Name: automation of bio-atomic force microscope measurements on hundreds of c. albicans cells
Uploaded: 2021-04-02T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Automation of Bio-Atomic Force Microscope Measurements on Hundreds of C. albicans Cells at JoVE.com

Vi vill erkänna FONCYCYT of CONACYT (Mexiko), Frankrikes utrikesministerium och Université Paris 13, även om det ekonomiska stödet från det internationella samarbetsprojektet ECOS-NORD heter Nano-palpation for diagnosis, No. 263337 (Mexico) och MI5P02 (Frankrike). AMR vill tacka det ekonomiska stödet från SIP-IPN genom projektet Nr. 20195489. SPC stöds av ett doktorandstipendium från CONACYT (nr 288029) och IPN genom cotutelle-avtalet för att erhålla dubbla doktorandcertifikat (IPN-UPS). ED och CFD är forskare vid Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS).

1. Mikrobiell cellkultur
<ol><li>Återuppliva celler från ett glycerollager. OBS: C. albicaner lagras vid -80 °C i glycerollager, på kulor.<ol>
<li>Välj en marmor i -80 °C-buljongen och gnugga den på jäst peptone dextros (YPD) agar. Odla cellerna i 2 dagar vid 30 °C, före flytande odling.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Förbered flytande kulturer.<ol>
<li>Fyll ett odlingsrör med 5 ml steril YPD-buljong och tillsätt en enda koloni av C. albicansceller, odlade på YPD-agarplattan.</li>
		<li>Odla ...

<ol>
	<li>Cross, S. E., Jin, Y. S., Rao, J., Gimzewski, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanomechanical+analysis+of+cells+from+cancer+patients.">Nanomechanical analysis of cells from cancer patients.</a> Nature Nanotechnology. 2 (12), 780-783 (2007).</li><li>Dague, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+force+and+electron+microscopic-based+study+of+sarcolemmal+surface+of+living+cardiomyocytes+unveils+unexpected+mitochondrial+shift+in+heart+failure.">Atomic force and electron microscopic-based study of sarcolemmal surface of living cardiomyocytes unveils unexpected mitochondrial shift in heart failure.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 74, 162-172 (2014).</li><li>Muller, D. J., Helenius, J., Alsteens, D., Dufrene, Y. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force+probing+surfaces+of+living+cells+to+molecular+resolution.">Force probing surfaces of living cells to molecular resolution.</a> Nature Chemical Biology. 5 (6), 383-390 (2009).</li><li>Dague, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+Force+Microscopy+to+Explore+Electroporation+Effects+on+Cells.">Atomic Force Microscopy to Explore Electroporation Effects on Cells.</a> Handbook of Electroporation. , 1-13 (2016).</li><li>Puntheeranurak, T., Neundlinger, I., Kinne, R. K. H., Hinterdorfer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+recognition+force+spectroscopy+of+transmembrane+transporters+on+living+cells.">Single-molecule recognition force spectroscopy of transmembrane transporters on living cells.</a> Nature Protocols. 6 (9), 1443-1452 (2011).</li><li>Formosa, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoscale+analysis+of+the+effects+of+antibiotics+and+CX1+on+a+Pseudomonas+aeruginosa+multidrug-resistant+strain.">Nanoscale analysis of the effects of antibiotics and CX1 on a Pseudomonas aeruginosa multidrug-resistant strain.</a> Scientific Reports. 2, (2012).</li><li>Pillet, F., Chopinet, L., Formosa, C., Dague, &. #. 2. 0. 1. ;. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+Force+Microscopy+and+pharmacology:+From+microbiology+to+cancerology.">Atomic Force Microscopy and pharmacology: From microbiology to cancerology.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - General Subjects. 1840 (3), 1028-1050 (2014).</li><li>Wu, P. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+methods+to+assess+cell+mechanical+properties.">A comparison of methods to assess cell mechanical properties.</a> Nature Methods. 15 (7), 491-498 (2018).</li><li>Rigato, A., Rico, F., Eghiaian, F., Piel, M., Scheuring, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+Force+Microscopy+Mechanical+Mapping+of+Micropatterned+Cells+Shows+Adhesion+Geometry-Dependent+Mechanical+Response+on+Local+and+Global+Scales.">Atomic Force Microscopy Mechanical Mapping of Micropatterned Cells Shows Adhesion Geometry-Dependent Mechanical Response on Local and Global Scales.</a> ACS Nano. 9 (6), 5846-5856 (2015).</li><li>Favre, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parallel+AFM+imaging+and+force+spectroscopy+using+two-dimensional+probe+arrays+for+applications+in+cell+biology.">Parallel AFM imaging and force spectroscopy using two-dimensional probe arrays for applications in cell biology.</a> Journal of Molecular Recognition. 24 (3), 446-452 (2011).</li><li>Dujardin, A., Wolf, P. D., Lafont, F., Dupres, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+multi-sample+acquisition+and+analysis+using+atomic+force+microscopy+for+biomedical+applications.">Automated multi-sample acquisition and analysis using atomic force microscopy for biomedical applications.</a> PLOS ONE. 14 (3), 0213853 (2019).</li><li>Formosa, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+living+cell+arrays+for+atomic+force+microscopy+studies.">Generation of living cell arrays for atomic force microscopy studies.</a> Nature Protocols. 10 (1), 199-204 (2015).</li><li>Proa-Coronado, S., S&#233;verac, C., Martinez-Rivas, A., Dague, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+the+paradigm+of+nanomechanical+measurements+on+cells+using+AFM:+an+automated+methodology+to+rapidly+analyse+thousands+of+cells.">Beyond the paradigm of nanomechanical measurements on cells using AFM: an automated methodology to rapidly analyse thousands of cells.</a> Nanoscale Horizons. , (2019).</li><li>Foncy, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+polyurethane+and+epoxy+resist+master+mold+for+nanoscale+soft+lithography.">Comparison of polyurethane and epoxy resist master mold for nanoscale soft lithography.</a> Microelectronic Engineering. 110, 183-187 (2013).</li><li>Unsay, J. D., Cosentino, K., Garc&#237;a-S&#225;ez, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+Force+Microscopy+Imaging+and+Force+Spectroscopy+of+Supported+Lipid+Bilayers.">Atomic Force Microscopy Imaging and Force Spectroscopy of Supported Lipid Bilayers.</a> Journal of Visualized Experiments. (101), e52867 (2015).</li><li>Schiavone, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+combined+chemical+and+enzymatic+method+to+determine+quantitatively+the+polysaccharide+components+in+the+cell+wall+of+yeasts.">A combined chemical and enzymatic method to determine quantitatively the polysaccharide components in the cell wall of yeasts.</a> FEMS Yeast Research. 14 (6), 933-947 (2014).</li><li>Formosa, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoscale+Effects+of+Caspofungin+against+Two+Yeast+Species,+Saccharomyces+cerevisiae+and+Candida+albicans.">Nanoscale Effects of Caspofungin against Two Yeast Species, Saccharomyces cerevisiae and Candida albicans.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 57 (8), 3498-3506 (2013).</li><li>El-Kirat-Chatel, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoscale+analysis+of+caspofungin-induced+cell+surface+remodelling+in+Candida+albicans.">Nanoscale analysis of caspofungin-induced cell surface remodelling in Candida albicans.</a> Nanoscale. 5 (3), 1105-1115 (2013).</li><li>Peric, O., Hannebelle, M., Adams, J. D., Fantner, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+bacterial+traps+for+simultaneous+fluorescence+and+atomic+force+microscopy.">Microfluidic bacterial traps for simultaneous fluorescence and atomic force microscopy.</a> Nano Research. 10 (11), 3896-3908 (2017).</li></ol>

Den största förbättringen med denna metod är en betydande ökning av antalet uppmätta celler på en bestämd tidsperiod. Motparten är en minskning av antalet uppmätta poäng per cell. Det betyder att den här metoden inte är utformad för att ge en detaljerad analys av en enda cell. Metoden gäller endast celler som får plats i PDMS-stämpeln. Stämpeln är ganska mångsidig, medan den innehåller brunnar på 1,5 x 1,5 μm2 upp till 6 x 6 μm2. Fortfarande är det omöjligt att immobilisera...

Detta arbete ger en metodik för att utföra automatiska kraftmätningar på hundratals levande celler med hjälp av ett atomkraftmikroskop (AFM). Det ger också en metod för att immobilisera mikrober på en PDMS-mikrostrukturerad stämpel som är kompatibel med AFM-experiment som utförs i en flytande miljö.
Bio-AFM är en högspecialiserad teknik som utformats för tillämpningar inom biologi och sedan använts för att studera levande celler. Det kräver en utbildad ingenjör som kan analysera en cell vid den tiden. Under dessa förhållanden är antalet olika celler som kan analyseras ganska litet, typiskt 5 till 10 celler på 4-5 timmar. Mängden kraftmätningar som registreras på en enda cell är dock vanligtvis mycket hög och kan lätt nå 1000. Således är det nuvarande paradigmet för AFM-kraftmätningar på levande celler att registrera hundratals kraftkurvor (FCs) men på ett begränsat antal celler.
Statistiskt sett är detta tillvägagångssätt diskutabelt och tar upp frågan om urvalets representativitet. Det är faktiskt svårt att till exempel utvärdera en cellpopulations heterogenitet genom att bara mäta ett fåtal celler, även om hundratals mätningar registreras på dessa få celler. Det är dock på grundval av detta paradigm som stora framsteg har gjorts inom biofysik, mikrobiologi och nanomedicin1,2,3. Nanometeranalys i samma skala som enstaka celler har gett ny information om cellulär nanomekanik, om organisationen av transmembranproteiner eller verkningsmekanismen för antimikrobiella läkemedel eller cancerläkemedel4,5,6,7. Nyligen har dock flera biomekaniska tester med hög genomströmning som utförts på cellerdykt upp 8, vilket visar forskarsamhällets intresse för att ändra detta paradigm och få tillgång till cellpopulationens heterogenitet. Dessa tester är alla beroende av mikrofluidiska system för att deformera celler och optiskt mäta deras deformation under stress för att erhålla ett indirekt mått på deras totala ytelasticitet8. En viktig fråga med dessa metoder är dock att de är monoparmetriska: endast cellelasticitet kan undersökas. Dessutom tillåter de inte mätning av de mekaniska parametrarna för vidhäftande celler, vilket kan vara begränsande för studier av icke-ylekterande däggdjursceller eller biofilmer till exempel.
Metoder som involverar AFM har utvecklats av teamen S. Scheuring9 och M. Favre10. Intrigerande et al. immobiliserade celler på fibronectinmönster9, vilket tvingar enskilda celler att ta formen avmönstret 9. Sedan kartlade det här teamet de mekaniska egenskaperna för några celler för att definiera genomsnittliga data, representativa för 14 till 18 celler. Den utveckling som Utförs av Farve m.fl. syftar till att multiplexera mätningarna genom att parallellisera AFM-kantilevers10. Vår kännedom om detta arbete i multiplexriktningen har inte lett till mätningar på levande celler.
Ett intressant tillvägagångssätt som föreslås av Dujardins team presenterar en automatiserad AFM som kan identifiera celler och avbilda dem längst ner i skräddarsydda brunnar. Även om denna metod inte tillåter analys av en stor population av celler, tillåter den automatisk testning av olika förhållanden i varje brunn11.
Vårt mål i detta arbete är mer ambitiöst eftersom vi ville mäta minst 1000 celler för att få tillgång till inte en genomsnittlig cell, utan tvärtom heterogeniteten mellan celler. Strategin som vi utvecklade här för att få tillgång till cellpopulationens heterogenitet med hjälp av AFM bygger på analys av hundratals celler där ett begränsat antal kraftkurvor registreras. Jämfört med den "klassiska" metoden att registrera ett stort antal kraftkurvor på ett begränsat antal celler, bör detta tillvägagångssätt betraktas som komplement eftersom det inte ger samma information. Medan den typiska metoden tillåter en att undersöka individuell cellyta heterogenitet, med hjälp av vårt tillvägagångssätt, kan vi komma åt hela cellpopulationens heterogenitet. För att uppnå detta mål har vi kombinerat en metod som direkt immobiliserar mikrober (här jästarten Candida albicans) i brunnarna i en PDMS-mikrostruktureradstämpel 12, och utvecklar ett originalprogram för att flytta AFM-spetsen automatiskt från cell till cell13 och mäta de mekaniska egenskaperna hos varje cell.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>AFM cantilever</td>
			<td>Bruker AFM probes</td>
			<td>MLCT</td>
			<td>The cantilevers used were the labeled &#8220;C&#8221; with resonant frequency of 7 to 10 kHz and k: 0.01 N/m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AFM data analysis</td>
			<td>JPK-Bruker</td>
			<td>JPK Data processing version minimum 5.1.8</td>
			<td>Can be downloaded from a JPK-Bruker user acount</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AFM Petri dishes</td>
			<td>WPI</td>
			<td>FluoroDish FD35-100</td>
			<td>The heater was used to monitor the temperature changes during the experiment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Atomic force Microscope (AFM)</td>
			<td>JPK-Bruker</td>
			<td>Nanowizard II or III</td>
			<td>the AFM should be mounted on an inverted optical microscope with a motorized stage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caspofungin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SML0425-5MG</td>
			<td>Caspofungin was used with a concentration of 4 MIC (Minimum Inhibitor Concentration)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Code editor</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td>Visual Studio Code version 1.40.1</td>
			<td>https://code.visualstudio.com/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryobeads</td>
			<td>IFU</td>
			<td>CB12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dessicator/Degassing chamber</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>15594635</td>
			<td>The equipment is used to degassing the PDMS stamps for about 50 minutes any dessicator coupled with a vaccum pump will do.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish heater</td>
			<td>JPK-Bruker</td>
			<td>PetriDishHeater</td>
			<td>This is an add-on to the JPK/Bruker AFM. The heater was used to monitor the temperature changes during the experiment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate buffer pH 5.2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7899</td>
			<td>The solution contains 18 mM sodium acetate, 1 mM CaCl2, and 1 mM MnCl2. Adjust the pH with glacial acetic acid. The solution can be stored at 4 &#176;C for 2 months</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Statistical analysis language</td>
			<td>https://www.r-project.org</td>
			<td>R version 3.6.1</td>
			<td>R is a language and environment for statistical computing and graphics. It is a GNU project which is similar to the S language and environment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Statistical analysis software</td>
			<td>https://rstudio.com</td>
			<td>R studio version 1.1.463</td>
			<td>collaboration between the R Foundation, RStudio, Microsoft, TIBCO, Google, Oracle, HP and others. RStudio and Shiny are affiliated projects of the Foundation for Open Access Statistics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard 184</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>761028</td>
			<td>Polydimethylsiloxane (PDMS) and curing agent in one set</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Peptone D Broth</td>
			<td>Difco</td>
			<td>242820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>YPD Agar</td>
			<td>Difco</td>
			<td>DF0427-17-6</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

automation of bio-atomic force microscope measurements on hundreds of c. albicans cells

Metoden som presenteras i detta dokument syftar till att automatisera Bio-AFM-experiment och registrering av kraftkurvor. Med den här metoden är det möjligt att registrera kraftkurvor på 1000 celler på 4 timmar automatiskt. För att bibehålla en 4 timmars analystid minskas antalet kraftkurvor per cell till 9 eller 16. Metoden kombinerar ett Jython-baserat program och en strategi för att montera celler på definierade mönster. Programmet, som implementeras på en kommersiell Bio-AFM, kan centrera spetsen på matrisens första cell och sedan automatiskt flytta från cell till cell medan du registrerar kraftkurvor på varje cell. Med hjälp av denna metod är det möjligt att komma åt cellernas biofysiska parametrar som deras styvhet, deras självhäftande egenskaper etc. Med automatiseringen och det stora antalet celler analyserade kan man komma åt cellpopulationens beteende. Detta är ett genombrott inom bio-AFM-området där data hittills bara har registrerats på ett fåtal tiotals celler.

Vi använde det beskrivna protokollet för att analysera effekten av caspofungin på de biofysiska egenskaperna hos den opportunistiska mänskliga patogenen C. albicans i dess jästform. Caspofungin är en sista chans svampdödande molekyl som används när andra läkemedel är ineffektiva på grund av de resistensmekanismer celler utvecklas mot svampdödande. Dess verkningsmekanism är baserad på hämningen av underenheten Fks2 av de komplexa fks1/Fks2 som ansvarar för ß glucansyntesen. Eftersom ß glukaner ...

Watch this Scientific Journal Video about Automation of Bio-Atomic Force Microscope Measurements on Hundreds of C. albicans Cells at JoVE.com

Automation of Bio-Atomic Force Microscope Measurements on Hundreds of C. albicans Cells

Detta protokoll syftar till att automatisera AFM-mätningar på hundratals mikrobiella celler. Först immobiliseras mikrober i PDMS-stämpelmikrostrukturer och sedan utförs kraftspektroskopimätningar automatiskt på hundratals immobiliserade celler.

Automatisering av bioatomära kraftmikroskopmätningar på hundratals C. albicansceller

The method presented in this paper aims to automate Bio-AFM experiments and the recording of force curves. Using this method, it is possible to record ...

Automatisering av atomkraftmikroskop är en viktig innovation i utvecklingen av tekniken mot biomedicinska tillämpningar. Det öppnar också för en undersökning av cellpopulationens biomekaniska egenskaper. Vår metod gör det möjligt att registrera AFM-mätningar för 1 000 celler på fyra timmar, jämfört med de vanliga metoderna, som tar fyra timmar att mäta 10 celler, detta är verkligen en betydande tidsökning.Om automatisering är en förutsättning för att föra in denna teknik i sjukhuslaboratorier, tyder detta konceptbevis på dess potential att användas i utvecklingen av specifika medicinska diagnostiska strategier. Detta protokoll använder en mångsidig PDMS-stam som kan fyllas med olika mikrober så att olika system kan utforskas. För att förbereda PDMS-stämpeln, blanda 55 gram PDMS-prepolymerlösning vid ett 10 till ett massförhållande i PDMs, oligomerer och härdningsmedel och avgasa den resulterande lösningen under vakuum vid en tidpunkt 10 till den negativa till en gånger 10 till de negativa två staplarna i fem till 10 minuter.När alla fällor bubblor har tagits bort, häll 20 gram av den avgasade lösningen på en silikon master mögel till en två till tre millimeter tjocklek och avgaser igen. När alla bubblor har tagits bort, retikulera PDMS vid 80 grader Celsius i en timme och använd en skalpell för att klippa PDMS mikrostrukturerade stämpel parallellt med de synliga mikrostrukturmatriserna. Skala sedan stämpeln från silikon master mögel och placera stämpel mikrostrukturen på en glasbild med mikrostrukturerna i linje med sidan av bilden.För att förbereda cellerna för enheten, centrifug 600 mikroliter av cellupphängningen av intresse och tillsätt 200 mikroliter av supernaten på stämpeln. Avgasa supernatanten under vakuum i ca 40 minuter. När alla bubblor har tagits bort, byt ut supernatanten från PDMS-ytan mot 200 mikroliter av den återanvända celllösningen för en 15 minuters inkubation vid rumstemperatur.För att ladda cellerna i stämpelens mikrostrukturer, Använd en glasbild som hålls i 30 till 50 graders vinkel för att sprida cellerna över stämpeln i båda riktningarna, flera gånger vid behov. När en hög påfyllningshastighet av mikrostrukturerna har uppnåtts, använd en pipett för att ta bort cellupphängningen och tvätta de tre gångerna med en milliliter acetatbuffert per tvätt för att ta bort eventuella obundna celler. Efter den sista tvätten, använd kväveflödet för att torka baksidan av provet och placera stämpeln i en petriskål.Tillsätt sedan två milliliter färsk acetatbuffert till skålen. För atomkraftmikroskopi av cellerna, placera skålen på atomkraftmikroskopstadiet och centrera scenen vid noll till noll. När scenen har centrerats, flytta skålen in i mikroskopet Petri skålhållare och rikta kanten på stämpeln så att den är vinkelrät mot petriskålhållarens y-axel.Placera sedan atommikroskopkrafthuvudet på scenen och se till att stegmotorerna är tillräckligt utsträckta för att undvika att spetsen kraschar på stämpeln. För avbildning, använd mikroskopknopparna för att centrera atomkraftmikroskopspetsen över det vänstra hörnet av de 4,5 av 4,5 kvadratiska mikromätarbrunnarna och välj kraftmappningsläget i mikroskopprogramvaran. Om du vill ställa in en 64 gånger 64 kraftkarta över ett 100 gånger 100 mikrometer stort område ställer du in den relativa bördpunkten på tre till fem nano Newtons, Z-längden till fyra mikrometer, Z-rörelsen till konstant varaktighet, förlängningstiden till 0,01 sekunder, förlängningsfördröjningen till noll, upprullningsfördröjningen till noll, fördröjningsläget till konstant kraft , urvalsfrekvensen till 2048 Hertz.Avmarkera Z stängd slinga och kontrollera fyrkantig bild. Ställ in den snabba åtkomsten till 100 mikrometer, den långsamma axeln till 100 mikrometer, X-förskjutningen till noll mikrometer, Y-förskjutningen till noll mikrometer, rutnätsvinkeln till noll grader, pixlarna till 64 x 64 och pixelförhållandet till en till en. Öppna sedan automatiseringsprogramvaran.Markera sökvägen mot skriptfilen i popup-fönstret. Ange W1-koordinaten på P1-variabelraden 239 i avsnittet indata i gyfonskriptet och W2-koordinatvärdet på P2-variabelraden 241. Tillskriv tonhöjdsvärdet till tonhöjdsvariabeln linje 245 i skriptet och mata in brunnsdimensionen, som kan bestämmas från brunnsmönstrens utformning till W-S-variabelraden 248.Skriv sökvägen till sparkatalogen på rad 251 för att spara data på önskad plats och ställ in den totala områdesvariabelraden 254 till önskan till flera ände av de 100 mikrometrarna. Ställ sedan in matrisraden och kolumnen för kraftkurvor som registrerats per brunn i nummerskanningens variabla rad 257 och klicka på kör för att starta programmet. Om du vill analysera data använder du programvaran för videostudiokod för att öppna Python-skriptet och köra kopieringsfilerna Python-skriptet för att ordna kraftkurvafilerna i en mapp.Ange sökvägen till den allmänna mappen där data ska lagras. för att analysera kraftkurvorna, öppna programvaran för databehandling av atomkraftmikroskoptillverkaren. Välj batch med spektroskopikurvor på arkivmenyn.Välj sedan fil- och inläsningsprocess och välj styvhetsprocessen. Välj det sista steget i processen och klicka på behåll och tillämpa på alla så att alla kraftkurvor får samma behandling. Om du vill öppna R-skriptet läser du in filer som innehåller informationen som extraheras med databehandlingsprogrammet i R-studioprogrammet.Klicka på importera datauppsättning i miljöfönstret och från textläsaren i popup-fönstret klickar du på bläddra för att hitta TSV-filen. När filen har lästs in väljer du området kod kör och kör alla för att köra all kod. Här visas typiska histogram som erhållits med hjälp av protokollet som demonstreras.I denna analys registrerades styvhetsrepartition på 957 inhemska celler, Medan stelheten hos 574 caspofunginbehandlade celler mättes i denna analys. Vet att med hjälp av hundratals celler tillåter en bi-modal fördelning av värdena att observeras. I mindre prover observeras vanligtvis en enda fördelning och kan leda till brist på observation av befolkningens heterogenitet.En jämförelse av de två villkoren belyser effekterna av Caspofungin på att minska cellstelheten. En avslöjas av ANOVA jämförelse av de inhemska och behandlade cellerna, de två villkoren uppvisar mycket, betydligt olika styvheter. Detta värde nåddes på grund av det stora antalet analyserade celler, vilket ger ett större förtroende för de erhållna resultaten.Att lägga till supernaten i PDMS-stämpeln innan du upprepade gånger spolar cellerna i brunnarna tills stämpeln är full, är avgörande för analysens framgång. I detta konceptbevis analyserades Candida albicans celler men protokollet kan tillämpas på alla grupper av mönsterceller, molekyler eller material.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Automation of Bio-Atomic Force Microscope Measurements on Hundreds of C. albicans Cells

Multiplexed Single-molecule Force Proteolysis Measurements Using Magnetic Tweezers

Multiplexade enda molekyl Force proteolys Mätningar med Magnetic pincett

The  generation and detection of mechanical forces is a ubiquitous aspect of cell physiology,  with direct relevance to cancer metastasis1, atherogenesis2 ...

Candida albicans Biofilm Chip (CaBChip) for High-throughput Antifungal Drug Screening

Candida albicans Biofilm Chip CaBChip for High-throughput Antifungal Drug Screening

Candida albicans Biofilm Chip (Ca BChip) för hög genomströmning antimykotikum Screening

Candida  albicans remains the main etiological agent of candidiasis, which  currently represents the fourth most common nosocomial bloodstream infection ...

Flexural Rigidity Measurements of Biopolymers Using Gliding Assays

Böjstyvhet Mätningar av Biopolymerer Använda Gliding Analyser

Microtubules are cytoskeletal polymers which  play a role in cell division, cell mechanics, and intracellular transport. Each of these functions requires ...

Biosensor for Detection of Antibiotic Resistant Staphylococcus Bacteria

Biosensor för detektion av antibiotikaresistenta stafylokocker

A structurally transformed lytic bacteriophage having a broad host range of Staphylococcus aureus strains and a penicillin-binding protein (PBP 2a) ...

Measuring the Mechanical Properties of Living Cells Using Atomic Force Microscopy

Mätning av mekaniska egenskaper i levande celler Använda Atomkraftsmikroskopi

Mechanical  properties of cells and extracellular matrix (ECM) play important roles in many  biological processes including stem cell differentiation, ...

Cell Patterning on Photolithographically Defined 
Parylene-C: SiO2 Substrates

Cell Patterning on Photolithographically Defined 
Parylene-C: SiO2 Substrates

Cell Mönstring på fotolitografiskt Defined Parylen-C: SiO<sub&gt; 2</sub&gt; Substrat

Cell patterning platforms support broad research goals, such as construction of predefined in vitro neuronal networks and the exploration of certain ...

From Fast Fluorescence Imaging to Molecular Diffusion Law on Live Cell Membranes in a Commercial Microscope

Från Snabb fluorescens avbildning till molekylär diffusion lagen om Live cellmembran i en kommersiell mikroskop

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the ...

Atomic Force Microscopy Imaging and Force Spectroscopy of Supported Lipid Bilayers

Atomic Force Microscopy Imaging och Force-spektra enligt stöds lipiddubbelskikt

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient ...

Power Input Measurements in Stirred Bioreactors at Laboratory Scale

Power Input mätningar i rörs bioreaktorer på laboratorieskala

The power input in stirred bioreactors is an important scaling-up parameter and can be measured through the torque that acts on the impeller shaft during ...

Measurement of Force-Sensitive Protein Dynamics in Living Cells Using a Combination of Fluorescent Techniques

Mätning av kraft-känsliga Protein Dynamics i levande celler med hjälp av en kombination av fluorescerande tekniker

Cells sense and respond to physical cues in their environment by converting mechanical stimuli into biochemically-detectable signals in a process called ...