Name: establishment and maintenance of gnotobiotic american cockroaches (periplaneta americana)
Uploaded: 2021-05-28T12:30:00
Duration: 6 min 9 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Establishment and Maintenance of Gnotobiotic American Cockroaches Periplaneta americana at JoVE.com

وقد دعم هذا المنشور المعهد الوطني للعلوم الطبية العامة التابع للمعاهد الوطنية للصحة تحت رقم الجائزة R35GM133789. المحتوى هو فقط مسؤولية المؤلفين ولا يمثل بالضرورة وجهة النظر الرسمية للمعاهد الوطنية للصحة. يود المؤلفون الاعتراف بجوزي داير لتتبع معدلات التعقيم ومعدلات الفقس ومعدلات نمو الصراصير الغنوتوبيوتك.

<ol>
	<li>Yi, P., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+germfree+murine+animal:+An+important+animal+model+for+research+on+the+relationship+between+gut+microbiota+and+the+host.">The germfree murine animal: An important animal model for research on the relationship between gut microbiota and the host.</a> Veterinary Microbiology. 157 (1-2), 1-7 (2012).</li><li>Nature Biotechnology. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laying+better+plans+for+mice.">Laying better plans for mice.</a> Nature Biotechnology. 31 (4), 263-263 (2013).</li><li>Nicklas, W., Keubler, L., Bleich, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintaining+and+Monitoring+the+Defined+Microbiota+Status+of+Gnotobiotic+Rodents.">Maintaining and Monitoring the Defined Microbiota Status of Gnotobiotic Rodents.</a> ILAR Journal. 56 (2), 241-249 (2015).</li><li>Faith, J. J., Ahern, P. P., Ridaura, V. K., Cheng, J., Gordon, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+Gut+Microbe-Host+Phenotype+Relationships+Using+Combinatorial+Communities+in+Gnotobiotic+Mice.">Identifying Gut Microbe-Host Phenotype Relationships Using Combinatorial Communities in Gnotobiotic Mice.</a> Science Translational Medicine. 6 (220), 11 (2014).</li><li>Moon, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vertically+transmitted+faecal+IgA+levels+determine+extra-chromosomal+phenotypic+variation.">Vertically transmitted faecal IgA levels determine extra-chromosomal phenotypic variation.</a> Nature. 521 (7550), 90-93 (2015).</li><li>Eun, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+Bacterial+Antigen-Specific+Colitis+by+a+Simplified+Human+Microbiota+Consortium+in+Gnotobiotic+Interleukin-10-/-+Mice.">Induction of Bacterial Antigen-Specific Colitis by a Simplified Human Microbiota Consortium in Gnotobiotic Interleukin-10-/- Mice.</a> Infection and Immunity. 82 (6), 2239-2246 (2014).</li><li>Cherbuy, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbiota+matures+colonic+epithelium+through+a+coordinated+induction+of+cell+cycle-related+proteins+in+gnotobiotic+rat.">Microbiota matures colonic epithelium through a coordinated induction of cell cycle-related proteins in gnotobiotic rat.</a> American Journal of Physiology: Gastrointestinal and Liver Physiology. 299 (2), 348-357 (2010).</li><li>Van Den Abbeele, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabinoxylans+and+inulin+differentially+modulate+the+mucosal+and+luminal+gut+microbiota+and+mucin-degradation+in+humanized+rats.">Arabinoxylans and inulin differentially modulate the mucosal and luminal gut microbiota and mucin-degradation in humanized rats.</a> Environmental Microbiology. 13 (10), 2667-2680 (2011).</li><li>Stecher, B., Berry, D., Loy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colonization+resistance+and+microbial+ecophysiology:+using+gnotobiotic+mouse+models+and+single-cell+technology+to+explore+the+intestinal+jungle.">Colonization resistance and microbial ecophysiology: using gnotobiotic mouse models and single-cell technology to explore the intestinal jungle.</a> FEMS Microbiology Reviews. 37 (5), 793-829 (2013).</li><li>Sugahara, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probiotic+Bifidobacterium+longum+alters+gut+luminal+metabolism+through+modification+of+the+gut+microbial+community.">Probiotic Bifidobacterium longum alters gut luminal metabolism through modification of the gut microbial community.</a> Scientific Reports. 5 (1), 13548 (2015).</li><li>Mart&#237;n, R., Berm&#250;dez-Humar&#225;n, L. G., Langella, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gnotobiotic+Rodents:+An+In+Vivo+Model+for+the+Study+of+Microbe-Microbe+Interactions.">Gnotobiotic Rodents: An In Vivo Model for the Study of Microbe-Microbe Interactions.</a> Frontiers in Microbiology. 7, 409 (2016).</li><li>Mallapaty, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gnotobiotics:+getting+a+grip+on+the+microbiome+boom.">Gnotobiotics: getting a grip on the microbiome boom.</a> Lab Animal. 46 (10), 373-377 (2017).</li><li>Nguyen, T. L. A., Vieira-Silva, S., Liston, A., Raes, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+informative+is+the+mouse+for+human+gut+microbiota+research.">How informative is the mouse for human gut microbiota research.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 8 (1), 1-16 (2015).</li><li>Correa, M. A., Matusovsky, B., Brackney, D. E., Steven, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+axenic+Aedes+aegypti+demonstrate+live+bacteria+are+not+required+for+mosquito+development.">Generation of axenic Aedes aegypti demonstrate live bacteria are not required for mosquito development.</a> Nature Communications. 9 (1), 4464 (2018).</li><li>Trinder, M., Daisley, B. A., Dube, J. S., Reid, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+melanogaster+as+a+High-Throughput+Model+for+Host&#8211;Microbiota+Interactions.">Drosophila melanogaster as a High-Throughput Model for Host&#8211;Microbiota Interactions.</a> Frontiers in Microbiology. 8, 751 (2017).</li><li>Zheng, H., Steele, M. I., Leonard, S. P., Motta, E. V. S., Moran, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Honey+bees+as+models+for+gut+microbiota+research.">Honey bees as models for gut microbiota research.</a> Lab animal. 47 (11), 317-325 (2018).</li><li>Engel, P., Moran, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+gut+microbiota+of+insects+-+diversity+in+structure+and+function.">The gut microbiota of insects - diversity in structure and function.</a> FeMS Microbiology Reviews. 37 (5), 699-735 (2013).</li><li>Tinker, K. A., Ottesen, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Core+Gut+Microbiome+of+the+American+Cockroach,+Periplaneta+americana,+Is+Stable+and+Resilient+to+Dietary+Shifts.">The Core Gut Microbiome of the American Cockroach, Periplaneta americana, Is Stable and Resilient to Dietary Shifts.</a> Applied and Environmental Microbiology. 82 (22), 6603-6610 (2016).</li><li>Zurek, L., Keddie, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+the+colon+and+colonic+bacterial+flora+to+metabolism+and+development+of+the+american+cockroach+Periplaneta+americana+L.">Contribution of the colon and colonic bacterial flora to metabolism and development of the american cockroach Periplaneta americana L.</a> Journal of Insect Physiology. 42 (8), 743-748 (1996).</li><li>Cruden, D. L., Markovetz, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+aspects+of+the+cockroach+hindgut.">Microbial aspects of the cockroach hindgut.</a> Archives of Microbiology. 138, 131-139 (1984).</li><li>Pietri, J. E., Tiffany, C., Liang, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+the+microbiota+affects+physiological+and+evolutionary+aspects+of+insecticide+resistance+in+the+German+cockroach,+an+important+urban+pest.">Disruption of the microbiota affects physiological and evolutionary aspects of insecticide resistance in the German cockroach, an important urban pest.</a> PLoS ONE. 13 (12), 0207985 (2018).</li><li>Benschoter, C., Wrenn, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germfree+techniques+for+establishment+and+maintenance+of+a+colony+of+aseptic+German+cockroaches.">Germfree techniques for establishment and maintenance of a colony of aseptic German cockroaches.</a> Annals of the Entomological Society of America. 65 (3), 641-644 (1972).</li><li>Tegtmeier, D., Thompson, C. L., Schauer, C., Brune, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen+Affects+Gut+Bacterial+Colonization+and+Metabolic+Activities+in+a+Gnotobiotic+Cockroach+Model.">Oxygen Affects Gut Bacterial Colonization and Metabolic Activities in a Gnotobiotic Cockroach Model.</a> Applied and Environmental Microbiology. 82 (4), 1080-1089 (2016).</li><li>Clayton, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simplified+method+for+the+culture+of+Blattella+germanica+under+aseptic+conditions.">A simplified method for the culture of Blattella germanica under aseptic conditions.</a> Nature. 184 (4693), 1166-1167 (1959).</li><li>Doll, J. P., Trexler, P. C., Reynolds, L. I., Bernard, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Use+of+Peracetic+Acid+to+Obtain+Germfree+Invertebrate+Eggs+for+Gnotobiotic+Studies.">The Use of Peracetic Acid to Obtain Germfree Invertebrate Eggs for Gnotobiotic Studies.</a> American Midland Naturalist. 69 (1), 231 (1963).</li><li>Wada-Katsumata, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gut+bacteria+mediate+aggregation+in+the+German+cockroach.">Gut bacteria mediate aggregation in the German cockroach.</a> Proceedings of the National Academy of Science. 112, 15678-15683 (2015).</li><li>Jahnes, B. C., Herrmann, M., Sabree, Z. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conspecific+coprophagy+stimulates+normal+development+in+a+germ-free+model+invertebrate.">Conspecific coprophagy stimulates normal development in a germ-free model invertebrate.</a> PeerJ. 7, 6914 (2019).</li><li>Mikaelyan, A., Thompson, C. L., Hofer, M. J., Brune, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deterministic+Assembly+of+Complex+Bacterial+Communities+in+Guts+of+Germ-Free+Cockroaches.">Deterministic Assembly of Complex Bacterial Communities in Guts of Germ-Free Cockroaches.</a> Applied Environmental Microbiology. 82 (4), 1256-1263 (2016).</li><li>Katoh, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Group-housed+females+promote+production+of+asexual+ootheca+in+American+cockroaches.">Group-housed females promote production of asexual ootheca in American cockroaches.</a> Zoological Letters. 3, 3 (2017).</li><li>Greenspan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Humidity+fixed+points+of+binary+saturated+aqueous+solutions.">Humidity fixed points of binary saturated aqueous solutions.</a> Journal of Research of the National Bureau of Standards. 81 (1), 89-96 (1976).</li><li>Bressan-Nascimento, S., Oliveira, D. M. P., Fox, E. G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermal+requirements+for+the+embryonic+development+of+Periplaneta+americana+(L.)+(Dictyoptera:+Blattidae)+with+potential+application+in+mass-rearing+of+egg+parasitoids.">Thermal requirements for the embryonic development of Periplaneta americana (L.) (Dictyoptera: Blattidae) with potential application in mass-rearing of egg parasitoids.</a> Biological Control. 47 (3), 268-272 (2008).</li><li>Nation, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Insect Physiology and Biochemistry, Second Edition. , (2008).</li><li>House, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nutritional+studies+with+Blattella+germanica+(L.)+reared+under+aseptic+conditions+I.+Equipment+and+technique.">Nutritional studies with Blattella germanica (L.) reared under aseptic conditions I. Equipment and technique.</a> The Canadian Entomologist. 81 (5), 94-100 (1949).</li><li>Stinson, L. F., Keelan, J. A., Payne, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+removal+of+contaminating+microbial+DNA+from+PCR+reagents:+impact+on+low-biomass+microbiome+analyses.">Identification and removal of contaminating microbial DNA from PCR reagents: impact on low-biomass microbiome analyses.</a> Letters in Applied Microbiology. 68 (1), 2-8 (2018).</li><li>Kircher, M., Sawyer, S., Meyer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double+indexing+overcomes+inaccuracies+in+multiplex+sequencing+on+the+Illumina+platform.">Double indexing overcomes inaccuracies in multiplex sequencing on the Illumina platform.</a> Nucleic Acids Research. 40, 3 (2011).</li><li>Sabree, Z. L., Kambhampati, S., Moran, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitrogen+recycling+and+nutritional+provisioning+by+Blattabacterium,+the+cockroach+endosymbiont.">Nitrogen recycling and nutritional provisioning by Blattabacterium, the cockroach endosymbiont.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of the America. 106 (46), 19521-19526 (2009).</li><li>Ayayee, P. A., Ondrejech, A., Keeney, G., Mu&#241;oz-Garcia, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+gut+microbiota+in+the+regulation+of+standard+metabolic+rate+in+female+Periplaneta+americana.">The role of gut microbiota in the regulation of standard metabolic rate in female Periplaneta americana.</a> PeerJ. 6, 4717 (2018).</li><li>Krajmalnik-Brown, R., Ilhan, Z. E., Kang, D. W., DiBaise, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+gut+microbes+on+nutrient+absorption+and+energy+regulation.">Effects of gut microbes on nutrient absorption and energy regulation.</a> Nutrition in clinical practice : official publication of the American Society for Parenteral and Enteral Nutrition. 27 (2), 201-214 (2012).</li><li>Rowland, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gut+microbiota+functions:+metabolism+of+nutrients+and+other+food+components.">Gut microbiota functions: metabolism of nutrients and other food components.</a> European Journal of Nutrition. 57 (1), 1-24 (2018).</li><li>Gier, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+rate+in+the+cockroach+Periplaneta+americana+(Linn).">Growth rate in the cockroach Periplaneta americana (Linn).</a> Annals of the Entomological Society of America. 40, 303-317 (1947).</li></ol>

ولا يوجد لدى صاحبي البلاغ تضارب في المصالح يكشفان عنه.

طرق أخرى تصف جيل الصراصير الغنوتوبيوتك إما لم تصف جمع oothecae أو استخدمت معايير خاصة بأنواع الصراصير الأخرى للإشارة إلى متى يمكن إزالة oothecae من الأم23و25و26. في الأصل، تم جمع oothecae من الفراش الخشب في خزانات الأسهم، مما أدى إلى معدلات فتحة منخفضة جدا (~ 10٪) مقارنة مع oothecae غير المسترة (47٪)29. هذا هو المرجح يرجع ذلك إلى حقيقة أن oothecae غير المفقس تتراكم مع مرور الوقت في قفص الأسهم، وليس هناك طريقة للتحقق من العمر ootheca أو الجدوى. ويتيح تنفيذ نهج "جناح الأمومة" جمع الأوثيكاي المودع حديثا في سن معروفة. وهذا يسهل التخطيط التجريبي، حيث يمكن للباحث توقع أوقات الفقس المحتملة لoothecae الفردية. ومن التعديلات الأخرى التي أدخلت على البروتوكولات الأولية والمنشرة احتضان الأوثيكاي والحوريات في غرف شبه مغلقة تحتوي أيضا على محلول كلوريد الصوديوم فائق التشبع. وجود الحل يحافظ على رطوبة نسبية تبلغ حوالي 75٪30. يتم احتضان Oothecae بشكل روتيني عند 30 درجة مئوية ، والتي ثبت أنها تقلل من عدد الأيام المطلوبة للحضانة مع زيادة صلاحية الأجنة وعدد الحوريات المنتجة لكل ootheca31. بعد الفقس، يتم استزراع الحوريات الغنوتوبيوتية بشكل روتيني على سطح المقعد في درجة حرارة غرفة المختبر والظروف المحيطة، على الرغم من أن الغرف التي تسيطر عليها الرطوبة تستخدم مرة أخرى للتجارب الحرجة. بعد إنشاء هذه التغييرات لجمع ootheca واحتضانها ، زادت معدلات الفتحات إلى حوالي 41٪ (ن = 51) ، وليس بما في ذلك إزالة oothecae بسبب التلوث. قد يتضمن الطريق المحتمل لزيادة تحسين معدلات الفتحة تمديد الوقت بين جمع ootheca والتعقيم. قد لا يكون البشرة من حالة البيض المدبوغة تماما على الإصدار الأولي32، وبالتالي قد تكون نفاذية إلى الحلول المستخدمة أثناء التعقيم في غضون 24 ساعة من إسقاطها.
تم تكييف بروتوكول التعقيم باستخدام حمض البيراسيتيك 0.1٪ من الدميةوآخرون. وقد وثقت دراسات أخرى تقنيات بديلة لتعقيم oothecae23،26. وتستند معدلات التلوث على طريقة غير تدميرية لاحتضان oothecae على ميل BHI. هذا النهج مفيد للغاية لأنه يسمح بالتعرف السريع على oothecae الملوث وإزالتها. معظم البروتوكولات السابقة اختبار للكائنات القابلة للترسيح عن طريق طلاء البراز أو الحورية متجانسة على وسائل الإعلام البكتريولوجية والتحقق من النمو22،23،25،27،28،33. في حالة واحدة على الأقل، لم يتم وصف طريقة اختبار الحالة الغنوتوبيوتية بشكل كامل26. باستثناء كلايتون الذي أضاف لوح صغير من العقم اختبار المتوسطة لتربية زجاجات24، الأساليب السابقة22،23 يضم الحشرات الغنوتوبيوتك على وسائل الإعلام البكتريولوجية فقط لفترات قصيرة من الزمن لتقييم بروتوكول التعقيم في البداية.
استمرار إسكان الحوريات الناتجة على المتوسط BHI كإجراء مدمج لمراقبة الجودة يسمح بمراقبة حالتها الغنوتوبيوتية في الوقت شبه الحقيقي - وهي تقنية لم تشاهد في معظم الطرق السابقة22،23. وهذا مفيد بشكل خاص للتجارب طويلة الأجل التي تتطلب الحوريات الغنوتوبيوتية للوصول إليها. إذا كانت أرضية BHI تحت الحوريات تبدو ملوثة بالنمو البكتيري أو الفطري ، فيجب التخلص من القارورة. يحدث هذا النوع من التلوث عادة عند الكشف عن القوارير إلى حوريات الماء ، ولكنه قد ينشأ أيضا من البراز في حالة oothecae أو الطعام المعقم بشكل غير كاف. استخدام غطاء محرك السيارة تدفق صفح عند سقي يحسن معدل التلوث الناجم عن الكشف عن القوارير.
وبما أن الكائنات الحية الملوثة قد تنمو بشكل هوائي على متوسط BHI ، فإن هناك حاجة إلى طريقة إضافية مستقلة عن الثقافة لاختبار العقم. أحد النهج المحتملة هو المجهر27، ولكن هذا النهج يمكن أن يكون كثيف العمالة. تستخدم بروتوكولات أخرى تقنيات قائمة على التسلسل للكشف عن الكائنات الحية التي قد تفلت من الثقافة14و23و27و28. ومع ذلك ، فإن مثل هذه النهج غالبا ما تكون مكلفة ويصعب تفسيرها ، حيث يمكن بسهولة أن تتأثر نتائج نهج التسلسل عالي الإنتاجية بالتلوث المنخفض المستوى للكواشف34 والباركود الذي يقفز35. بدلا من ذلك، تم تطوير نهج جديد يستخدم تضخيم PCR من الجين rRNA 16S في تركيبة مع تقييد تعدد الأشكال طول جزء لتصور كل من الإندوسيمبيونت وأي symbionts الأمعاء الملوثة. تتضمن هذه التقنية مكافحة PCR داخلية ، حيث تم تسلسل جين Blattabacterium's 16S ، ويجب أن يكون نمط النطاقات موجودا في كل من الحشرات الغنوتوبيوتية وغير النجمية. كما يمكن التنبؤ نمط تقييد endosymbiont من تسلسل الجينوم36، ليست هناك حاجة لتسلسل amplicons أو شظايا تقييد ، ما لم يكن من المرغوب تحديد أي ملوث. وتدعو النسخة الحالية من هذا البروتوكول إلى التضحية بالحورية من أجل PCR/RFLP، ولكن يمكن أيضا استخدام هذه التقنية على البراز كإجراء غير تدميري. ومع ذلك ، فإنه لن يتضمن التحكم المدمج ، حيث لا ينبغي أن يحتوي البراز على الكثير من Blattabacterium.
عنصر إضافي قابل للتعديل بسهولة ولكن حاسمة من تربية الحيوانات الغنوتوبيوتية هو النظام الغذائي. في حين أن BHI agar يمكن أن يكون بمثابة مصدر غذائي مؤقت للحشرات ، فقد وجد أنه يؤدي إلى عجز كبير في النمو بين الحوريات عند استخدامها كمصدر غذائي وحيد لفترات طويلة. في حين تم تجربة الوجبات الغذائية المتنوعة ، يوصى بتناول طعام الفئران القابل للرقم التلقائي كحمية روتينية للحفاظ على الحشرات الغنوتوبيوتك. وكثيرا ما كان من الصعب جعل الوجبات الغذائية غير المعدة خصيصا للتعقيم معقمة تماما، ووجد أن العديد من الوجبات الغذائية الحيوانية المختبرية العقيمة أو القابلة للاغتباد تظهر نموا فطريا سريعا في ظل ظروف غير استرile. هذا الميل إلى التحلل في ظل ظروف غير نجمية جعلها غير مناسبة للاستخدام في التجارب التي تقارن مباشرة الحشرات الغنوتوبيوتية وغير الكائنات الحية. النظام الغذائي الموصى به يسمح باستخدام نظام غذائي ثابت بين الحوريات الغنوتوبيوتية والحوريات القياسية ، مما يسهل مقارنة الخصائص - مثل معدلات النمو - بين المجموعتين.
كما لاحظ آخرون27، تنمو الحوريات الغنوتوبيوتية ببطء أكثر من نظيراتها غير النجمية. مقارنة بين أطوال الجسم من الكائنات الحية الغنوبية (ن = 105) والحوريات غيرsterile (ن = 50) تغذية نفسه، نظام غذائي القوارض autoclaved وأبقى في درجة حرارة الغرفة يكشف أن الحوريات غيرsterile تنمو في المتوسط 0.059 ملم / يوم، في حين تنمو الحوريات الغنوتوبيوتك 0.028 ملم / يوم (ص < 0.0001) (الشكل 5). وقد ثبت وجود ميكروبيوتا الأمعاء في P. أمريكانا لتغيير معدل الأيض الحشرات37, ويعتقد أن المجتمعات الأمعاء بشكل عام تؤثر على امتصاص المواد الغذائية38,39. تدعم هذه الأسباب الاختلافات الملحوظة في معدل نمو الحوريات الغنوتوبيوتية وغير النجمية.
وهناك قيود محتملة على هذه التقنية هو أن الحوريات الغنوتوبيوتية قد لا تصل إلى مرحلة النضج الجنسي ، حيث أن أقدم الأفواج العقيمة عمرها أكثر من 10 أشهر ووصلت فقط إلى النجم السابع (من أصل 10 ؛ 11 يجري سن البلوغ) كما يقترب طول الجسم40. هذه الأفواج الأقدم ليست على النظام الغذائي الفئران autoclaved ولكن بدلا من ذلك أكل تشاو الفئران المشععة، وهو النظام الغذائي الذي يحتوي على الكثير من الرطوبة لإطعام الأفواج غيرsterile دون نمو العفن المفرط. تم العثور على حوريات غير نجمية على نظام غذائي غير معقم لطعام ال تصل إلى مرحلة البلوغ بعد 9-10 أشهر في ظل ظروف مختبرية (درجة حرارة الغرفة والرطوبة). أفواج من الحوريات الغنوتوبيوتية وغير النجمية على طعام الفئران المشتركة والمكلافة تلقائيا هي حاليا أقل من 7 أشهر من العمر ، ويقدر أن الحشرات غير النجمية هي النجم السابع (المتوسط: 16.7 مم) في حين تقدر الحشرات العقيمة لتكون النجم الخامس (المتوسط: 11.2 ملم). ونتيجة لذلك ، لا يمكننا ، حتى الآن ، التحقق مما إذا كانت الصراصير الغنوتوبيوتك لدينا يمكن أن تتكاثر بنجاح. ومع ذلك ، بالنظر إلى السهولة التي يمكن بها إنشاء أفواج غنوتوبيوتك جديدة باستخدام هذا النهج ، فإن هذه الطريقة تظهر وعدا كبيرا حتى في غياب التكاثر المؤكد للحشرات الغنوتوبيوتية.
في الختام، يوفر هذا البروتوكول أداة متعددة الاستخدامات تسمح للباحثين في الميكروبيوم بتشغيل "منشأة" غنوتوبيوتك منخفضة التكلفة خاصة بهم باستخدام مواد مختبرية شائعة. يمكن استخدام هذا النهج لتوليد الصراصير الغنوتوبيوتية للتجارب التي تدرس دور الكائنات الحية المجهرية في تشكيل سلوك المضيف والمناعة والتنمية والاستجابات الإجهاد21،26،27. قد يتم تلقيح هذه الحشرات الغنوتوبيوتية أيضا مع المجتمعات الاصطناعية أو الزينوبيوتية وتستخدم لاحقا كمواضيع لدراسات ميكروبيوم الأمعاء23،28. وعلاوة على ذلك، فإن عناصر هذا النهج، بما في ذلك استخدام غرف الحضانة المبطنة بالوسائط الجرثومية كفحص تعقيم مدمج، قابلة للتعميم على نظم نموذجية أخرى ويمكن أن تسهل الصيانة الروتينية للحيوانات الغنوتوبيوتية في مرافق أصغر حجما.

وقد أثبتت الحيوانات الغنوتوبيوتية لتكون أدوات لا تقدر بثمنلدراساتالميكروبيوم 1،2،3. سمحت الحيوانات الخالية من الجراثيم والمحددة النباتات باختزال التفاعلات بين المضيف والميكروب ، بما في ذلك الاستجابات المناعية المضيفة ، ونضوج ظهارة الأمعاء ، والتمثيل الغذائي المضيف1و4و5و6و7. وقد ساعدت الحيوانات الغنوتوبيوتية تلقيح مع مجتمع مبسط أيضا في فهم أكثر اكتمالا للتفاعلات الميكروبات والميكروبات في المجتمع الأمعاء، وتحديدا في كشف عبر التغذية والعلاقات العدائية8،9،10،11. النظام النموذجي المفضل الحالي للدراسات في ميكروبيوم الأمعاء الثديية هو نموذج المورين. وفي حين أن هذا النظام كان حيويا في الاكتشافات المبينة أعلاه، فإن أحد أوجه القصور الرئيسية هو التكلفة التي ينطوي عليها الأمر. 10 - ومن الضروري توفير معدات متخصصة وفنيين مدربين تدريبا عاليا لإنشاء مرفق للكائنات الحية والاحتفاظ به. هذا، في تركيبة مع الرعاية الإضافية التي يجب أن تعطى لكل جانب من جوانب الحفاظ على الحيوانات الغنوتوبيوتك، يسبب الغنوتوبيوتك لتكلفة عشر إلى عشرين مرة أكثر من تربية نموذج حيواني قياسي12. بسبب ارتفاع التكاليف، قد يكون العديد من الباحثين غير قادرين على تحمل نموذج مورين الغنوتوبيوتك. بالإضافة إلى ذلك، في حين أن نماذج مورين قد يكون الخيار الأكثر قبولا على نطاق واسع للدراسات التي تتطلع إلى ترجمة إلى صحة الإنسان، لا تزال هناك العديد من الاختلافات الفسيولوجية والمورفولوجية بين أحشاء الإنسان والفأر13. من الواضح أنه لا يوجد نموذج فريد يكفي للإجابة على العدد المتزايد من الأسئلة المتعلقة بالجوانب العديدة لميكروبيوم الأمعاء.
نماذج الحشرات هي بديل أرخص بسبب انخفاض تكلفة الصيانة بالمقارنة مع أنواع الثدييات. وقد أدت البحوث الواسعة النطاق الخالية من الجراثيم والكائنات الحية في مجموعة متنوعة من أنواع الحشرات إلى تطوير نماذج متعددة شائعة الاستخدام. البعوض و Drosophila هي نماذج شائعة للعمل الخالي من الجراثيم نظرا لأهميتها للأمراض العالمية وقابلية المسالك الوراثية14،15. نظام نموذج آخر الناشئة هو أن نحلة العسل(Apis mellifera)، نظرا لاهميتها في التلقيح والبحوث الاجتماعية16. ومع ذلك ، فإن العديد من هذه الحشرات شائعة الاستخدام تفتقر إلى التعقيد التصنيفي الذي شوهد في مجتمعات الأمعاء الثديية17، مما يحد من قدرتها على نمذجة التفاعلات ذات الترتيب الأعلى. ليس فقط التنوع الكلي للميكروبات الموجودة في أمعاء الصراصير الأمريكية أكثر تشابها مع الثدييات ، ولكن العديد من الميكروبات الموجودة في القناة الهضمية للصرصور تنتمي إلى العائلات والفيرلا التي توجد عادة في ميكروبيوتا الأمعاء من الثدييات والبشر18. كما أن الحشرة الخلفية للصرصور مماثلة وظيفيا للأمعاء الغليظة للثدييات ، لأنها غرفة تخمير مكتظة بالبكتيريا للمساعدة في استخراج العناصر الغذائية19،20. وأخيرا ، فإن الطبيعة الشاملة للصراصير تسمح بتنوع أنظمة النظام الغذائي التي لن تكون ممكنة مع المتخصصين في النظام الغذائي.
الصراصير الأمريكية يمكن أن تكون نظاما نموذجيا مفيدا لفهم المجتمعات الميكروبية في الأمعاء في الكائنات الحية العليا ، ولكن وضع الصرصور كآفة يجعل هذا النظام مناسبا لمكافحة الآفات21. تساعد الاستفادة من المعرفة الأساسية لتأثير مجتمع الأمعاء على صحة الصرصور وعلم وظائف الأعضاء في تطوير تقنيات جديدة لإدارة الآفات.
الهدف من هذه الطريقة هو تحديد وصف شامل لإنشاء وصيانة الصراصير الأمريكية الغنوتوبيوتية(Periplaneta americana)، ولكن يمكن استخدام هذا البروتوكول لتوليد حوريات أي صرصور أوفيباروس. وهو يتضمن طريقة لجمع فعالة وغير الباضعة من oothecae ناضجة ، وتقنية غير تدميرية لرصد الحالة الغنوتوبيوتية للحشرات22،23،24. في حين أن الطرق السابقة لتحقيق وصيانة الصراصير الغنوتوبيوتك تصف جمع ootheca23،24،25،26،27، يتم تفسير نضج ootheca إما من حيث الإشارات الخاصة بالأنواع (في Blattella germanica22،24،25)، أو لم يتم وصفها صراحة27،28، مما يجعل التنفيذ صعبا على أولئك غير المألوفين مع النظام. منذ الطريقة الموصوفة هنا يستخدم oothecae انخفض بشكل طبيعي، خطأ إزالة البيض قبل الأوان غائبة. يحتوي هذا البروتوكول على أساليب تعتمد على الثقافة ومستقلة عن الثقافة لمراقبة الجودة ، ولا تتطلب الطريقة المعتمدة على الثقافة التضحية بالحشرات. وأخيرا ، تجمع هذه الطريقة معلومات من دراسات صرصور غنوتبيوتك متعددة لإنشاء بروتوكول شامل واحد مع جميع المعلومات اللازمة لتحقيق الصراصير الغنوتوبيوتية والحفاظ عليها.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2X master mix</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>M0482</td>
			<td>OneTaq MasterMix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclavable rat chow</td>
			<td>Zeigler</td>
			<td>NIH-31 Modified Auto</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacterial DNA extraction kit</td>
			<td>Omega Bio-Tek</td>
			<td>D-3350</td>
			<td>E.Z.N.A. Bacterial DNA kit; includes lysozyme, glass beads, proteinase K, buffers (proteinase K, binding, wash, elution), DNA columns, 2-mL collection tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>binding buffer</td>
			<td>Omega Bio-Tek</td>
			<td>PD099</td>
			<td>included in Omega Biotek&#39;s bacterial DNA extraction kit (&#34;HBC&#34; buffer)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>brain-heart infusion (BHI) broth</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>B11000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Delicate task wipes</td>
			<td>KimWipe</td>
			<td>JS-KCC-34155-PK</td>
			<td>KimWipes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA purification kit</td>
			<td>Omega Bio-Tek</td>
			<td>D6492</td>
			<td>E.Z.N.A. Cycle Pure kit; D6493 may also be used; includes buffers (purifying ,wash, elution)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>elution buffer</td>
			<td>Omega Bio-Tek</td>
			<td>PDR048</td>
			<td>included in Omega Biotek&#39;s bacterial DNA extraction kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass beads</td>
			<td>Omega Bio-Tek</td>
			<td>n/a</td>
			<td>included in Omega Biotek&#39;s bacterial DNA extraction kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybridization oven</td>
			<td>UVP</td>
			<td>95-0330-01</td>
			<td>we use a hybridization oven for preheating elution buffer, but a water bath could probably also be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar flow biological safety cabinet</td>
			<td>NuAire, Inc.</td>
			<td>NU-425-400</td>
			<td>Protocol refers to this as &#34;laminar flow hood&#34; for brevity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lysozyme</td>
			<td>Omega Bio-Tek</td>
			<td>n/a</td>
			<td>included in Omega Biotek&#39;s bacterial DNA extraction kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>peracetic acid stock solution (32%)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>269336</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petroleum jelly</td>
			<td>Vaseline</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>proteinase K buffer</td>
			<td>Omega Bio-Tek</td>
			<td>PD061</td>
			<td>included in Omega Biotek&#39;s bacterial DNA extraction kit (&#34;TL buffer&#34;)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>purifying buffer</td>
			<td>Omega Bio-Tek</td>
			<td>PDR042</td>
			<td>included in Omega Biotek&#39;s CyclePure kit (&#34;CP&#34; buffer)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RsaI</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R0167</td>
			<td>Includes CutSmart (digestion) buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary container</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td>a plastic container with a lid (such as a Kritter Keeper) works well for this (25cm long x 15cm wide x 22cm high); it should be large enough to fit BHI slants and test tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>spectrophotometer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>ND-2000</td>
			<td>Catalog info is for NanoDrop2000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>thermal shaker</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>EP5386000028</td>
			<td>Thermomixer R</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-EDTA</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1338-1</td>
			<td>10 nm Tris, 1 mM EDTA, pH 8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>wash buffer</td>
			<td>Omega Bio-Tek</td>
			<td>PDR044</td>
			<td>included in Omega Biotek&#39;s bacterial DNA extraction kit (&#34;DNA wash&#34; buffer)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Woodchip bedding</td>
			<td>P.J. Murphy Forest Products</td>
			<td>Sani-Chips</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

establishment and maintenance of gnotobiotic american cockroaches (periplaneta americana)

الحيوانات الغنوتوبيوتية هي أداة قوية لدراسة الضوابط على بنية الميكروبيوم ووظيفته. هنا هو بروتوكول لإنشاء وصيانة الصراصير الأمريكية الغنوتوبيوتك(Periplaneta أمريكانا). ويشمل هذا النهج عمليات فحص العقم المدمجة للتحقق من الجودة المستمرة. تعرف الحشرات الغنوتوبيوتية هنا بأنها صراصير لا تزال تحتوي على إندوسيمبيونت المنقول رأسيا(Blattabacterium)ولكنها تفتقر إلى الميكروبات الأخرى التي تتواجد عادة على سطحها وفي الجهاز الهضمي. لهذا البروتوكول، تتم إزالة حالات البيض (oothecae) من مستعمرة الأسهم (غيرsterile) وتعقيم السطح. وبمجرد جمعها وتعقيمها، يتم احتضان الأوثيكاي عند 30 درجة مئوية لمدة 4-6 أسابيع تقريبا على أجار ضخ الدماغ والقلب (BHI) حتى يفقس أو تتم إزالته بسبب التلوث. يتم نقل الحوريات المفقسة إلى قارورة Erlenmeyer تحتوي على أرضية BHI ومياه معقمة وطعام فئران معقم. لضمان أن الحوريات ليست الميكروبات السكنية التي لا تستطيع أن تنمو على BHI في ظروف معينة، يستخدم تدبير إضافي لمراقبة الجودة تقييد تعدد الأشكال طول جزء (RFLP) لاختبار الميكروبات غير التكافلية. يمكن تلقيح الحوريات الغنوتوبيوتية المتولدة باستخدام هذا النهج مع المجتمعات الميكروبية البسيطة أو المعقدة واستخدامها كأداة في دراسات ميكروبيوم الأمعاء.

يتم إعداد خزانات المخزون كما هو موضح في الشكل 1. يتم التعرف على الإناث "الحوامل" من قبل ootheca تعلق على البطن الخلفي، كما هو في الصورة في الشكل 2. حضانة oothecae على أجار BHI يسمح لمراقبة الجودة الغنوتوبيوتية بطريقة غير تدميرية. في بعض الحالات، والتعقيم غير ناجحة، ويظهر النمو حول oothecae كما هو الحال في الشكل 3B. وينبغي إزالة هذه oothecae والتخلص منها. في أيدينا، لوحظ متوسط معدل فشل 10٪ للتعقيم (ن = 51). يفقس oothecae في المتوسط 34 يوما بعد التعقيم دون نمو على المتوسط ، كما رأينا في الشكل 3A. لقد لاحظنا معدلات فقس نموذجية من 41٪ (ن = 46) لتعقيم، غير ملوثة oothecae، بمتوسط 11 حورية لكل ootheca. يتم نقل الحوريات أكبر إلى قوارير BHI مغطاة احباط، كما هو الحال في الشكل 4. احباط يمنع التلوث، والحوريات لديها مساحة للنمو. RFLP من rDNA 16S من حورية متجانسة يستخدم لتأكيد الحالة الغنوتوبيوتية. وقد لوحظ الحوريات الغنوتوبيوتية تنمو بمعدل أبطأ من نظيراتها غير العقيمة، كما هو ممثل الشكل 5. يعرض الشكل 6 نتائج الحشرات الغنوتوبيوتية الناجحة وكذلك الحوريات القياسية (غير النجمية).
وفي حين أن هذا الاختبار لم يحدد التلوث بعد في غياب نتيجة إيجابية للثقافة، فقد تم تنفيذ هذه الخطوة بشكل روتيني خلال التجارب الحرجة لاستبعاد وجود ميكروبات حساسة للأوكسجين أو سريعة الثبات. لوحظ تباطؤ النمو في الصراصير الغنوتوبيوتك بالمقارنة مع الحشرات القياسية / غير النجمية.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61316/61316fig01.jpg"> الشكل 1: إعداد ثقافة مخزون الصراصير. ويمكن رؤية أنابيب من الورق المقوى مكدسة في الطرف البعيد من الخزان. الطعام والماء على حد سواء بالقرب من الجزء الأمامي من الخزان. تمت إزالة غطاء من القماش القطني وشريط مرن للرؤية. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61316/61316fig01large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61316/61316fig02.jpg"> الشكل 2: صرصور أمريكي "حامل". يشير السهم إلى ootheca. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61316/61316fig02large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61316/61316fig3v2.jpg"> الشكل 3: صور الحوريات الغنوتوبيوتية بنجاح فقست وتعقيمها دون جدوى oothecae على الميول BHI. تم تعقيم Oothecae واحتضانها كما هو موضح في هذا البروتوكول. (أ)عدم وجود نمو ميكروبي على الميل BHI يشير إلى أن الحشرات خالية من الكائنات الحية القابلة للزرع. (ب)Oothecae على slants التي تؤدي إلى تشكيل مستعمرة ينبغي التخلص منها كما الملوثة. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61316/61316fig03large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61316/61316fig04.jpg"> الشكل 4: جهاز تربية غنوتوبوتيك. يتم الاحتفاظ بالحشرات في قوارير معقمة مغطاة بغطاء احباط لمنع التلوث. يتم تعقيم الحاوية الثانوية (الغطاء الأخضر) مع تبييض 2٪ يليه الإيثانول بنسبة 70٪. لا يتم تقييد تدفق الهواء في الحاوية الثانوية. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61316/61316fig04large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61316/61316fig5v2.jpg"> الشكل 5: بيانات معدل النمو التمثيلي التي تقارن أطوال الجسم من الحوريات الغنوتوبيوتية وغير النجمية. تم تغذية كلتا المجموعتين من الحشرات بنظام غذائي القوارض المكواة تلقائيا. يتم الاحتفاظ الحشرات الغنوتوبيوتية (هنا: ن = 105) على BHI كما هو موضح. تعيش الحشرات غير النجمية (هنا: n = 50) في قوارير مع فراش خشبي معبف تلقائيا مع أطباق صغيرة للمياه. تنمو الحوريات غير النجمية بمعدل متوسط قدره 0.059 مم في اليوم، في حين تنمو الحوريات الغنوتوبيوتية بمعدل 0.028 مم/يوم (p < 0.0001). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61316/61316fig5v2large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61316/61316fig05.jpg"> الشكل 6: صورة هلامية تمثيلية لنتائج RFLP لمراقبة الجودة. تم هضم أمبليكونات الجينات كاملة 16S مع RsaI. تم استخراج الحمض النووي لPCR من الحوريات المتجانسة في برنامج تلفزيوني 1x. تتوافق ممرات "G nymph" مع الحوريات الغنوتوبيوتية ، في حين تتوافق ممرات "conv nymph" مع نظيراتها التقليدية غير النجمية. استنادا إلى هضم تقييد الظاهري، و endosymbiont (Blattabacterium) ومن المتوقع أن يكون العصابات في أحجام 402 نقطة أساس، 206 نقطة أساس، و 163 نقطة أساس، مع مسحة من العصابات بين 163 نقطة أساس و 148 نقطة أساس. يجب أن تظهر الحشرة الغنوتوبيوتية نمط ربط Blattabacterium فقط. ومن المتوقع أن يكون المجتمع البكتيري المختلط مسحة من العصابات مع أحجام مختلفة، وصفت هنا "شظايا البكتيرية الأخرى 16S". <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61316/61316fig05large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Establishment and Maintenance of Gnotobiotic American Cockroaches Periplaneta americana at JoVE.com

Establishment and Maintenance of Gnotobiotic American Cockroaches Periplaneta americana

يستخدم هذا البروتوكول في إنشاء وصيانة الصراصير الأمريكية الغنوتوبيوتية(Periplaneta americana)عن طريق تعقيم حالات البيض (oothecae) قبل الفقس. تحتوي هذه الحشرات الغنوبية على بطانات البلاتاباكتيريا المنقولة رأسيا ولكن لديها أحشاء محورية.

إنشاء وصيانة الصراصير الأمريكية الغنوتوبيوتية (Periplaneta americana)

Gnotobiotic animals are a powerful tool for the study of controls on microbiome structure and function. Presented here is a protocol for the establishment ...

يسهل بروتوكول توليد الصراصير الغنوتوبيوتك اختبار تأثير إزالة واستبدال مجتمع الميكروبات في الأمعاء الأصلية على صحة المضيف وتجميع الميكروبيوم. تستخدم هذه التقنية أساليب من مصادر متعددة لتشكيل سير عمل متماسك ومبسط لتوليد الصراصير الغنوتوبيوتية دون استخدام معدات مختبر متخصصة باهظة الثمن. وبالنظر إلى الأجزاء المتحركة المختلفة العديدة من هذا البروتوكول الغنوتوبيوتك، يساعد التصور الباحثين على إنشاء مرافقهم الغنوتوبيوتية الصغيرة والمنخفضة التكلفة والكبيرة على مقاعد البدلاء.لتسهيل جمع العدد المناسب من الإناث تحمل oothecae للتجارب المخطط لها، واستخدام ملقط لنقل أنابيب من الورق المقوى التي تحتوي على الإناث gravid في خزان الأوراق المالية. إذا كان أنبوب من الورق المقوى يحتوي على حشرات متعددة بالإضافة إلى الأنثى المرقة ، هز محتويات الأنبوب في وعاء بلاستيكي إضافي محاط بهلام البترول وشجع الحشرة المستهدفة على الصعود مرة أخرى إلى أنبوب الورق المقوى وحده. عند الجمع، نقل كل أنثى gravid إلى جناح الأمومة.مرة واحدة وقد انخفض الإناث oothecae بهم، والعودة الإناث إلى خزان الأوراق المالية واستخدام ملقط لاسترداد oothecae من القمامة. لتنظيف oothecae، ضع ما يصل إلى خمس حالات بيض في أنبوب طرد مركزي من خمسة ملليلتر يحتوي على ثلاثة ملليلترات من كبريتات دودسيل الصوديوم ودوتكس الأوثيكاي لمدة 10 ثوان. بعد غسل الثانية كما أظهرت للتو، واستخدام مسح مهمة حساسة لفرك بلطف سطح كل ootheca لإزالة أي حطام ووضع ootheca تنظيفها في قارب الوزن.قبل التعقيم، املأ أنبوبي طرد مركزي 1.5 ملليلتر لكل ootheca بميليلتر واحد من الماء العقيم لكل أنبوب. أضف أيضا 10 ميكرولترات من محلول مخزون حمض البيرسيت 32٪ إلى 3.2 ملليلتر من الماء المقطر المزدوج في أنبوب طرد مركزي من خمسة ملليلتر في غطاء الدخان. كاب وعكس عدة مرات لخلط ووضع ما يصل إلى خمسة تنظيفها oothecae في محلول حمض البيرسيت الطازجة 0.1٪ لمدة خمس دقائق، عكس الأنبوب عدة مرات كل 60 ثانية.حمض البيرسيت هو مؤاكس قوي العين والجلد والمهيجة التنفسية، وهو قابل للاشتعال والتآكل. ارتد دائما معدات الوقاية الشخصية المناسبة أثناء التعامل مع النفايات والتخلص منها بشكل مناسب. في نهاية الحضانة ، استخدم ملقط معقم وغطاء تدفق صفح لنقل كل ootheca إلى أنبوب الطرد المركزي الخاص به من ماء الشطف العقيم.عكس عدة مرات لخلط قبل نقل oothecae إلى المجموعة الثانية من أنابيب من الماء شطف. بعد الشطف الثاني ، استخدم ملقط معقم لنقل oothecae إلى lants BHI الفردية. ضع الميول في حاوية ثانوية معقمة ونقل الحاوية إلى حاضنة رطبة 30 درجة مئوية لمدة أربعة إلى خمسة أسابيع حتى تفقس.تحقق من الميول بانتظام مرة إلى مرتين في الأسبوع للنمو الفطري أو البكتيري حتى الأسبوع الرابع ، وعند هذه النقطة يجب فحص الميول يوميا. عندما تبدأ الحوريات في الفقس ، استخدم ملقط معقم وغطاء تدفق صفيحة لنقل بيليه من طعام الفئران المعقم إلى قارورة BHI معدة. وكفحص للعقم، ضع القارورة في الحاوية الثانوية في حاضنة 30 درجة مئوية لمدة 24 ساعة لتأكيد عدم وجود نمو ملوث.إذا ظلت القارورة معقمة، هز الحوريات من الميل، والسماح لهم تقع في قارورة في غطاء محرك السيارة تدفق صفح. ثم المياه الحوريات مع 300 ميكرولتر من المياه العقيمة مرة واحدة في الأسبوع في غطاء محرك السيارة تدفق صفح. عندما يبدأ البراز حورية لتغطية الطابق المتوسط، ونقل الحوريات إلى قارورة BHI جديدة تحتوي على تشاو الفئران المعقمة وأضاف 24 ساعة مقدما، كما هو موضح.يمكن التعرف على الإناث الحوامل عن طريق ootheca تعلق على البطن الخلفي. يفقس oothecae في المتوسط 34 يوما بعد التعقيم. في حالات التعقيم غير الناجحة ، يمكن أن يظهر النمو حول oothecae أثناء الحضانة ، مما يعرض الحالة الغنوتوبيوتية للفقس للخطر.ثم يمكن تتبع معدل نمو الحوريات عن طريق قياس طول جسم الحشرات. تقييد طول جزء تعدد الأشكال من الحمض النووي الريبوسومي 16S من حورية متجانسة يمكن استخدامها لتأكيد الحالة الغنوتوبيوتية. يمكن تلقيح الصراصير الغنوتوبيوتية بالمجتمعات الميكروبية الاصطناعية أو الزنوبوتية.في حين أن سير العمل هذا هو جديد ، فقد ولدت الدراسات السابقة باستخدام الصراصير الغنوبيوتية نظرة ثاقبة على تجميع ميكروبيوم الأمعاء والأدوار الميكروبية في تشكيل السلوك الاجتماعي ، وصحة الأمعاء ، ومناعة مضيفيهم الحشرات.

Research

JoVE Journal

Biology

Establishment and Maintenance of Gnotobiotic American Cockroaches (Periplaneta americana)

Blood Collection from the American Horseshoe Crab, Limulus Polyphemus

كوكتيل من الدم والسرطان حدوة الحصان الأميركي ، الليمول Polyphemus

The horseshoe crab has the best-characterized immune system of any long-lived invertebrate.  The study of immunity in horseshoe crabs has been facilitated ...

Culture and Maintenance of Human Embryonic Stem Cells  

الثقافة والمحافظة على الخلايا الجذعية الجنينية البشرية

Human embryonic stem (hES) cells must be monitored and cared for in order to maintain healthy, undifferentiated cultures. At minimum, the cultures must be ...

Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells

العزلة والثقافة الأساسي في الخلايا الكبدية الجرذ

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology ...

Maintenance of a Drosophila melanogaster Population Cage

Maintenance of a Drosophila melanogaster Population Cage

صيانة<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; عدد السكان قفص

Large quantities of DNA, RNA, proteins and other cellular components are often required for biochemistry and molecular biology experiments. The short life ...

Establishment of an Extracellular Acidic pH Culture System

إنشاء درجة الحموضة خارج الخلية الحمضية منظومة الثقافة

Conditions of the tumor microenvironment, such as hypoxia or nutrient starvation, play critical roles in cancer progression and malignancy. However, the ...

Practical Use of RNA Interference: Oral Delivery of Double-stranded RNA in Liposome Carriers for Cockroaches

الاستخدام العملي لتدخل الجيش الملكي النيبالي: التسليم الشفوي من الحمض النووي الريبي مزدوج-الذين تقطعت بهم السبل في ناقلات الحويصلية للصراصير

RNA interference (RNAi) has been widely applied for uncovering the biological functions of numerous genes, and has been envisaged as a pest control tool ...

Establishment of a Clonal Culture of Unicellular Conjugating Algae

إنشاء ثقافة الاستنساخ من الطحالب التصريف أحادي الخلية

It is essential to establish clonal cultures of microalgae for use in studies of various topics, such as physiology, genetics, taxonomy, and microbiology. ...

Anaerobic Growth and Maintenance of Mammalian Cell Lines

نمو اللاهوائية وصيانة خطوط خلايا الثدييات

Most mucosal surfaces along with the midpoints in tumors and stem cell niches are geographic areas of the body that are anoxic. Previous studies show that ...

Isolation and Characterization of Adult Cardiac Fibroblasts and Myofibroblasts

عزل وتوصيف الخلايا الليفية القلبية للبالغين والخلايا الليفية الليفية

Cardiac fibrosis in response to injury is a physiological response to wound healing. Efforts have been made to study and target fibroblast subtypes that ...