только несколько клеток, даже если на этих нескольких клетках регистрируются сотни измерений. Однако именно на основе этой парадигмы были достигнуты значительные успехи в биофизике, микробиологии и наномедицине1,2,3. Действительно, нанометровый анализ в масштабе одиночных клеток дал новую информацию по клеточной наномеханике, об организации трансмембранных белков или механизме действия противомикробных или противоопухолевых препаратов4,5,6,7. Однако в последнее время появилось несколько высокопроизводительных биомеханических тестов, проведенных на клетках8,показывающих заинтересованность научного сообщества в изменении этой парадигмы и доступе к гетерогенности клеточной популяции. Все эти тесты полагаются на микрофлюидные системы для деформирования клеток и оптического измерения их деформации под напряжением для получения косвенной меры их общей поверхностнойэластичности 8. Однако важной проблемой этих методов является то, что они являются монопараметрическими: можно исследовать только эластичность клеток. Более того, они не позволяют измерять механические параметры адгезивных клеток, что может быть ограничено для исследований нециркулирующих клеток млекопитающих или биопленок, например.
Подходы с участием AFM были разработаны командами S. Scheuring9 и M. Favre10. Scheuring et al. иммобилизовалы клетки на фибронектиновых паттернах9,заставляя отдельные клетки принимать форму паттерна9. Затем эта команда наметила механические свойства нескольких ячеек, чтобы определить средние данные, представляющие от 14 до 18 клеток. Разработка, выполненная Farve et al., направлена на мультиплексирование измерений путем распараллеливания кантилеверов AFM10. Насколько нам известно, эта работа в направлении мультиплексирования не привела к измерениям на живых клетках.
Интересный подход, предложенный командой Дюжардена, представляет собой автоматизированный AFM, способный идентифицировать клетки и визуализывать их на дне изготовленных на заказ скважин. Хотя этот метод не позволяет проводить анализ большой популяции клеток, он позволяет автоматически тестировать различные условия в каждой скважине11.
Наша цель в этой работе более амбициозна, так как мы хотели измерить не менее 1000 клеток для доступа не к средней клетке, а, наоборот, к гетерогенности между клетками. Стратегия, которую мы разработали здесь для доступа к гетерогенности клеточной популяции с помощью AFM, основана на анализе сотен клеток, на которых регистрируется ограниченное количество кривых силы. По сравнению с «классическим» подходом, записывающим большое количество кривых силы на ограниченном числе ячеек, этот подход следует рассматривать как комплементарный, поскольку он не дает такой же информации. Действительно, в то время как типичный метод позволяет исследовать гетерогенность отдельной клеточной поверхности, используя наш подход, мы можем получить доступ ко всей гетерогенности клеточной популяции. Для достижения этой цели мы объединили метод, который непосредственно обездвиживает микробов (здесь дрожжевой вид Candida albicans)в колодцы PDMS микроструктурированного штампа12,и разработали оригинальную программу для автоматического перемещения наконечника AFM из клетки в клетку13 и измерения механических свойств каждой клетки.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>AFM cantilever</td>
			<td>Bruker AFM probes</td>
			<td>MLCT</td>
			<td>The cantilevers used were the labeled &#8220;C&#8221; with resonant frequency of 7 to 10 kHz and k: 0.01 N/m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AFM data analysis</td>
			<td>JPK-Bruker</td>
			<td>JPK Data processing version minimum 5.1.8</td>
			<td>Can be downloaded from a JPK-Bruker user acount</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AFM Petri dishes</td>
			<td>WPI</td>
			<td>FluoroDish FD35-100</td>
			<td>The heater was used to monitor the temperature changes during the experiment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Atomic force Microscope (AFM)</td>
			<td>JPK-Bruker</td>
			<td>Nanowizard II or III</td>
			<td>the AFM should be mounted on an inverted optical microscope with a motorized stage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caspofungin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SML0425-5MG</td>
			<td>Caspofungin was used with a concentration of 4 MIC (Minimum Inhibitor Concentration)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Code editor</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td>Visual Studio Code version 1.40.1</td>
			<td>https://code.visualstudio.com/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryobeads</td>
			<td>IFU</td>
			<td>CB12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dessicator/Degassing chamber</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>15594635</td>
			<td>The equipment is used to degassing the PDMS stamps for about 50 minutes any dessicator coupled with a vaccum pump will do.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish heater</td>
			<td>JPK-Bruker</td>
			<td>PetriDishHeater</td>
			<td>This is an add-on to the JPK/Bruker AFM. The heater was used to monitor the temperature changes during the experiment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate buffer pH 5.2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7899</td>
			<td>The solution contains 18 mM sodium acetate, 1 mM CaCl2, and 1 mM MnCl2. Adjust the pH with glacial acetic acid. The solution can be stored at 4 &#176;C for 2 months</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Statistical analysis language</td>
			<td>https://www.r-project.org</td>
			<td>R version 3.6.1</td>
			<td>R is a language and environment for statistical computing and graphics. It is a GNU project which is similar to the S language and environment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Statistical analysis software</td>
			<td>https://rstudio.com</td>
			<td>R studio version 1.1.463</td>
			<td>collaboration between the R Foundation, RStudio, Microsoft, TIBCO, Google, Oracle, HP and others. RStudio and Shiny are affiliated projects of the Foundation for Open Access Statistics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard 184</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>761028</td>
			<td>Polydimethylsiloxane (PDMS) and curing agent in one set</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Peptone D Broth</td>
			<td>Difco</td>
			<td>242820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>YPD Agar</td>
			<td>Difco</td>
			<td>DF0427-17-6</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

automation of bio-atomic force microscope measurements on hundreds of c. albicans cells

Метод, представленный в этой статье, направлен на автоматизацию экспериментов Bio-AFM и регистрацию кривых силы. Используя этот метод, можно автоматически записывать кривые сил на 1000 ячейках за 4 часа. Для поддержания 4-часового времени анализа количество кривых силы на ячейку уменьшается до 9 или 16. Метод сочетает в себе программу на основе Jython и стратегию сборки ячеек по определенным шаблонам. Программа, реализованная на коммерческом Bio-AFM, может центрировать наконечник на первой ячейке массива, а затем автоматически перемещаться от ячейки к ячейке, записывая кривые силы на каждой клетке. Используя эту методологию, можно получить доступ к биофизическим параметрам клеток, таким как их жесткость, их адгезионные свойства и т. Д. Благодаря автоматизации и большому количеству проанализированных клеток можно получить доступ к поведению клеточной популяции. Это прорыв в области Bio-AFM, где данные до сих пор были записаны только на нескольких десятках клеток.

Мы использовали описанный протокол для анализа влияния каспофунгина на биофизические свойства условно-патогенного микроорганизма человека C. albicans в его дрожжевой форме. Каспофунгин является противогрибковой молекулой последнего шанса, используемой, когда другие препараты неэф?...

Watch this Scientific Journal Video about Automation of Bio-Atomic Force Microscope Measurements on Hundreds of C. albicans Cells at JoVE.com

Automation of Bio-Atomic Force Microscope Measurements on Hundreds of C. albicans Cells

Этот протокол направлен на автоматизацию измерений AFM на сотнях микробных клеток. Сначала микробы иммобилизуются в микроструктуры штампа PDMS, а затем измерения силовой спектроскопии выполняются автоматически на сотнях иммобилизованных клеток.

Автоматизация измерений биоатомным силовым микроскопом на сотнях клеток C. albicans

The method presented in this paper aims to automate Bio-AFM experiments and the recording of force curves. Using this method, it is possible to record ...

Автоматизация атомно-силового микроскопа является ключевой инновацией в эволюции технологии в направлении биомедицинских применений. Это также открывает доступ к исследованию биомеханических свойств клеточных популяций. Наш метод позволяет записывать измерения AFM для 1000 клеток за четыре часа, по сравнению с обычными методами, которые занимают четыре часа для измерения 10 клеток, это действительно значительный выигрыш времени.Если автоматизация является необходимым условием для приведения этой технологии в больничные лаборатории, этот протокол доказательства концепции предполагает ее потенциал для использования в разработке конкретных медицинских диагностических стратегий. Этот протокол использует универсальный стержень PDMS, который может быть заполнен различными микробами, что позволяет исследовать различные системы. Для приготовления штампа PDMS смешайте 55 граммов раствора преполимерного раствора PDMS в соотношении масс 10 к одному в PDM, олигомерах и отверждающем агенте и дегазируйте полученный раствор под вакуумом в один раз 10 до отрицательного один к одному раз 10 к отрицательным двум барам в течение пяти-10 минут.Когда все пузырьки ловушек будут удалены, вылейте 20 граммов дегазированного раствора на силиконовую главную форму толщиной от двух до трех миллиметров и снова дегазуйте. Когда все пузырьки будут удалены, сетчаться PDMS при 80 градусах Цельсия в течение одного часа и использовать скальпель, чтобы разрезать микроструктурированную печать PDMS параллельно видимым массивам микроструктуры. Затем снимите штамп с силиконовой мастер-формы и поместите сайт микроструктуры штампа вверх на стеклянный слайд с микроструктурами, выровненными со стороной слайда.Чтобы подготовить ячейки к устройству, центрифугируют 600 микролитров интересующей ячейки суспензии и добавляют 200 микролитров супернатанта на штамп. Дегазить супернатант под вакуумом в течение примерно 40 минут. Когда все пузырьки будут удалены, замените супернатант с поверхности PDMS 200 микролитрами повторно суспендированного клеточного раствора для 15-минутной инкубации при комнатной температуре.Чтобы загрузить ячейки в микроструктуры штампа, используйте стеклянный слайд, удерживаемый под углом от 30 до 50 градусов, чтобы распределить ячейки по штампу в обоих направлениях, несколько раз по мере необходимости. Когда достигнута высокая скорость заполнения микроструктур, используйте пипетку для удаления клеточной суспензии и промывайте три раза одним миллилитром ацетатного буфера за одну промывку, чтобы удалить любые незацепленные ячейки. После последней промывки используйте поток азота, чтобы высушить заднюю часть образца и поместите штамп в чашку Петри.Затем добавьте в блюдо два миллилитра свежего ацетатного буфера. Для атомно-силовой микроскопии клеток поместите тарелку на сцену атомно-силового микроскопа и центрируете сцену от нуля до нуля. Когда сцена будет центрирована, переместите чашку в держатель чашки Петри микроскопа и выровняйте край штампа так, чтобы он был перпендикулярен оси Y держателя чашки Петри.Затем поместите головку атомного микроскопа на сцену, позаботясь о том, чтобы шаговые двигатели были достаточно вытянуты, чтобы избежать столкновения наконечника с штампом. Для визуализации используйте ручки микроскопа, чтобы центрировать наконечник атомно-силового микроскопа над левым углом скважин с площадью 4,5 на 4,5 квадратных микрометра и выбрать режим картирования силы в программном обеспечении микроскопа. Чтобы установить карту сил 64 на 64 на площади 100 на 100 микрометров, установите относительное заданное значение от трех до пяти наноньютонов, длину Z до четырех микрометров, движение Z до постоянной длительности, время продления до 0,01 секунды, задержку расширения до нуля, задержку втягивания до нуля, режим задержки до постоянной силы , частота дискретизации до 2048 Гц.Снимите флажок Z замкнутый цикл и проверьте квадратное изображение. Установите быстрый доступ к 100 микрометрам, медленную ось до 100 микрометров, смещение X к нулю микрометру, смещение Y к нулю микрометров, угол сетки до нуля градусов, пиксели до 64 на 64 и отношение пикселей к одному. Затем откройте программное обеспечение автоматизации.Во всплывающем окне выберите путь к файлу сценария. Введите координату W1 в строке переменной P1 239 секции поля ввода скрипта gyfon и значение координаты W2 в строке переменной P2 241. Отнесем значение шага к переменной линии 245 шага скрипта и введите размер скважины, который может быть определен из проектирования паттернов скважины в линию переменной W-S 248.Запишите путь к каталогу сохранения в строке 251 для сохранения данных в нужном месте и установите переменную общей площади строки 254 на желаемую на несколько концов 100 микрометров. Затем задайте кривые силы матрицы строки и столбца, записанные для каждой скважины в переменной number scans строки 257 и нажмите кнопку run, чтобы запустить программу. Чтобы проанализировать данные, используйте программное обеспечение video studio code, чтобы открыть скрипт Python и выполнить копирование файлов Скрипт Python для организации файлов кривой силы в одну папку.Введите путь к общей папке, в которой будут храниться данные. для анализа силовых кривых, откройте атомно-силовой микроскоп производителя программного обеспечения для обработки данных. В меню файл выберите пакет кривых спектроскопии.Затем выберите файл и процесс загрузки, а затем выберите процесс жесткости. Выберите последний шаг процесса и нажмите сохранить и применить ко всем, чтобы все кривые силы получали одинаковую обработку. Чтобы открыть скрипт R, загрузите файлы, содержащие информацию, извлеченную с помощью программного обеспечения для обработки данных, в программное обеспечение R studio.В окне среды щелкните Импорт набора данных и во всплывающем окне средства чтения текста нажмите кнопку Обзор, чтобы найти файл TSV с точками. После загрузки файла выберите область выполнения кода и запустите все, чтобы выполнить весь код. Здесь показаны типичные гистограммы, полученные с использованием показанного протокола.В этом анализе перераспределение жесткости было зарегистрировано на 957 нативных клетках, в то время как в этом анализе была измерена жесткость 574 клеток, обработанных каспофунгином. Знайте, что использование сотен ячеек позволяет наблюдать бимодальное распределение значений. В небольших выборках обычно наблюдается однократное распределение, которое может привести к отсутствию наблюдения за гетерогенностью популяции.Сравнение двух состояний подчеркивает влияние Каспофунгина на снижение жесткости клеток. В результате сравнения ANOVA нативных и обработанных клеток эти два состояния демонстрируют высокую, значительно различную жесткость. Это значение было достигнуто за счет большого количества анализируемых клеток, обеспечивающих большую уверенность в полученных результатах.Добавление супернатанта к штампу PDMS перед многократной промывкой ячеек в скважины до тех пор, пока штамп не будет заполнен, имеет решающее значение для успеха анализа. В этом доказательстве концепции были проанализированы клетки Candida albicans, но протокол может быть применен к любой группе клеток-паттернов, молекул или материалов.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Automation of Bio-Atomic Force Microscope Measurements on Hundreds of C. albicans Cells

Multiplexed Single-molecule Force Proteolysis Measurements Using Magnetic Tweezers

Мультиплексный одиночных молекул группы Протеолиз измерений с использованием магнитных пинцет

The  generation and detection of mechanical forces is a ubiquitous aspect of cell physiology,  with direct relevance to cancer metastasis1, atherogenesis2 ...

Candida albicans Biofilm Chip (CaBChip) for High-throughput Antifungal Drug Screening

Candida albicans Biofilm Chip CaBChip for High-throughput Antifungal Drug Screening

Candida Albicans биопленки Chip (Ca BChip) для высокой пропускной Противогрибковые Скрининг наркотиков

Candida  albicans remains the main etiological agent of candidiasis, which  currently represents the fourth most common nosocomial bloodstream infection ...

Flexural Rigidity Measurements of Biopolymers Using Gliding Assays

Жесткость на изгиб измерений биополимеров Использование Gliding Анализы

Microtubules are cytoskeletal polymers which  play a role in cell division, cell mechanics, and intracellular transport. Each of these functions requires ...

Biosensor for Detection of Antibiotic Resistant Staphylococcus Bacteria

Биосенсоров для обнаружения устойчивых к антибиотикам бактерий Staphylococcus

A structurally transformed lytic bacteriophage having a broad host range of Staphylococcus aureus strains and a penicillin-binding protein (PBP 2a) ...

Measuring the Mechanical Properties of Living Cells Using Atomic Force Microscopy

Измерение механических свойств живых клеток с помощью атомно-силовой микроскопии

Mechanical  properties of cells and extracellular matrix (ECM) play important roles in many  biological processes including stem cell differentiation, ...

Cell Patterning on Photolithographically Defined 
Parylene-C: SiO2 Substrates

Cell Patterning on Photolithographically Defined 
Parylene-C: SiO2 Substrates

Сотовый Patterning на фотолитографически установленными Parylene-C: SiO<sub&gt; 2</sub&gt; Подложки

Cell patterning platforms support broad research goals, such as construction of predefined in vitro neuronal networks and the exploration of certain ...

From Fast Fluorescence Imaging to Molecular Diffusion Law on Live Cell Membranes in a Commercial Microscope

От быстрого флуоресценции визуализации к молекулярной диффузии Закона о живых клеточных мембран в торговом микроскоп

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the ...

Atomic Force Microscopy Imaging and Force Spectroscopy of Supported Lipid Bilayers

Атомно-силовая микроскопия изображений и силовая спектроскопия поддерживаемых липидного бислоя

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient ...

Power Input Measurements in Stirred Bioreactors at Laboratory Scale

Мощность входных измерения в перемешиваемой биореакторов лабораторного масштаба

The power input in stirred bioreactors is an important scaling-up parameter and can be measured through the torque that acts on the impeller shaft during ...

Measurement of Force-Sensitive Protein Dynamics in Living Cells Using a Combination of Fluorescent Techniques

Измерение силы чувствительных белка динамики в живых клетках, используя комбинацию люминесцентные методы

Cells sense and respond to physical cues in their environment by converting mechanical stimuli into biochemically-detectable signals in a process called ...