Name: establishment and maintenance of gnotobiotic american cockroaches (periplaneta americana)
Uploaded: 2021-05-28T12:30:00
Duration: 6 min 9 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Establishment and Maintenance of Gnotobiotic American Cockroaches Periplaneta americana at JoVE.com

פרסום זה נתמך על ידי המכון הלאומי למדעי הרפואה הכללית של המכונים הלאומיים לבריאות תחת מספר הפרס R35GM133789. התוכן הוא באחריות המחברים בלבד ואינו מייצג בהכרח את התפיסה הרשמית של המכונים הלאומיים לבריאות. המחברים רוצים להכיר ג'וסי דייר למעקב אחר שיעורי עיקור, קצבי הצוהר, ושיעורי הצמיחה של מקקים gnotobiotic.

<ol>
	<li>Yi, P., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+germfree+murine+animal:+An+important+animal+model+for+research+on+the+relationship+between+gut+microbiota+and+the+host.">The germfree murine animal: An important animal model for research on the relationship between gut microbiota and the host.</a> Veterinary Microbiology. 157 (1-2), 1-7 (2012).</li><li>Nature Biotechnology. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laying+better+plans+for+mice.">Laying better plans for mice.</a> Nature Biotechnology. 31 (4), 263-263 (2013).</li><li>Nicklas, W., Keubler, L., Bleich, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintaining+and+Monitoring+the+Defined+Microbiota+Status+of+Gnotobiotic+Rodents.">Maintaining and Monitoring the Defined Microbiota Status of Gnotobiotic Rodents.</a> ILAR Journal. 56 (2), 241-249 (2015).</li><li>Faith, J. J., Ahern, P. P., Ridaura, V. K., Cheng, J., Gordon, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+Gut+Microbe-Host+Phenotype+Relationships+Using+Combinatorial+Communities+in+Gnotobiotic+Mice.">Identifying Gut Microbe-Host Phenotype Relationships Using Combinatorial Communities in Gnotobiotic Mice.</a> Science Translational Medicine. 6 (220), 11 (2014).</li><li>Moon, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vertically+transmitted+faecal+IgA+levels+determine+extra-chromosomal+phenotypic+variation.">Vertically transmitted faecal IgA levels determine extra-chromosomal phenotypic variation.</a> Nature. 521 (7550), 90-93 (2015).</li><li>Eun, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+Bacterial+Antigen-Specific+Colitis+by+a+Simplified+Human+Microbiota+Consortium+in+Gnotobiotic+Interleukin-10-/-+Mice.">Induction of Bacterial Antigen-Specific Colitis by a Simplified Human Microbiota Consortium in Gnotobiotic Interleukin-10-/- Mice.</a> Infection and Immunity. 82 (6), 2239-2246 (2014).</li><li>Cherbuy, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbiota+matures+colonic+epithelium+through+a+coordinated+induction+of+cell+cycle-related+proteins+in+gnotobiotic+rat.">Microbiota matures colonic epithelium through a coordinated induction of cell cycle-related proteins in gnotobiotic rat.</a> American Journal of Physiology: Gastrointestinal and Liver Physiology. 299 (2), 348-357 (2010).</li><li>Van Den Abbeele, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabinoxylans+and+inulin+differentially+modulate+the+mucosal+and+luminal+gut+microbiota+and+mucin-degradation+in+humanized+rats.">Arabinoxylans and inulin differentially modulate the mucosal and luminal gut microbiota and mucin-degradation in humanized rats.</a> Environmental Microbiology. 13 (10), 2667-2680 (2011).</li><li>Stecher, B., Berry, D., Loy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colonization+resistance+and+microbial+ecophysiology:+using+gnotobiotic+mouse+models+and+single-cell+technology+to+explore+the+intestinal+jungle.">Colonization resistance and microbial ecophysiology: using gnotobiotic mouse models and single-cell technology to explore the intestinal jungle.</a> FEMS Microbiology Reviews. 37 (5), 793-829 (2013).</li><li>Sugahara, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probiotic+Bifidobacterium+longum+alters+gut+luminal+metabolism+through+modification+of+the+gut+microbial+community.">Probiotic Bifidobacterium longum alters gut luminal metabolism through modification of the gut microbial community.</a> Scientific Reports. 5 (1), 13548 (2015).</li><li>Mart&#237;n, R., Berm&#250;dez-Humar&#225;n, L. G., Langella, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gnotobiotic+Rodents:+An+In+Vivo+Model+for+the+Study+of+Microbe-Microbe+Interactions.">Gnotobiotic Rodents: An In Vivo Model for the Study of Microbe-Microbe Interactions.</a> Frontiers in Microbiology. 7, 409 (2016).</li><li>Mallapaty, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gnotobiotics:+getting+a+grip+on+the+microbiome+boom.">Gnotobiotics: getting a grip on the microbiome boom.</a> Lab Animal. 46 (10), 373-377 (2017).</li><li>Nguyen, T. L. A., Vieira-Silva, S., Liston, A., Raes, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+informative+is+the+mouse+for+human+gut+microbiota+research.">How informative is the mouse for human gut microbiota research.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 8 (1), 1-16 (2015).</li><li>Correa, M. A., Matusovsky, B., Brackney, D. E., Steven, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+axenic+Aedes+aegypti+demonstrate+live+bacteria+are+not+required+for+mosquito+development.">Generation of axenic Aedes aegypti demonstrate live bacteria are not required for mosquito development.</a> Nature Communications. 9 (1), 4464 (2018).</li><li>Trinder, M., Daisley, B. A., Dube, J. S., Reid, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+melanogaster+as+a+High-Throughput+Model+for+Host&#8211;Microbiota+Interactions.">Drosophila melanogaster as a High-Throughput Model for Host&#8211;Microbiota Interactions.</a> Frontiers in Microbiology. 8, 751 (2017).</li><li>Zheng, H., Steele, M. I., Leonard, S. P., Motta, E. V. S., Moran, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Honey+bees+as+models+for+gut+microbiota+research.">Honey bees as models for gut microbiota research.</a> Lab animal. 47 (11), 317-325 (2018).</li><li>Engel, P., Moran, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+gut+microbiota+of+insects+-+diversity+in+structure+and+function.">The gut microbiota of insects - diversity in structure and function.</a> FeMS Microbiology Reviews. 37 (5), 699-735 (2013).</li><li>Tinker, K. A., Ottesen, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Core+Gut+Microbiome+of+the+American+Cockroach,+Periplaneta+americana,+Is+Stable+and+Resilient+to+Dietary+Shifts.">The Core Gut Microbiome of the American Cockroach, Periplaneta americana, Is Stable and Resilient to Dietary Shifts.</a> Applied and Environmental Microbiology. 82 (22), 6603-6610 (2016).</li><li>Zurek, L., Keddie, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+the+colon+and+colonic+bacterial+flora+to+metabolism+and+development+of+the+american+cockroach+Periplaneta+americana+L.">Contribution of the colon and colonic bacterial flora to metabolism and development of the american cockroach Periplaneta americana L.</a> Journal of Insect Physiology. 42 (8), 743-748 (1996).</li><li>Cruden, D. L., Markovetz, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+aspects+of+the+cockroach+hindgut.">Microbial aspects of the cockroach hindgut.</a> Archives of Microbiology. 138, 131-139 (1984).</li><li>Pietri, J. E., Tiffany, C., Liang, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+the+microbiota+affects+physiological+and+evolutionary+aspects+of+insecticide+resistance+in+the+German+cockroach,+an+important+urban+pest.">Disruption of the microbiota affects physiological and evolutionary aspects of insecticide resistance in the German cockroach, an important urban pest.</a> PLoS ONE. 13 (12), 0207985 (2018).</li><li>Benschoter, C., Wrenn, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germfree+techniques+for+establishment+and+maintenance+of+a+colony+of+aseptic+German+cockroaches.">Germfree techniques for establishment and maintenance of a colony of aseptic German cockroaches.</a> Annals of the Entomological Society of America. 65 (3), 641-644 (1972).</li><li>Tegtmeier, D., Thompson, C. L., Schauer, C., Brune, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen+Affects+Gut+Bacterial+Colonization+and+Metabolic+Activities+in+a+Gnotobiotic+Cockroach+Model.">Oxygen Affects Gut Bacterial Colonization and Metabolic Activities in a Gnotobiotic Cockroach Model.</a> Applied and Environmental Microbiology. 82 (4), 1080-1089 (2016).</li><li>Clayton, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simplified+method+for+the+culture+of+Blattella+germanica+under+aseptic+conditions.">A simplified method for the culture of Blattella germanica under aseptic conditions.</a> Nature. 184 (4693), 1166-1167 (1959).</li><li>Doll, J. P., Trexler, P. C., Reynolds, L. I., Bernard, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Use+of+Peracetic+Acid+to+Obtain+Germfree+Invertebrate+Eggs+for+Gnotobiotic+Studies.">The Use of Peracetic Acid to Obtain Germfree Invertebrate Eggs for Gnotobiotic Studies.</a> American Midland Naturalist. 69 (1), 231 (1963).</li><li>Wada-Katsumata, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gut+bacteria+mediate+aggregation+in+the+German+cockroach.">Gut bacteria mediate aggregation in the German cockroach.</a> Proceedings of the National Academy of Science. 112, 15678-15683 (2015).</li><li>Jahnes, B. C., Herrmann, M., Sabree, Z. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conspecific+coprophagy+stimulates+normal+development+in+a+germ-free+model+invertebrate.">Conspecific coprophagy stimulates normal development in a germ-free model invertebrate.</a> PeerJ. 7, 6914 (2019).</li><li>Mikaelyan, A., Thompson, C. L., Hofer, M. J., Brune, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deterministic+Assembly+of+Complex+Bacterial+Communities+in+Guts+of+Germ-Free+Cockroaches.">Deterministic Assembly of Complex Bacterial Communities in Guts of Germ-Free Cockroaches.</a> Applied Environmental Microbiology. 82 (4), 1256-1263 (2016).</li><li>Katoh, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Group-housed+females+promote+production+of+asexual+ootheca+in+American+cockroaches.">Group-housed females promote production of asexual ootheca in American cockroaches.</a> Zoological Letters. 3, 3 (2017).</li><li>Greenspan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Humidity+fixed+points+of+binary+saturated+aqueous+solutions.">Humidity fixed points of binary saturated aqueous solutions.</a> Journal of Research of the National Bureau of Standards. 81 (1), 89-96 (1976).</li><li>Bressan-Nascimento, S., Oliveira, D. M. P., Fox, E. G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermal+requirements+for+the+embryonic+development+of+Periplaneta+americana+(L.)+(Dictyoptera:+Blattidae)+with+potential+application+in+mass-rearing+of+egg+parasitoids.">Thermal requirements for the embryonic development of Periplaneta americana (L.) (Dictyoptera: Blattidae) with potential application in mass-rearing of egg parasitoids.</a> Biological Control. 47 (3), 268-272 (2008).</li><li>Nation, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Insect Physiology and Biochemistry, Second Edition. , (2008).</li><li>House, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nutritional+studies+with+Blattella+germanica+(L.)+reared+under+aseptic+conditions+I.+Equipment+and+technique.">Nutritional studies with Blattella germanica (L.) reared under aseptic conditions I. Equipment and technique.</a> The Canadian Entomologist. 81 (5), 94-100 (1949).</li><li>Stinson, L. F., Keelan, J. A., Payne, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+removal+of+contaminating+microbial+DNA+from+PCR+reagents:+impact+on+low-biomass+microbiome+analyses.">Identification and removal of contaminating microbial DNA from PCR reagents: impact on low-biomass microbiome analyses.</a> Letters in Applied Microbiology. 68 (1), 2-8 (2018).</li><li>Kircher, M., Sawyer, S., Meyer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double+indexing+overcomes+inaccuracies+in+multiplex+sequencing+on+the+Illumina+platform.">Double indexing overcomes inaccuracies in multiplex sequencing on the Illumina platform.</a> Nucleic Acids Research. 40, 3 (2011).</li><li>Sabree, Z. L., Kambhampati, S., Moran, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitrogen+recycling+and+nutritional+provisioning+by+Blattabacterium,+the+cockroach+endosymbiont.">Nitrogen recycling and nutritional provisioning by Blattabacterium, the cockroach endosymbiont.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of the America. 106 (46), 19521-19526 (2009).</li><li>Ayayee, P. A., Ondrejech, A., Keeney, G., Mu&#241;oz-Garcia, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+gut+microbiota+in+the+regulation+of+standard+metabolic+rate+in+female+Periplaneta+americana.">The role of gut microbiota in the regulation of standard metabolic rate in female Periplaneta americana.</a> PeerJ. 6, 4717 (2018).</li><li>Krajmalnik-Brown, R., Ilhan, Z. E., Kang, D. W., DiBaise, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+gut+microbes+on+nutrient+absorption+and+energy+regulation.">Effects of gut microbes on nutrient absorption and energy regulation.</a> Nutrition in clinical practice : official publication of the American Society for Parenteral and Enteral Nutrition. 27 (2), 201-214 (2012).</li><li>Rowland, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gut+microbiota+functions:+metabolism+of+nutrients+and+other+food+components.">Gut microbiota functions: metabolism of nutrients and other food components.</a> European Journal of Nutrition. 57 (1), 1-24 (2018).</li><li>Gier, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+rate+in+the+cockroach+Periplaneta+americana+(Linn).">Growth rate in the cockroach Periplaneta americana (Linn).</a> Annals of the Entomological Society of America. 40, 303-317 (1947).</li></ol>

המחברים אין ניגודי אינטרסים לחשוף.

שיטות אחרות המתארות דור של גנוביוטיות ג'וקים או לא תיארו אוסף oothecae או השתמשו אמות מידה ספציפיות למינים אחרים של ג'וקים כדי לציין מתי oothecae ניתן להסיר מן האם23,25,26. במקור, oothecae נאספו ממצעים woodchip במיכלי המלאי, וכתוצאה מכך שיעורי הצוהר נמוך מאוד (~ 10%) בהשוואה לאותקיה לא מעוקרת (47%) זה כנראה בשל העובדה כי oothecae unhatched לצבור לאורך זמן בכלוב המניות, ואין דרך לאמת את גיל ootheca או הכדאיות. יישום גישת "מחלקת היולדות" מאפשר איסוף של oothecae שהופקדו זה עתה בגיל ידוע. זה גם מקל על תכנון ניסיוני, כמו החוקר יכול לצפות זמני הבקיעה סביר עבור oothecae בודדים. שינוי נוסף מהפרוטוקולים הראשוניים והמפורסמות כולל דגירה של ביציות ונימפות בתאים אטומים למחצה המכילים גם פתרון נתרן כלורי רווי. נוכחות הפתרון שומרת על לחות יחסית של כ 75%30. Oothecae הם דגירה שגרתית ב 30 °C (60 °F), אשר הוכח למזער את מספר הימים הדרושים דגירה תוך מקסום הכדאיות של העוברים ומספר נימפות המיוצר לכל ootheca31. לאחר הבקיעה, נימפות gnotobiotic מתורבתים באופן שגרתי על הספסל בטמפרטורת חדר המעבדה ותנאי הסביבה, אם כי תאים מבוקרי לחות מנוצלים שוב לניסויים קריטיים. לאחר הקמת שינויים אלה לאוסף ootheca ודגרת, שיעורי הצוהר עלו לכ 41% (n = 51), לא כולל oothecae הוסר עקב זיהום. מסלול פוטנציאלי לאופטימיזציה נוספת של קצבי הפתח עשוי לכלול הארכת הזמן בין איסוף ootheca ועיקור. הקוטיקל של מקרה הביצה לא יכול להיות שזוף לחלוטין על שחרור ראשוני32, ולכן עשוי להיות חדיר לפתרונות המשמשים במהלך עיקור בתוך 24 שעות של ירידה.
פרוטוקול עיקור באמצעות 0.1% חומצה peracetic הותאם מ Doll et al.25. מחקרים אחרים תיעדו טכניקות חלופיות לעקר oothecae23,26. שיעורי הזיהום מבוססים על השיטה הלא הרסנית של דגירה של oothecae על שיפוע BHI. גישה זו היא יתרון מאוד כפי שהוא מאפשר זיהוי מהיר והסרה של oothecae מזוהמים. רוב הפרוטוקולים הקודמים בודקים אורגניזמים culturable על ידי ציפוי צואה או נימפה הומוגנית על מדיה בקטריולוגית ובדיקה לצמיחה22,23,25,27,28,33. במקרה אחד לפחות, השיטה לבדיקת מצב gnotobiotic לא תוארה במלואה26. מלבד קלייטון שהוסיף לוח קטן של סטריליות בדיקות בינוניות לגידול בקבוקים24, שיטותקודמות 22,23 שוכנו חרקים gnotobiotic על מדיה בקטריולוגית רק לפרקי זמן קצרים כדי להעריך בתחילה את פרוטוקול עיקור.
המשך הדיור של הנימפות המתקבלות במדיום BHI כאמצעי בקרת איכות מובנה מאפשר ניטור של מצבם הגנוביוטי בזמן אמת למחצה – טכניקה שלא נראתה ברוב השיטותהקודמות 22,23. זה שימושי במיוחד עבור ניסויים ארוכי טווח הדורשים נימפות gnotobiotic כדי לגשת. אם רצפת BHI תחת נימפות מופיע מזוהם עם צמיחה חיידקית או פטרייתית, הבקבוק צריך להיות מושלך. סוג זה של זיהום מתרחש בדרך כלל כאשר חושפים את הבקבוקים לנימפות מים, אבל זה עשוי גם לנבוע הצואה במקרה של oothecae מעוקר מספיק או מזון. השימוש במכסה המנוע של זרימה למינארית בעת השקיה משפר את קצב הזיהום הנגרם על ידי חשיפת בקבוקונים.
מכיוון שלא כל האורגניזמים המזהמים עשויים לגדול באופן אווירובידי במדיום BHI, נדרשת שיטה נוספת שאינה תלויה בתרבות של בדיקות סטריליות. גישה אפשרית אחת היא מיקרוסקופיה27, אבל גישה זו יכולה להיות עתירת עבודה. פרוטוקולים אחרים משתמשים בטכניקות מבוססות רצף כדי לזהות אורגניזמים שעלולים לברוח מתרבות14,23,27,28. עם זאת, גישות כאלה הן לעתים קרובות יקר וקשה לפרש, כמו התוצאות של גישות רצף תפוקה גבוהה יכול בקלות להיות מושפע זיהום ברמה נמוכה של ריאגנטים34 וברקוד מקפץ35. במקום זאת, פותחה גישה חדשה המשתמשת בהגברת PCR של גן 16S rRNA בשילוב עם פולימורפיזם באורך שבר הגבלה כדי לדמיין הן את האנדוסימביונט והן את כל סימביונטים המעיים המזהמים. טכניקה זו כוללת בקרת PCR פנימית, שכן הגן 16S של בלטבקטריוםכבר רצף, ואת דפוס הפסים שלה צריך להיות נוכח חרקים gnotobiotic ולא סטרילי. כמו דפוס ההגבלה של אנדוסימביונט ניתן לחזות מרצף הגנום שלה36, אין צורך לרצף את האמפליקונים או שברי ההגבלה, אלא אם כן זיהוי של כל מזהם רצוי. הגרסה הנוכחית של פרוטוקול זה קוראת להקרבת נימפה עבור PCR/RFLP, אך טכניקה זו יכולה לשמש גם על צואה כאמצעי לא הרסני. עם זאת, זה לא יכלול שליטה מובנית, כמו הצואה לא צריך להכיל הרבה Blattabacterium.
מרכיב נוסף שניתן לשינוי בקלות אך קריטי בגידול בעלי חיים גנוטוביוטיים הוא דיאטה. בעוד שאגר BHI יכול לשמש כמקור מזון זמני לחרקים, נמצא כי הוא גורם לגירעונות צמיחה משמעותיים בקרב נימפות כאשר הוא משמש כמקור המזון היחיד לתקופות ממושכות. בעוד דיאטות מגוונות כבר ניסו, אוכל עכברוש autoclavable מומלץ כת דיאטה שגרתית לשמירה על חרקים gnotobiotic. דיאטות שלא נוסחו במיוחד לעיקור היו לעתים קרובות קשות לעיבוד סטרילי לחלוטין, ות דיאטות רבות של בעלי חיים במעבדה סטרילית או אוטו-שירות נמצאו להפגין צמיחה פטרייתית מהירה בתנאים לא סטריליים. נטייה זו להשפיל בתנאים לא סטריליים הפך אותם לא מתאימים לשימוש בניסויים ישירות השוואת חרקים gnotobiotic ו nongnotobiotic. הדיאטה המומלצת מאפשרת שימוש בתזונה עקבית בין נימפות גנוטוביות לסטנדרטיות, ומאפשרת השוואה של מאפיינים – כגון שיעורי צמיחה – בין שתי הקבוצות.
כפי שאחרים הבחינו27, נימפות gnotobiotic לגדול לאט יותר מאשר עמיתיהם שאינם סטריליים. השוואה בין אורכי הגוף של gnotobiotic (n = 105) ונימפות לא סטריליות (n = 50) האכילו אותו, דיאטת מכרסמים autoclaved ונשמר בטמפרטורת החדר מגלה כי נימפות לא סטריליות לגדול בממוצע 0.059 מ"מ ליום, בעוד נימפות gnotobiotic לגדול 0.028 מ"מ ליום (p < 0.0001) (איור 5). נוכחות של microbiota במעיים P. americana הוכח לשנות את קצב חילוף החומרים של החרקים37, וקהילות המעיים בכלל נחשבים להשפיע על ספיגת התזונה38,39. סיבות אלה תומכות בהבדלים שנצפו בקצב הצמיחה של נימפות גנוטוביות ולא סטריליות.
מגבלה אפשרית לטכניקה זו היא כי נימפות gnotobiotic לא יכול להגיע לבגרות מינית, כמו קבוצות סטריליות העתיקה ביותר הם יותר מ 10 חודשים והגיעו רק כוכב השביעי (מתוך 10; 11 להיות בגרות) כפי משוער על ידי אורך הגוף40. אלה קבוצות הוותיקים אינם על דיאטה חולדה autoclaved אבל במקום לאכול אוכל עכברוש מוקרן, דיאטה המכילה יותר מדי לחות להאכיל קבוצות לא סטריליות ללא צמיחת עובש מוגזמת. נימפות לא סטריליות על דיאטה מזון לכלבים לא מעוקרים נמצאו להגיע לבגרות לאחר 9-10 חודשים בתנאי מעבדה (טמפרטורת החדר ולחות). קבוצות של נימפות gnotobiotic ולא סטרילי על משותף, autoclaved צ'או חולדה הם כיום פחות מ 7 חודשים, חרקים לא סטריליים מוערך להיות כוכב שביעי (ממוצע: 16.7 מ"מ) בעוד חרקים סטריליים מוערך להיות כוכב חמישי (ממוצע: 11.2 מ"מ). כתוצאה מכך, איננו יכולים, נכון לעכשיו, לאמת אם המקקים הגנטוביוטיים שלנו יכולים להתרבות בהצלחה. עם זאת, בהתחשב בקלות שבה ניתן להקים קבוצות gnotobiotic חדשות באמצעות גישה זו, שיטה זו מראה הבטחה גדולה גם בהיעדר רבייה מוכחת של חרקים gnotobiotic.
לסיכום, פרוטוקול זה מספק כלי רב-תכליתי המאפשר לחוקרי מיקרוביום להפעיל "מתקן" גנוטוביוטי משלהם בעלות נמוכה באמצעות חומרי מעבדה נפוצים. גישה זו עשויה לשמש ליצירת מקקים gnotobiotic לניסויים בוחנים את התפקיד של microbiota בעיצוב התנהגות המארח, חסינות, פיתוח, ותגובות מתח21,26,27. חרקים gnotobiotic אלה עשויים גם להיות מחוסנים עם קהילות סינתטיות או xenobiotic ולאחר מכן משמש כנושאים למחקרים מיקרוביום במעיים23,28. יתר על כן, אלמנטים של גישה זו, כולל שימוש בתאי דגירה מרופדים במדיה בקטריולוגית כבדיקת סטריליות מובנית, ניתנים להכללה למערכות מודל אחרות ויכולים להקל על תחזוקה שגרתית של בעלי חיים גנוטיוטיים במתקנים בקנה מידה קטן יותר.

בעלי חיים Gnotobiotic הוכיחו להיות כלים לא יסולא בפז עבור מחקרים מיקרוביום1,2,3. בעלי חיים נטולי נבטים ומוגדרים אפשרו הבהרת אינטראקציות בין מארח למיקרואורגניזמים, כולל תגובות אימונולוגיות מארחות, התבגרות אפיתל במעיים ומטבוליזם מארח1,4,5,6,7. בעלי חיים Gnotobiotic מחוסנים עם קהילה פשוטה סייעו גם בהבנה מלאה יותר של אינטראקציות microbe-microbe בקהילה במעיים, במיוחד בפענוח האכלה צולבת ויחסים עוינים8,9,10,11. מערכת המודלים המועדפת הנוכחית למחקרים במיקרוביום המעיים של היונקים היא מודל המורין. בעוד שמערכת זו הייתה חיונית בתגליות שתוארו לעיל, חסרון מרכזי הוא העלות הכרוכה בכך. ציוד מיוחד וטכנאים מיומנים נחוצים כדי להקים ולתחזק מתקן gnotobiotic. זה, בשילוב עם טיפול נוסף שיש לתת לכל היבט של תחזוקת בעלי חיים gnotobiotic, גורם החיה gnotobiotic לעלות פי עשרה עד עשרים יותר להתרבות מאשר מודל חיה סטנדרטי12. בשל עלויות גבוהות, חוקרים רבים עשויים להיות מסוגלים להרשות לעצמם מודל מורין gnotobiotic. בנוסף, בעוד מודלים מורין עשוי להיות הבחירה המקובלת ביותר עבור מחקרים המעוניינים לתרגם לבריאות האדם, ישנם עדיין הבדלים פיזיולוגיים ומורפולוגיים רבים בין המעיים האנושי והעכבר13. ברור שאין מודל יחיד מספיק כדי לענות על מספר הולך וגדל של שאלות לגבי ההיבטים הרבים של מיקרוביום המעיים.
דגמי חרקים הם חלופה זולה יותר בשל עלות התחזוקה הנמוכה שלהם בהשוואה למינים של יונקים. מחקר נרחב ללא חיידקים וגנוטוביוטיקה במגוון מיני חרקים הוביל להתפתחותם של מודלים נפוצים רבים. יתושים ו Drosophila הם מודלים נפוצים לעבודה ללא חיידקים בשל הרלוונטיות שלהם למחלות גלובליות ומתיחהגנטית 14,15. מערכת מודלים מתפתחת נוספת היא זו של דבורת הדבש (Apis mellifera), בהתחשב בחשיבותה במחקר האבקה וחברתיות16. עם זאת, רבים של חרקים נפוצים אלה חסרים את המורכבות הטקסונומית לראות בקהילות מעי יונקים17, הגבלת יכולתם מודל אינטראקציות סדר גבוה יותר. לא רק שהמגוון הכולל של המיקרואורגניזמים המצויים במעיים של ג'וקים אמריקאים דומה יותר ליונקים, אלא שרבים מהמיקרואורגניזמים הנמצאים במעי הג'וק שייכים למשפחות ופילה המצויים בדרך כלל במיקרוביוטה של יונקים ובני אדם18. ההיסחפות של הג'וק מקבילה גם מבחינה תפקודית למעי הגס של היונקים, שכן הוא תא תסיסה עמוס בחיידקים כדי לסייע בהפקת חומרים מזינים19,20. לבסוף, האופי הכל-יכול של המקקים מאפשר מגוון של משטרי דיאטה שלא יתאפשרו עם מומחים תזונתיים.
ג'וקים אמריקאים יכולים להיות מערכת מודל שימושית להבנת קהילות מיקרוביאליות במעיים באורגניזמים גבוהים יותר, אך מעמדו של המקק כמזיק גם הופך את המערכת לרלוונטית לבקרת מזיקים21. מינוף הידע הבסיסי בהשפעת קהילת המעיים על בריאות הג'וקים והפיזיולוגיה מסייע בפיתוח טכניקות חדשות לניהול מזיקים.
מטרת שיטה זו היא להתוות תיאור מקיף של הקמה ותחזוקה של מקקים אמריקאים גנוטוביוטיים (Periplaneta americana), אך פרוטוקול זה יכול לשמש ליצירת נימפות של כל ג'וק אוביפר. הוא כולל שיטה לאוסף יעיל ולא פולשני של ביציות בוגרות, וטכניקה לא הרסנית לניטור מצב הגנטוביוטיקה של החרקים22,23,24. בעוד ששיטות קודמות להשגת ותחזוקה של גנוטוביוטיות מתארות את אוסף אותקה23,24,25,26,27, בגרות אוותקה מתפרשת במונחים של רמזים ספציפיים למינים (בבלטלה גרמניקה22,24,25), או לא מתואר במפורש27,28, מה שהופך את היישום קשה עבור אלה שאינםמכירים את המערכת. מאז השיטה המתוארת כאן משתמשת באופן טבעי ירד oothecae, השגיאה של הסרת ביצים בטרם עת נעדר. פרוטוקול זה מכיל הן שיטות תלויות תרבות והן שיטות בלתי תלויות בתרבות של בקרת איכות, והשיטה התלויה בתרבות אינה דורשת הקרבת חרקים. לבסוף, שיטה זו מביאה יחד מידע ממחקרי ג'וקים gnotobiotic מרובים כדי ליצור אחד, פרוטוקול מקיף עם כל המידע הדרוש להשגת ושמירה על גנוטוביוטיקה מקקים.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2X master mix</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>M0482</td>
			<td>OneTaq MasterMix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclavable rat chow</td>
			<td>Zeigler</td>
			<td>NIH-31 Modified Auto</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacterial DNA extraction kit</td>
			<td>Omega Bio-Tek</td>
			<td>D-3350</td>
			<td>E.Z.N.A. Bacterial DNA kit; includes lysozyme, glass beads, proteinase K, buffers (proteinase K, binding, wash, elution), DNA columns, 2-mL collection tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>binding buffer</td>
			<td>Omega Bio-Tek</td>
			<td>PD099</td>
			<td>included in Omega Biotek&#39;s bacterial DNA extraction kit (&#34;HBC&#34; buffer)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>brain-heart infusion (BHI) broth</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>B11000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Delicate task wipes</td>
			<td>KimWipe</td>
			<td>JS-KCC-34155-PK</td>
			<td>KimWipes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA purification kit</td>
			<td>Omega Bio-Tek</td>
			<td>D6492</td>
			<td>E.Z.N.A. Cycle Pure kit; D6493 may also be used; includes buffers (purifying ,wash, elution)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>elution buffer</td>
			<td>Omega Bio-Tek</td>
			<td>PDR048</td>
			<td>included in Omega Biotek&#39;s bacterial DNA extraction kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass beads</td>
			<td>Omega Bio-Tek</td>
			<td>n/a</td>
			<td>included in Omega Biotek&#39;s bacterial DNA extraction kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybridization oven</td>
			<td>UVP</td>
			<td>95-0330-01</td>
			<td>we use a hybridization oven for preheating elution buffer, but a water bath could probably also be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar flow biological safety cabinet</td>
			<td>NuAire, Inc.</td>
			<td>NU-425-400</td>
			<td>Protocol refers to this as &#34;laminar flow hood&#34; for brevity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lysozyme</td>
			<td>Omega Bio-Tek</td>
			<td>n/a</td>
			<td>included in Omega Biotek&#39;s bacterial DNA extraction kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>peracetic acid stock solution (32%)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>269336</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petroleum jelly</td>
			<td>Vaseline</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>proteinase K buffer</td>
			<td>Omega Bio-Tek</td>
			<td>PD061</td>
			<td>included in Omega Biotek&#39;s bacterial DNA extraction kit (&#34;TL buffer&#34;)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>purifying buffer</td>
			<td>Omega Bio-Tek</td>
			<td>PDR042</td>
			<td>included in Omega Biotek&#39;s CyclePure kit (&#34;CP&#34; buffer)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RsaI</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R0167</td>
			<td>Includes CutSmart (digestion) buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary container</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td>a plastic container with a lid (such as a Kritter Keeper) works well for this (25cm long x 15cm wide x 22cm high); it should be large enough to fit BHI slants and test tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>spectrophotometer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>ND-2000</td>
			<td>Catalog info is for NanoDrop2000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>thermal shaker</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>EP5386000028</td>
			<td>Thermomixer R</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-EDTA</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1338-1</td>
			<td>10 nm Tris, 1 mM EDTA, pH 8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>wash buffer</td>
			<td>Omega Bio-Tek</td>
			<td>PDR044</td>
			<td>included in Omega Biotek&#39;s bacterial DNA extraction kit (&#34;DNA wash&#34; buffer)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Woodchip bedding</td>
			<td>P.J. Murphy Forest Products</td>
			<td>Sani-Chips</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

establishment and maintenance of gnotobiotic american cockroaches (periplaneta americana)

בעלי חיים Gnotobiotic הם כלי רב עוצמה לחקר פקדים על מבנה מיקרוביום ותפקוד. מוצג כאן פרוטוקול להקמה ותחזוקה של מקקים אמריקאים גנוטוביוטיים(Periplaneta americana). גישה זו כוללת בדיקות סטריליות מובנות לבקרת איכות שוטפת. חרקים Gnotobiotic מוגדרים כאן כמו מקקים שעדיין מכילים אנדוסימביונט המועבר אנכית שלהם (Blattabacterium) אבל חסרים חיידקים אחרים המתגוררים בדרך כלל על פני השטח שלהם במערכת העיכול שלהם. עבור פרוטוקול זה, מקרי ביצים (oothecae) מוסרים ממושבת מלאי (לא סטרילית) ומשטח מעוקר. לאחר שנאסף ועוקר, oothecae הם דגירה ב 30 °C (60 °F) במשך כ 4-6 שבועות על עירוי המוח הלב (BHI) אגר עד שהם בוקעים או מוסרים עקב זיהום. נימפות שבקעו מועברות לבקבוק ארלמאייר המכיל רצפת BHI, מים סטריליים ומזון עכברושים סטרילי. כדי להבטיח שהנימפות אינן חיידקים דיור שאינם מסוגלים לגדול על BHI בתנאים נתון, אמצעי בקרת איכות נוסף משתמש פולימורפיזם באורך שבר הגבלה (RFLP) כדי לבדוק חיידקים לאndosymbiotic. נימפות Gnotobiotic שנוצר באמצעות גישה זו ניתן לחסן עם קהילות מיקרוביאליות פשוטות או מורכבות ומשמש ככלי במחקרים מיקרוביום במעיים.

מיכלי מניות הוקמו כמתואר באיור 1. נקבות "בהריון" מזוהות על ידי הootheca המחוברות לבטן האחורית, כפי שמצולמו באיור 2. דגירה של oothecae על אגר BHI מאפשר בקרת איכות gnotobiotic בצורה לא הרסנית. במקרים מסוימים, הסטריליזציה אינה מצליחה, והצמיחה מופיעה סביב ה-oothecae כמו באיור 3B. oothecae אלה יש להסיר ולהשליך. בידינו נצפה שיעור כשל ממוצע של 10% לחיטוי (n = 51). oothecae בוקע בממוצע 34 ימים לאחר עיקור ללא צמיחה על המדיום, כפי שניתן לראות באיור 3A. ראינו שיעורי צוהר טיפוסיים של 41% (n = 46) עבור oothecae מעוקר, לא מזוהם, עם ממוצע של 11 נימפות לכל ootheca. נימפות גדולות יותר מועברות לבקבוקי BHI המכוסים בנייר כסף, כמו באיור 4. הרדיד מונע זיהום, ולנימפות יש מקום לגדול. RFLP של rDNA 16S מנימפה הומוגנית משמש לאישור מצב gnotobiotic. נימפות גנוטוביוטיות נצפו גדלות בקצב איטי יותר מעמיתיהן הלא סטריליים, כפי שמייצג איור 5. איור 6 מציג תוצאות מחרקים גנוטוביוטיים בהצלחה וכן מנימפות סטנדרטיות (לא סטריליות).
בעוד בדיקה זו עדיין לא זיהתה זיהום בהיעדר תוצאה תרבותית חיובית, צעד זה בוצע באופן שגרתי במהלך ניסויים קריטיים כדי לשלול את נוכחותם של מיקרואורגניזמים רגישים לחמצן או קיבה. צמיחה איטית יותר נצפתה במקקים gnotobiotic בהשוואה חרקים רגילים / לא סטריליים.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61316/61316fig01.jpg"> איור 1: הגדרת תרבות מלאי ג'וקים. ניתן לראות צינורות קרטון מוערמים בקצה הרחוק של המיכל. מזון ומים נמצאים שניהם ליד חזית המיכל. כיסוי בד כותנה ותפס אלסטי הוסרו לנראות. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61316/61316fig01large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61316/61316fig02.jpg"> איור 2: ג'וק אמריקאי "בהריון". החץ מציין את ה"אותקה". <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61316/61316fig02large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61316/61316fig3v2.jpg"> איור 3: תמונות של נימפות גנוטוביוטיות בהצלחה בקעו ועוקרו ללא הצלחה oothecae על שיפונות BHI. Oothecae היו מעוקרים ודגר כמתואר בפרוטוקול זה. (A)חוסר הצמיחה המיקרוביאלית בשיפיון BHI מצביע על כך שה חרקים נקיים מאורגניזמים זעירים. (B)Oothecae על שבלונים שתוצאתם היווצרות המושבה צריך להיות מושלך כמו מזוהם. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61316/61316fig03large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61316/61316fig04.jpg"> איור 4: מנגנון גידול גנוטוביוטי. חרקים נשמרים בבקבוקים סטריליים מכוסים במכסה נייר כסף כדי למנוע זיהום. המיכל המשני (מכסה ירוק) מעוקר עם 2% אקונומיקה ואחריו 70% אתנול. זרימת האוויר אינה מוגבלת במיכל המשני. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61316/61316fig04large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61316/61316fig5v2.jpg"> איור 5: נתוני קצב צמיחה מייצגים המשווים אורך גוף של נימפות גנוטיוטיות ולא סטריליות. שתי קבוצות החרקים קיבלו תזונה של מכרסמים אוטוקלאבים. חרקים Gnotobiotic (כאן: n = 105) נשמרים על BHI כמתואר. חרקים לא סטריליים (כאן: n = 50) חיים בבקבוקים עם מצעי עץ אוטומטיים עם מנות קטנות למים. נימפות לא סטריליות גדלות בקצב ממוצע של 0.059 מ"מ ליום, בעוד נימפות gnotobiotic לגדול ב 0.028 מ"מ ליום (p < 0.0001). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61316/61316fig5v2large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61316/61316fig05.jpg"> איור 6: תמונת ג'ל מייצגת של תוצאות RFLP לבקרת איכות. אמפליונים שלמים של גנים 16S התעכלו עם RsaI. DNA עבור PCR חולץ נימפות הומוגני ב 1x PBS. נתיבי "G נימפה" תואמים לנימפות גנוטוביות, בעוד נתיבי "conv nymph" תואמים לעמיתיהם הקונבנציונליים והלא סטריליים. בהתבסס על תקציר הגבלה וירטואלית, אנדוסימביונט (Blattabacterium) צפוי להיות להקות בגדלים 402 bp, 206 bp, ו 163 bp, עם מריחה של להקות בין 163 bp ו 148 bp. חרק גנוטוביוטי אמור להראות רק את תבנית הפסים של בלטבקטריום. קהילת חיידקים מעורבת צפויה להיות מריחה של להקות בגדלים שונים, שכותרתו כאן "שברי 16S חיידקיים אחרים". <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61316/61316fig05large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Establishment and Maintenance of Gnotobiotic American Cockroaches Periplaneta americana at JoVE.com

Establishment and Maintenance of Gnotobiotic American Cockroaches Periplaneta americana

פרוטוקול זה משמש להקמה ותחזוקה של מקקים אמריקאים גנוטוביוטיים(Periplaneta americana)על ידי חיטוי פני השטח של ארגזי הביצים (oothecae) לפני הבקיעה. חרקים גנוטוביוטיים אלה מכילים את האנדוסימביונים של בלטבקטריום המועברים אנכית, אך יש להם מעיים גרזניים.

הקמה ותחזוקה של מקקים אמריקאים גנוטוביוטיים (Periplaneta americana)

Gnotobiotic animals are a powerful tool for the study of controls on microbiome structure and function. Presented here is a protocol for the establishment ...

פרוטוקול יצירת ג'וקים gnotobiotic מאפשר בדיקה של ההשפעה של הסרת הקהילה מיקרוביאלית במעיים מקוריים והחלפה על בריאות המארח הרכבה מיקרוביום. טכניקה זו משתמשת בשיטות ממקורות מרובים כדי ליצור זרימת עבודה מלוכדת ויעילה ליצירת מקקים gnotobiotic ללא שימוש בציוד מעבדה מיוחד יקר. בהתחשב בחלקים הנעים השונים הרבים של פרוטוקול gnotobiotic זה, הדמיה מסייעת לחוקרים להקים בקלות רבה יותר משלהם בקנה מידה קטן, בעלות נמוכה, ספסל העליון gnotobiotic מתקנים.כדי להקל על איסוף המספר המתאים של נקבות הנושאות אותקי לניסויים המתוכננים, השתמש במלקחיים כדי להזיז את צינורות הקרטון המכילים נקבות גראביד במיכל המלאי. אם צינור קרטון מכיל חרקים מרובים בנוסף לנקבה הכבידה, לנער את תכולת הצינור לתוך מיכל פלסטיק נוסף מוקף ג'לי נפט ולעודד את חרק היעד לטפס בחזרה לתוך צינור הקרטון לבד. עם הגבייה, העבירו כל נקבה מגרדת למחלקת היולדות.ברגע שהנקבות הפילו את הביוטקאין שלהן, החזירו את הנקבות למיכל המלאי והשתמשו במלקחיים כדי להחזיר את הoothecae מהפסולת. כדי לנקות את oothecae, למקם עד חמישה ארגזי ביצה בצינור צנטריפוגה חמישה מיליליטר המכיל שלושה מיליליטר של נתרן דודציל סולפט ומערבולת oothecae במשך 10 שניות. לאחר שטיפה שנייה כפי שהוכח זה עתה, השתמש במגבון משימה עדין כדי לשפשף בעדינות את פני השטח של כל בותקה כדי להסיר את כל הפסולת ולמקם את הootheca ניקה לתוך סירת שקילה.לפני עיקור, למלא שני צינורות צנטריפוגה 1.5 מיליליטר לכל ootheca עם מיליליטר אחד של מים סטריליים לכל צינור. כמו כן להוסיף 10 microliters של 32% תמיסת מלאי חומצה peracetic ל 3.2 מיליליטר של מים מזוקקים כפול בצינור צנטריפוגה חמישה מיליליטר במכסה המנוע אדים. כובע והפך מספר פעמים כדי לערבב ולמקם עד חמישה oothecae ניקה בתמיסת חומצה 0.1% טרי מוכן במשך חמש דקות, היפוך הצינור מספר פעמים כל 60 שניות.חומצה Peracetic היא חמצון חזק עין, עור, ומרגיז הנשימה, והוא דליק ומאכל. תמיד ללבוש את PPE הנכון במהלך הטיפול להיפטר הפסולת שלך כראוי. בסוף הדגירה, להשתמש מלקחיים סטריליים מכסה המנוע זרימה למינאר להעביר כל ootheca לצינור צנטריפוגה משלה של מים שטיפים סטריליים.הפוך מספר פעמים לערבב לפני העברת oothecae לקבוצה השנייה של צינורות של מים לשטוף. לאחר השטיפה השנייה, השתמש במלקחיים סטריליים כדי להעביר את הביותקיי לנטיות BHI בודדות. מניחים את הנטיות לתוך מיכל משני מעוקר ומעבירים את המיכל לאינקובטור לח של 30 מעלות צלזיוס במשך ארבעה עד חמישה שבועות עד לבקיעה.בדוק את ההטלות באופן קבוע פעם עד פעמיים בשבוע לצמיחה פטרייתית או חיידקית עד השבוע הרביעי, ובשלב זה יש לבדוק את ההטלות מדי יום. כאשר הנימפות מתחילות לבקוע, השתמש במלקחיים סטריליים ובמכסה המנוע של זרימה למינארית כדי להעביר באופן לא נכון גלולה של צ'או עכברוש מעוקר לבקבוק BHI מוכן. כבדיקת סטריליות, הנח את הבקבוק במיכל המשני באינקובטור 30 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות כדי לאשר חוסר צמיחה מזהמת.אם הבקבוק נשאר סטרילי, לנער את הנימפות מתוך השיפוע, לתת להם ליפול לתוך הבקבוק במכסה המנוע לזרום למינאר. ואז להשקות את הנימפות עם 300 מיקרוליטרים של מים סטריליים פעם בשבוע במכסה המנוע של זרימת למינאר. כאשר צואת נימפה מתחילה לכסות את הרצפה הבינונית, להעביר את הנימפות בקבוק BHI חדש המכיל צ'או עכברוש מעוקר הוסיף 24 שעות מראש, כפי שהוכח.נקבות בהריון ניתן לזהות על ידי ootheca מחובר הבטן האחורית שלהם. oothecae בוקע בממוצע 34 ימים לאחר עיקור. במקרים של עיקור לא מוצלח, הצמיחה יכולה להופיע סביב oothecae במהלך הדגירה, להתפשר על המצב gnotobiotic של הגוזלים.לאחר מכן ניתן לעקוב אחר קצב הגדילה של הנימפה על ידי מדידת אורך גוף החרקים. ניתן להשתמש בפולימורפיזם באורך שבר ההגבלה של הדנ"א הריבוזומלי 16S מנימפה הומוגנית כדי לאשר מצב גנוביוטי. גנוטוביוטיקה מקקים יכול להיות מחוסן עם קהילות מיקרוביאליות סינתטי או xenobiotic.בעוד זרימת עבודה מסוימת זו היא חדשה, מחקרים קודמים באמצעות גנוביוטיים ג'וקים יצרו תובנה לתוך הרכבה מיקרוביום במעיים ותפקידים מיקרוביאליים בעיצוב התנהגות חברתית, בריאות המעיים, וחסינות של מארחי החרקים שלהם.

Research

JoVE Journal

Biology

Establishment and Maintenance of Gnotobiotic American Cockroaches (Periplaneta americana)

Blood Collection from the American Horseshoe Crab, Limulus Polyphemus

דם אוסף של סרטן הפרסה האמריקאי, Limulus פוליפמוס

The horseshoe crab has the best-characterized immune system of any long-lived invertebrate.  The study of immunity in horseshoe crabs has been facilitated ...

Culture and Maintenance of Human Embryonic Stem Cells  

תרבות ותחזוקה של בתאי גזע עובריים אנושיים

Human embryonic stem (hES) cells must be monitored and cared for in order to maintain healthy, undifferentiated cultures. At minimum, the cultures must be ...

Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells

בידוד תרבות ראשונית של תאים בכבד עכברוש

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology ...

Maintenance of a Drosophila melanogaster Population Cage

Maintenance of a Drosophila melanogaster Population Cage

תחזוקה של<em&gt; תסיסנית</em&gt; אוכלוסיית קייג

Large quantities of DNA, RNA, proteins and other cellular components are often required for biochemistry and molecular biology experiments. The short life ...

Establishment of an Extracellular Acidic pH Culture System

הקמת מערכת התרבות pH חומצי חוץ-תאית

Conditions of the tumor microenvironment, such as hypoxia or nutrient starvation, play critical roles in cancer progression and malignancy. However, the ...

Practical Use of RNA Interference: Oral Delivery of Double-stranded RNA in Liposome Carriers for Cockroaches

שימוש מעשי של RNA הפרעה: משלוח אוראלי של זוגיות גדילי RNA ב ליפוזום ספקים עבור ג ' וקים

RNA interference (RNAi) has been widely applied for uncovering the biological functions of numerous genes, and has been envisaged as a pest control tool ...

Establishment of a Clonal Culture of Unicellular Conjugating Algae

הקמתה של תרבות המשובטים של אצות חד־תאיות שהיו Conjugating

It is essential to establish clonal cultures of microalgae for use in studies of various topics, such as physiology, genetics, taxonomy, and microbiology. ...

Anaerobic Growth and Maintenance of Mammalian Cell Lines

צמיחה אנאירובית ותחזוקה של שורות תאים בתרבית

Most mucosal surfaces along with the midpoints in tumors and stem cell niches are geographic areas of the body that are anoxic. Previous studies show that ...

Isolation and Characterization of Adult Cardiac Fibroblasts and Myofibroblasts

בידוד ואפיון של מבוגרים ופיברותקיעות לב ומיופיברופיצוצים

Cardiac fibrosis in response to injury is a physiological response to wound healing. Efforts have been made to study and target fibroblast subtypes that ...