Name: automation of bio-atomic force microscope measurements on hundreds of c. albicans cells
Uploaded: 2021-04-02T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Automation of Bio-Atomic Force Microscope Measurements on Hundreds of C. albicans Cells at JoVE.com

Queremos reconocer a FONCYCYT de CONACYT (México), el ministerio de Relaciones Exteriores de Francia y la Universidad París 13, a través del apoyo financiero del proyecto colaborativo internacional ECOS-NORD llamado Nano-palpación para el diagnóstico, No. 263337 (México) y MI5P02 (Francia). AMR desea agradecer el apoyo financiero de SIP-IPN a través del proyecto No. 20195489. SPC es apoyado por una beca de doctorado de CONACYT (No. 288029) e IPN a través del acuerdo cotutelle para obtener doble certificado de doctorado (IPN-UPS). ED y CFD son investigadores del Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS).

1. Cultivo celular microbiano
<ol><li>Revivir las células de una culata de glicerol. NOTA: C. albicans se almacenan a -80 °C en existencias de glicerol, en mármoles.<ol>
<li>Recoger un mármol en el stock de -80 °C y frotarlo en levadura peptona dextrosa (YPD) agar. Cultivar las células durante 2 días a 30 °C, antes del cultivo líquido.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparar cultivos líquidos.<ol>
<li>Llene un tubo de cultivo con 5 mL de caldo YPD estéril y agregue una sola colonia de células de C. ...

<ol>
	<li>Cross, S. E., Jin, Y. S., Rao, J., Gimzewski, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanomechanical+analysis+of+cells+from+cancer+patients.">Nanomechanical analysis of cells from cancer patients.</a> Nature Nanotechnology. 2 (12), 780-783 (2007).</li><li>Dague, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+force+and+electron+microscopic-based+study+of+sarcolemmal+surface+of+living+cardiomyocytes+unveils+unexpected+mitochondrial+shift+in+heart+failure.">Atomic force and electron microscopic-based study of sarcolemmal surface of living cardiomyocytes unveils unexpected mitochondrial shift in heart failure.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 74, 162-172 (2014).</li><li>Muller, D. J., Helenius, J., Alsteens, D., Dufrene, Y. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force+probing+surfaces+of+living+cells+to+molecular+resolution.">Force probing surfaces of living cells to molecular resolution.</a> Nature Chemical Biology. 5 (6), 383-390 (2009).</li><li>Dague, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+Force+Microscopy+to+Explore+Electroporation+Effects+on+Cells.">Atomic Force Microscopy to Explore Electroporation Effects on Cells.</a> Handbook of Electroporation. , 1-13 (2016).</li><li>Puntheeranurak, T., Neundlinger, I., Kinne, R. K. H., Hinterdorfer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+recognition+force+spectroscopy+of+transmembrane+transporters+on+living+cells.">Single-molecule recognition force spectroscopy of transmembrane transporters on living cells.</a> Nature Protocols. 6 (9), 1443-1452 (2011).</li><li>Formosa, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoscale+analysis+of+the+effects+of+antibiotics+and+CX1+on+a+Pseudomonas+aeruginosa+multidrug-resistant+strain.">Nanoscale analysis of the effects of antibiotics and CX1 on a Pseudomonas aeruginosa multidrug-resistant strain.</a> Scientific Reports. 2, (2012).</li><li>Pillet, F., Chopinet, L., Formosa, C., Dague, &. #. 2. 0. 1. ;. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+Force+Microscopy+and+pharmacology:+From+microbiology+to+cancerology.">Atomic Force Microscopy and pharmacology: From microbiology to cancerology.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - General Subjects. 1840 (3), 1028-1050 (2014).</li><li>Wu, P. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+methods+to+assess+cell+mechanical+properties.">A comparison of methods to assess cell mechanical properties.</a> Nature Methods. 15 (7), 491-498 (2018).</li><li>Rigato, A., Rico, F., Eghiaian, F., Piel, M., Scheuring, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+Force+Microscopy+Mechanical+Mapping+of+Micropatterned+Cells+Shows+Adhesion+Geometry-Dependent+Mechanical+Response+on+Local+and+Global+Scales.">Atomic Force Microscopy Mechanical Mapping of Micropatterned Cells Shows Adhesion Geometry-Dependent Mechanical Response on Local and Global Scales.</a> ACS Nano. 9 (6), 5846-5856 (2015).</li><li>Favre, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parallel+AFM+imaging+and+force+spectroscopy+using+two-dimensional+probe+arrays+for+applications+in+cell+biology.">Parallel AFM imaging and force spectroscopy using two-dimensional probe arrays for applications in cell biology.</a> Journal of Molecular Recognition. 24 (3), 446-452 (2011).</li><li>Dujardin, A., Wolf, P. D., Lafont, F., Dupres, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+multi-sample+acquisition+and+analysis+using+atomic+force+microscopy+for+biomedical+applications.">Automated multi-sample acquisition and analysis using atomic force microscopy for biomedical applications.</a> PLOS ONE. 14 (3), 0213853 (2019).</li><li>Formosa, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+living+cell+arrays+for+atomic+force+microscopy+studies.">Generation of living cell arrays for atomic force microscopy studies.</a> Nature Protocols. 10 (1), 199-204 (2015).</li><li>Proa-Coronado, S., S&#233;verac, C., Martinez-Rivas, A., Dague, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+the+paradigm+of+nanomechanical+measurements+on+cells+using+AFM:+an+automated+methodology+to+rapidly+analyse+thousands+of+cells.">Beyond the paradigm of nanomechanical measurements on cells using AFM: an automated methodology to rapidly analyse thousands of cells.</a> Nanoscale Horizons. , (2019).</li><li>Foncy, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+polyurethane+and+epoxy+resist+master+mold+for+nanoscale+soft+lithography.">Comparison of polyurethane and epoxy resist master mold for nanoscale soft lithography.</a> Microelectronic Engineering. 110, 183-187 (2013).</li><li>Unsay, J. D., Cosentino, K., Garc&#237;a-S&#225;ez, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+Force+Microscopy+Imaging+and+Force+Spectroscopy+of+Supported+Lipid+Bilayers.">Atomic Force Microscopy Imaging and Force Spectroscopy of Supported Lipid Bilayers.</a> Journal of Visualized Experiments. (101), e52867 (2015).</li><li>Schiavone, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+combined+chemical+and+enzymatic+method+to+determine+quantitatively+the+polysaccharide+components+in+the+cell+wall+of+yeasts.">A combined chemical and enzymatic method to determine quantitatively the polysaccharide components in the cell wall of yeasts.</a> FEMS Yeast Research. 14 (6), 933-947 (2014).</li><li>Formosa, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoscale+Effects+of+Caspofungin+against+Two+Yeast+Species,+Saccharomyces+cerevisiae+and+Candida+albicans.">Nanoscale Effects of Caspofungin against Two Yeast Species, Saccharomyces cerevisiae and Candida albicans.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 57 (8), 3498-3506 (2013).</li><li>El-Kirat-Chatel, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoscale+analysis+of+caspofungin-induced+cell+surface+remodelling+in+Candida+albicans.">Nanoscale analysis of caspofungin-induced cell surface remodelling in Candida albicans.</a> Nanoscale. 5 (3), 1105-1115 (2013).</li><li>Peric, O., Hannebelle, M., Adams, J. D., Fantner, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+bacterial+traps+for+simultaneous+fluorescence+and+atomic+force+microscopy.">Microfluidic bacterial traps for simultaneous fluorescence and atomic force microscopy.</a> Nano Research. 10 (11), 3896-3908 (2017).</li></ol>

La principal mejora proporcionada por esta metodología es un aumento significativo en el número de células medidas en una cantidad determinada de tiempo. La contraparte es una reducción del número de puntos medidos por celda. Esto significa que este método no está diseñado para proporcionar un análisis detallado de una sola celda. El método sólo se aplica a las celdas que pueden caber en los pozos del sello PDMS. El sello es bastante versátil, mientras que contiene pozos de 1,5 x 1,5 μm2 hasta 6 x...

Este trabajo proporciona una metodología para realizar mediciones automáticas de fuerza en cientos de células vivas utilizando un microscopio de fuerza atómica (AFM). También proporciona un método para inmovilizar microbios en un sello microestructurado PDMS que es compatible con experimentos AFM realizados en un entorno líquido.
Bio-AFM es una tecnología altamente especializada concebida para aplicaciones en biología y luego utilizada para estudiar células vivas. Se requiere un ingeniero capacitado que pueda analizar una célula en ese momento. En estas condiciones, el número de células diferentes que se pueden analizar es bastante pequeño, típico de 5 a 10 células en 4-5 horas. Sin embargo, la cantidad de mediciones de fuerza registradas en una sola celda suelen ser muy altas y pueden llegar fácilmente a 1000. Por lo tanto, el paradigma actual de las mediciones de fuerza AFM en células vivas es registrar cientos de curvas de fuerza (FCs) pero en un número limitado de células.
Estadísticamente, este enfoque es cuestionable y plantea la cuestión de la representatividad de la muestra. De hecho, es difícil, por ejemplo, evaluar la heterogeneidad de una población celular midiendo sólo unas pocas células, incluso si se registran cientos de mediciones en estas pocas células. Sin embargo, es sobre la base de este paradigma que se han realizado importantes avances en biofísica, microbiología y nanomedicina1,2,3. De hecho, el análisis nanométrico a escala de células individuales ha proporcionado nueva información sobre la nanomecánica celular, sobre la organización de las proteínas transmembrana, o el mecanismo de acción de los fármacos antimicrobianos o anticancerígenos4,5,6,7. Sin embargo, recientemente han surgido varias pruebas biomecánicas de alto rendimiento realizadas en células8,mostrando el interés de la comunidad científica en cambiar este paradigma y acceder a la heterogeneidad de la población celular. Todos estos ensayos se basan en sistemas microfluídicos para deformar las células y medir ópticamente su deformación bajo tensión para obtener una medida indirecta de su elasticidad superficial global8. Sin embargo, un problema importante con estos métodos es que son mono-paramétricos: sólo la elasticidad celular puede ser sondeada. Además, no permiten la medición de los parámetros mecánicos de las células adherentes, lo que puede ser limitante para los estudios de células de mamíferos no circulantes o biopelículas, por ejemplo.
Los enfoques que involucran AFM han sido desarrollados por los equipos de S. Scheuring9 y M. Favre10. Células inmovilizadas de Scheuring et al. en patrones de fibronectina9, obligando a las células individuales a tomar la forma del patrón9. Luego, este equipo mapeó las propiedades mecánicas de unas pocas celdas para definir datos promedio, representativos de 14 a 18 celdas. El desarrollo llevado a cabo por Farve et al. tuvo como objetivo multiplexar las mediciones mediante la paralelización de los voladizos AFM10. A nuestro conocimiento, este trabajo en la dirección de multiplexación no ha llevado a las medidas en células vivas.
Un enfoque interesante propuesto por el equipo de Dujardin presenta un AFM automatizado capaz de identificar células y realizar imágenes de ellas en el fondo de pozos hechos a medida. Aunque este método no permite el análisis de una gran población de células, permite la prueba automática de diferentes condiciones en cada pozo11.
Nuestro objetivo en este trabajo es más ambicioso ya que hemos querido medir al menos 1000 células para acceder no a una célula media, sino, por el contrario, a la heterogeneidad entre células. La estrategia que desarrollamos aquí para acceder a la heterogeneidad de la población celular utilizando AFM se basa en el análisis de cientos de células en las que se registra un número limitado de curvas de fuerza. En comparación con el enfoque "clásico" de registrar un gran número de curvas de fuerza en un número limitado de células, este enfoque debe considerarse complementario, ya que no proporciona la misma información. De hecho, mientras que el método típico permite sondear la heterogeneidad de la superficie celular individual, utilizando nuestro enfoque, podemos acceder a toda la heterogeneidad de la población celular. Para lograr este objetivo, hemos combinado un método que inmoviliza directamente los microbios (aquí la especie de levadura Candida albicans)en los pocillos de un sello microestructurado PDMS12,y desarrolla un programa original para mover la punta AFM, automáticamente, de célula a célula13 y medir las propiedades mecánicas de cada célula.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>AFM cantilever</td>
			<td>Bruker AFM probes</td>
			<td>MLCT</td>
			<td>The cantilevers used were the labeled &#8220;C&#8221; with resonant frequency of 7 to 10 kHz and k: 0.01 N/m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AFM data analysis</td>
			<td>JPK-Bruker</td>
			<td>JPK Data processing version minimum 5.1.8</td>
			<td>Can be downloaded from a JPK-Bruker user acount</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AFM Petri dishes</td>
			<td>WPI</td>
			<td>FluoroDish FD35-100</td>
			<td>The heater was used to monitor the temperature changes during the experiment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Atomic force Microscope (AFM)</td>
			<td>JPK-Bruker</td>
			<td>Nanowizard II or III</td>
			<td>the AFM should be mounted on an inverted optical microscope with a motorized stage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caspofungin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SML0425-5MG</td>
			<td>Caspofungin was used with a concentration of 4 MIC (Minimum Inhibitor Concentration)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Code editor</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td>Visual Studio Code version 1.40.1</td>
			<td>https://code.visualstudio.com/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryobeads</td>
			<td>IFU</td>
			<td>CB12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dessicator/Degassing chamber</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>15594635</td>
			<td>The equipment is used to degassing the PDMS stamps for about 50 minutes any dessicator coupled with a vaccum pump will do.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish heater</td>
			<td>JPK-Bruker</td>
			<td>PetriDishHeater</td>
			<td>This is an add-on to the JPK/Bruker AFM. The heater was used to monitor the temperature changes during the experiment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate buffer pH 5.2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7899</td>
			<td>The solution contains 18 mM sodium acetate, 1 mM CaCl2, and 1 mM MnCl2. Adjust the pH with glacial acetic acid. The solution can be stored at 4 &#176;C for 2 months</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Statistical analysis language</td>
			<td>https://www.r-project.org</td>
			<td>R version 3.6.1</td>
			<td>R is a language and environment for statistical computing and graphics. It is a GNU project which is similar to the S language and environment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Statistical analysis software</td>
			<td>https://rstudio.com</td>
			<td>R studio version 1.1.463</td>
			<td>collaboration between the R Foundation, RStudio, Microsoft, TIBCO, Google, Oracle, HP and others. RStudio and Shiny are affiliated projects of the Foundation for Open Access Statistics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard 184</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>761028</td>
			<td>Polydimethylsiloxane (PDMS) and curing agent in one set</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Peptone D Broth</td>
			<td>Difco</td>
			<td>242820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>YPD Agar</td>
			<td>Difco</td>
			<td>DF0427-17-6</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

automation of bio-atomic force microscope measurements on hundreds of c. albicans cells

El método presentado en este trabajo tiene como objetivo automatizar los experimentos bio-AFM y el registro de curvas de fuerza. Usando este método, es posible registrar curvas de fuerzas en 1000 celdas en 4 horas automáticamente. Para mantener un tiempo de análisis de 4 horas, el número de curvas de fuerza por celda se reduce a 9 o 16. El método combina un programa basado en Jython y una estrategia para ensamblar células en patrones definidos. El programa, implementado en un Bio-AFM comercial, puede centrar la punta en la primera celda de la matriz y luego moverse, automáticamente, de una celda a otra mientras registra las curvas de fuerza en cada celda. Utilizando esta metodología, es posible acceder a los parámetros biofísicos de las células como su rigidez, sus propiedades adhesivas, etc. Con la automatización y el gran número de células analizadas, se puede acceder al comportamiento de la población celular. Este es un gran avance en el campo Bio-AFM donde los datos, hasta ahora, se han registrado en sólo unas pocas decenas de células.

Utilizamos el protocolo descrito para analizar el efecto del caspofungin sobre las propiedades biofísicas de los albicans humanos oportunistas de C. del patógeno en su forma de levadura. Caspofungin es una molécula antihongos de la última ocasión usada cuando otras drogas son ineficaces debido a los mecanismos de la resistencia que las células desarrollan hacia antihongos. Su mecanismo de acción se basa en la inhibición de la subunidad Fks2 del complejo fks1/Fks2 responsable de la síntesis de glucano ß...

Watch this Scientific Journal Video about Automation of Bio-Atomic Force Microscope Measurements on Hundreds of C. albicans Cells at JoVE.com

Automation of Bio-Atomic Force Microscope Measurements on Hundreds of C. albicans Cells

Este protocolo tiene como objetivo automatizar las mediciones de AFM en cientos de células microbianas. En primer lugar, los microbios se inmovilizan en microestructuras de sello PDMS y luego las mediciones de espectroscopia de fuerza se realizan automáticamente en cientos de células inmovilizadas.

Automatización De Las Mediciones De Microscopio De Fuerza Bio-Atómica En Cientos De Células De C. albicans

The method presented in this paper aims to automate Bio-AFM experiments and the recording of force curves. Using this method, it is possible to record ...

La automatización del microscopio de fuerza atómica es una innovación clave en la evolución de la tecnología hacia aplicaciones biomédicas. También se abre el acceso a la investigación de las propiedades biomecánicas de las poblaciones celulares. Nuestro método permite registrar mediciones de AFM para 1,000 células en cuatro horas, en comparación con los métodos habituales, que toman cuatro horas para medir 10 células, esto es realmente una ganancia significativa de tiempo.Si la automatización es un requisito previo para llevar esta tecnología a los laboratorios hospitalarios, este protocolo de prueba de concepto sugiere su potencial para su uso en el desarrollo de estrategias de diagnóstico médico específicas. Este protocolo utiliza un tallo PDMS versátil que se puede llenar con varios microbios que permiten explorar diferentes sistemas. Para preparar el sello PDMS, mezcle 55 gramos de solución prepolímero PDMS en una relación de masa de 10 a una en PDMs, oligómeros y agente de curado y desgaste la solución resultante al vacío una vez 10 a la negativa una a una vez 10 veces 10 a las dos barras negativas durante cinco a 10 minutos.Cuando se hayan eliminado todas las burbujas de las trampas, vierta 20 gramos de la solución desgastada en un molde maestro de silicio a un espesor de dos a tres milímetros y desgasificar de nuevo. Cuando se hayan eliminado todas las burbujas, reticular el PDMS a 80 grados Celsius durante una hora y usar un bisturí para cortar el sello microestructurado pdms paralelo a las matrices de microestructura visibles. Luego, desprenda el sello del molde maestro de silicio y coloque el sitio de microestructura de sello en una diapositiva de vidrio con las micro estructuras alineadas con el lado de la diapositiva.Para preparar las celdas para el dispositivo, centrífuga 600 microlitros de la suspensión celular de interés y agregue 200 microlitros del sobrenadante al sello. Desgasificar el sobrenadante al vacío durante unos 40 minutos. Cuando se hayan eliminado todas las burbujas, substituya el sobrenadante de la superficie del PDMS con 200 microlitros de la solución de células resuspended para una incubación de 15 minutos a temperatura ambiente.Para cargar las celdas en las micro estructuras del sello, utilice un portaobjetos de vidrio sostenido en un ángulo de 30 a 50 grados para extender las celdas a través del sello en ambas direcciones, varias veces según sea necesario. Cuando se haya logrado una alta tasa de llenado de las microestructuras, utilice una pipeta para eliminar la suspensión de la célula y lave las tres veces con un mililitro de tampón de acetato por lavado para eliminar cualquier célula sin atraquear. Después del último lavado, use el flujo de nitrógeno para secar la parte posterior de la muestra y coloque el sello en una placa de Petri.A continuación, añadir dos mililitros de tampón de acetato fresco al plato. Para la microscopía de fuerza atómica de las células, coloque el plato en la etapa del microscopio de fuerza atómica y centre la etapa de cero a cero. Cuando el escenario se haya centrado, mueva la placa al soporte de la placa petri del microscopio y alinee el borde del sello para que sea perpendicular al eje y del soporte de la placa Petri.Luego coloque la cabeza de fuerza del microscopio atómico en el escenario, teniendo cuidado de que los motores paso a paso estén lo suficientemente extendidos para evitar que la punta se estrelle contra el sello. Para obtener imágenes, utilice las perillas del microscopio para centrar la punta del microscopio de fuerza atómica sobre la esquina izquierda de los pozos de micromedios cuadrados de 4,5 por 4,5 metros y seleccione el modo de mapeo de fuerza en el software del microscopio. Para establecer un mapa de fuerza de 64 por 64 sobre un área de 100 por 100 micrómetros, establezca el punto de configuración relativo en tres a cinco nano Newtons, la longitud Z en cuatro micrómetros, el movimiento Z a duración constante, el tiempo de extensión a 0,01 segundos, el retardo de extensión a cero, el retardo de retracción a cero, el modo de retardo a fuerza constante , la velocidad de muestreo a 2048 Hertz.Desmarque Z bucle cerrado y compruebe la imagen cuadrada. Establezca el acceso rápido a 100 micrómetros, el eje lento a 100 micrómetros, el desplazamiento X a cero micrómetros, el desplazamiento Y a cero micrómetros, el ángulo de la cuadrícula a cero grados, los píxeles a 64 por 64 y la proporción de píxeles a uno a uno. A continuación, abra el software de automatización.En la ventana emergente, seleccione la ruta hacia el archivo de script. Introduzca la coordenada W1 en la línea variable P1 239 de la sección del cuadro de entradas del script gyfon y el valor de la coordenada W2 en la línea variable P2 241. Atribuya el valor de tono a la línea de variable de tono 245 del script e ingrese la dimensión del pozo, que se puede determinar a partir del diseño de los patrones de pozo en la línea variable W-S 248.Escriba la ruta al directorio de almacenamiento en la línea 251 para guardar los datos en el lugar deseado y establezca la línea variable de área total 254 al deseo en el extremo múltiple de los 100 micrómetros. A continuación, establezca la fila de la matriz de curvas de fuerza y la columna registrada por pozo en la línea variable de escaneos numéricos 257 y haga clic en ejecutar para iniciar el programa. Para analizar los datos, utilice el software de código video studio para abrir el script de Python y ejecutar el script de Python copy files para organizar los archivos de curva de fuerza en una carpeta.Introduzca la ruta de acceso a la carpeta general donde se almacenarán los datos. para analizar las curvas de fuerza, abra el software de procesamiento de datos del fabricante del microscopio de fuerza atómica. En el menú archivo, seleccione lote de curvas de espectroscopia.A continuación, seleccione el archivo y el proceso de carga, y seleccione el proceso de rigidez. Seleccione el último paso del proceso y haga clic en mantener y aplicar a todos para que todas las curvas de fuerza reciban el mismo tratamiento. Para abrir el script de R, cargue los archivos que contienen la información extraída con el software de procesamiento de datos en el software de estudio de R.En la ventana del entorno, haga clic en Importar conjunto de datos y, en el lector de texto de la ventana emergente, haga clic en Examinar para localizar el archivo TSV de puntos. Una vez cargado el archivo, seleccione la región de ejecución de código y ejecute todo para ejecutar todo el código. Aquí, se muestran los histogramas típicos obtenidos utilizando el protocolo como se muestra.En este análisis, la rigidez repartición se registró en 957 células nativas, mientras que en este análisis, se midió la rigidez de 574 células tratadas con caspofungina. Sepa que el uso de cientos de celdas permite una distribución bi-modal de los valores a observar. En muestras más pequeñas, normalmente se observa una sola distribución que puede resultar en la falta de observación de la heterogeneidad de la población.Una comparación de las dos condiciones destaca los efectos de caspofungina en la reducción de la rigidez celular. A revelado por la comparación de ANOVA de las células nativas y tratadas, las dos condiciones exhiben altamente, tiesuras perceptiblemente diversas. Este valor se alcanzó debido al gran número de células analizadas, proporcionando una mayor confianza en los resultados obtenidos.Agregar el sobrenadante al sello PDMS antes de vaciar repetidamente las celdas en los pozos hasta que el sello esté lleno, es fundamental para el éxito del análisis. En esta prueba de concepto, las células de los albicans de la candida eran analizadas pero el protocolo se puede aplicar a cualquier grupo de células, de moléculas, o de materiales del patrón.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Automation of Bio-Atomic Force Microscope Measurements on Hundreds of C. albicans Cells

Multiplexed Single-molecule Force Proteolysis Measurements Using Magnetic Tweezers

Multiplexado de una sola molécula de mediciones de la Fuerza proteólisis utilizando pinzas magnéticas

The  generation and detection of mechanical forces is a ubiquitous aspect of cell physiology,  with direct relevance to cancer metastasis1, atherogenesis2 ...

Investigación

Bioingeniería

Candida albicans Biofilm Chip (CaBChip) for High-throughput Antifungal Drug Screening

Candida albicans Biofilm Chip CaBChip for High-throughput Antifungal Drug Screening

Candida albicans biofilm Chip (Ca BChip) para la selección de alto rendimiento antifúngico

Candida  albicans remains the main etiological agent of candidiasis, which  currently represents the fourth most common nosocomial bloodstream infection ...

Flexural Rigidity Measurements of Biopolymers Using Gliding Assays

Medidas de flexión rigidez de biopolímeros utilizando ensayos de Vuelo a Vela

Microtubules are cytoskeletal polymers which  play a role in cell division, cell mechanics, and intracellular transport. Each of these functions requires ...

Biosensor for Detection of Antibiotic Resistant Staphylococcus Bacteria

Biosensor para la detección de antibióticos Las bacterias estafilococo resistentes

A structurally transformed lytic bacteriophage having a broad host range of Staphylococcus aureus strains and a penicillin-binding protein (PBP 2a) ...

Measuring the Mechanical Properties of Living Cells Using Atomic Force Microscopy

Medición de las propiedades mecánicas de las células vivas mediante microscopía de fuerza atómica

Mechanical  properties of cells and extracellular matrix (ECM) play important roles in many  biological processes including stem cell differentiation, ...

Cell Patterning on Photolithographically Defined 
Parylene-C: SiO2 Substrates

Cell Patterning on Photolithographically Defined 
Parylene-C: SiO2 Substrates

Patrones celular en fotolitográficamente Definido Parylene-C: SiO<sub&gt; 2</sub&gt; Sustratos

Cell patterning platforms support broad research goals, such as construction of predefined in vitro neuronal networks and the exploration of certain ...

From Fast Fluorescence Imaging to Molecular Diffusion Law on Live Cell Membranes in a Commercial Microscope

De Fluorescencia Fast Imaging a la Ley de Difusión Molecular en membranas de células vivas en un microscopio Comercial

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the ...

Atomic Force Microscopy Imaging and Force Spectroscopy of Supported Lipid Bilayers

Fuerza Atómica Microscopía Imaging y Fuerza Espectroscopia de admitidos Bilayers lípidos

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient ...

Power Input Measurements in Stirred Bioreactors at Laboratory Scale

Medidas de entrada de potencia en biorreactores agitados a escala de laboratorio

The power input in stirred bioreactors is an important scaling-up parameter and can be measured through the torque that acts on the impeller shaft during ...

Measurement of Force-Sensitive Protein Dynamics in Living Cells Using a Combination of Fluorescent Techniques

Medición de la proteína sensible a la fuerza dinámica en células vivas usando una combinación de técnicas fluorescentes

Cells sense and respond to physical cues in their environment by converting mechanical stimuli into biochemically-detectable signals in a process called ...