Name: establishment and maintenance of gnotobiotic american cockroaches (periplaneta americana)
Uploaded: 2021-05-28T12:30:00
Duration: 6 min 9 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Establishment and Maintenance of Gnotobiotic American Cockroaches Periplaneta americana at JoVE.com

Эта публикация была поддержана Национальным институтом общих медицинских наук Национальных институтов здравоохранения под номером R35GM133789. Содержание является исключительной ответственностью авторов и не обязательно представляет официальную точку зрения Национальных институтов здравоохранения. Авторы хотели бы поблагодарить Джози Дайера за отслеживание скорости стерилизации, скорости вылупления и темпов роста гнотобиотических тараканов.

<ol>
	<li>Yi, P., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+germfree+murine+animal:+An+important+animal+model+for+research+on+the+relationship+between+gut+microbiota+and+the+host.">The germfree murine animal: An important animal model for research on the relationship between gut microbiota and the host.</a> Veterinary Microbiology. 157 (1-2), 1-7 (2012).</li><li>Nature Biotechnology. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laying+better+plans+for+mice.">Laying better plans for mice.</a> Nature Biotechnology. 31 (4), 263-263 (2013).</li><li>Nicklas, W., Keubler, L., Bleich, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintaining+and+Monitoring+the+Defined+Microbiota+Status+of+Gnotobiotic+Rodents.">Maintaining and Monitoring the Defined Microbiota Status of Gnotobiotic Rodents.</a> ILAR Journal. 56 (2), 241-249 (2015).</li><li>Faith, J. J., Ahern, P. P., Ridaura, V. K., Cheng, J., Gordon, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+Gut+Microbe-Host+Phenotype+Relationships+Using+Combinatorial+Communities+in+Gnotobiotic+Mice.">Identifying Gut Microbe-Host Phenotype Relationships Using Combinatorial Communities in Gnotobiotic Mice.</a> Science Translational Medicine. 6 (220), 11 (2014).</li><li>Moon, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vertically+transmitted+faecal+IgA+levels+determine+extra-chromosomal+phenotypic+variation.">Vertically transmitted faecal IgA levels determine extra-chromosomal phenotypic variation.</a> Nature. 521 (7550), 90-93 (2015).</li><li>Eun, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+Bacterial+Antigen-Specific+Colitis+by+a+Simplified+Human+Microbiota+Consortium+in+Gnotobiotic+Interleukin-10-/-+Mice.">Induction of Bacterial Antigen-Specific Colitis by a Simplified Human Microbiota Consortium in Gnotobiotic Interleukin-10-/- Mice.</a> Infection and Immunity. 82 (6), 2239-2246 (2014).</li><li>Cherbuy, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbiota+matures+colonic+epithelium+through+a+coordinated+induction+of+cell+cycle-related+proteins+in+gnotobiotic+rat.">Microbiota matures colonic epithelium through a coordinated induction of cell cycle-related proteins in gnotobiotic rat.</a> American Journal of Physiology: Gastrointestinal and Liver Physiology. 299 (2), 348-357 (2010).</li><li>Van Den Abbeele, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabinoxylans+and+inulin+differentially+modulate+the+mucosal+and+luminal+gut+microbiota+and+mucin-degradation+in+humanized+rats.">Arabinoxylans and inulin differentially modulate the mucosal and luminal gut microbiota and mucin-degradation in humanized rats.</a> Environmental Microbiology. 13 (10), 2667-2680 (2011).</li><li>Stecher, B., Berry, D., Loy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colonization+resistance+and+microbial+ecophysiology:+using+gnotobiotic+mouse+models+and+single-cell+technology+to+explore+the+intestinal+jungle.">Colonization resistance and microbial ecophysiology: using gnotobiotic mouse models and single-cell technology to explore the intestinal jungle.</a> FEMS Microbiology Reviews. 37 (5), 793-829 (2013).</li><li>Sugahara, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probiotic+Bifidobacterium+longum+alters+gut+luminal+metabolism+through+modification+of+the+gut+microbial+community.">Probiotic Bifidobacterium longum alters gut luminal metabolism through modification of the gut microbial community.</a> Scientific Reports. 5 (1), 13548 (2015).</li><li>Mart&#237;n, R., Berm&#250;dez-Humar&#225;n, L. G., Langella, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gnotobiotic+Rodents:+An+In+Vivo+Model+for+the+Study+of+Microbe-Microbe+Interactions.">Gnotobiotic Rodents: An In Vivo Model for the Study of Microbe-Microbe Interactions.</a> Frontiers in Microbiology. 7, 409 (2016).</li><li>Mallapaty, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gnotobiotics:+getting+a+grip+on+the+microbiome+boom.">Gnotobiotics: getting a grip on the microbiome boom.</a> Lab Animal. 46 (10), 373-377 (2017).</li><li>Nguyen, T. L. A., Vieira-Silva, S., Liston, A., Raes, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+informative+is+the+mouse+for+human+gut+microbiota+research.">How informative is the mouse for human gut microbiota research.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 8 (1), 1-16 (2015).</li><li>Correa, M. A., Matusovsky, B., Brackney, D. E., Steven, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+axenic+Aedes+aegypti+demonstrate+live+bacteria+are+not+required+for+mosquito+development.">Generation of axenic Aedes aegypti demonstrate live bacteria are not required for mosquito development.</a> Nature Communications. 9 (1), 4464 (2018).</li><li>Trinder, M., Daisley, B. A., Dube, J. S., Reid, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+melanogaster+as+a+High-Throughput+Model+for+Host&#8211;Microbiota+Interactions.">Drosophila melanogaster as a High-Throughput Model for Host&#8211;Microbiota Interactions.</a> Frontiers in Microbiology. 8, 751 (2017).</li><li>Zheng, H., Steele, M. I., Leonard, S. P., Motta, E. V. S., Moran, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Honey+bees+as+models+for+gut+microbiota+research.">Honey bees as models for gut microbiota research.</a> Lab animal. 47 (11), 317-325 (2018).</li><li>Engel, P., Moran, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+gut+microbiota+of+insects+-+diversity+in+structure+and+function.">The gut microbiota of insects - diversity in structure and function.</a> FeMS Microbiology Reviews. 37 (5), 699-735 (2013).</li><li>Tinker, K. A., Ottesen, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Core+Gut+Microbiome+of+the+American+Cockroach,+Periplaneta+americana,+Is+Stable+and+Resilient+to+Dietary+Shifts.">The Core Gut Microbiome of the American Cockroach, Periplaneta americana, Is Stable and Resilient to Dietary Shifts.</a> Applied and Environmental Microbiology. 82 (22), 6603-6610 (2016).</li><li>Zurek, L., Keddie, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+the+colon+and+colonic+bacterial+flora+to+metabolism+and+development+of+the+american+cockroach+Periplaneta+americana+L.">Contribution of the colon and colonic bacterial flora to metabolism and development of the american cockroach Periplaneta americana L.</a> Journal of Insect Physiology. 42 (8), 743-748 (1996).</li><li>Cruden, D. L., Markovetz, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+aspects+of+the+cockroach+hindgut.">Microbial aspects of the cockroach hindgut.</a> Archives of Microbiology. 138, 131-139 (1984).</li><li>Pietri, J. E., Tiffany, C., Liang, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+the+microbiota+affects+physiological+and+evolutionary+aspects+of+insecticide+resistance+in+the+German+cockroach,+an+important+urban+pest.">Disruption of the microbiota affects physiological and evolutionary aspects of insecticide resistance in the German cockroach, an important urban pest.</a> PLoS ONE. 13 (12), 0207985 (2018).</li><li>Benschoter, C., Wrenn, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germfree+techniques+for+establishment+and+maintenance+of+a+colony+of+aseptic+German+cockroaches.">Germfree techniques for establishment and maintenance of a colony of aseptic German cockroaches.</a> Annals of the Entomological Society of America. 65 (3), 641-644 (1972).</li><li>Tegtmeier, D., Thompson, C. L., Schauer, C., Brune, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen+Affects+Gut+Bacterial+Colonization+and+Metabolic+Activities+in+a+Gnotobiotic+Cockroach+Model.">Oxygen Affects Gut Bacterial Colonization and Metabolic Activities in a Gnotobiotic Cockroach Model.</a> Applied and Environmental Microbiology. 82 (4), 1080-1089 (2016).</li><li>Clayton, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simplified+method+for+the+culture+of+Blattella+germanica+under+aseptic+conditions.">A simplified method for the culture of Blattella germanica under aseptic conditions.</a> Nature. 184 (4693), 1166-1167 (1959).</li><li>Doll, J. P., Trexler, P. C., Reynolds, L. I., Bernard, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Use+of+Peracetic+Acid+to+Obtain+Germfree+Invertebrate+Eggs+for+Gnotobiotic+Studies.">The Use of Peracetic Acid to Obtain Germfree Invertebrate Eggs for Gnotobiotic Studies.</a> American Midland Naturalist. 69 (1), 231 (1963).</li><li>Wada-Katsumata, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gut+bacteria+mediate+aggregation+in+the+German+cockroach.">Gut bacteria mediate aggregation in the German cockroach.</a> Proceedings of the National Academy of Science. 112, 15678-15683 (2015).</li><li>Jahnes, B. C., Herrmann, M., Sabree, Z. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conspecific+coprophagy+stimulates+normal+development+in+a+germ-free+model+invertebrate.">Conspecific coprophagy stimulates normal development in a germ-free model invertebrate.</a> PeerJ. 7, 6914 (2019).</li><li>Mikaelyan, A., Thompson, C. L., Hofer, M. J., Brune, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deterministic+Assembly+of+Complex+Bacterial+Communities+in+Guts+of+Germ-Free+Cockroaches.">Deterministic Assembly of Complex Bacterial Communities in Guts of Germ-Free Cockroaches.</a> Applied Environmental Microbiology. 82 (4), 1256-1263 (2016).</li><li>Katoh, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Group-housed+females+promote+production+of+asexual+ootheca+in+American+cockroaches.">Group-housed females promote production of asexual ootheca in American cockroaches.</a> Zoological Letters. 3, 3 (2017).</li><li>Greenspan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Humidity+fixed+points+of+binary+saturated+aqueous+solutions.">Humidity fixed points of binary saturated aqueous solutions.</a> Journal of Research of the National Bureau of Standards. 81 (1), 89-96 (1976).</li><li>Bressan-Nascimento, S., Oliveira, D. M. P., Fox, E. G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermal+requirements+for+the+embryonic+development+of+Periplaneta+americana+(L.)+(Dictyoptera:+Blattidae)+with+potential+application+in+mass-rearing+of+egg+parasitoids.">Thermal requirements for the embryonic development of Periplaneta americana (L.) (Dictyoptera: Blattidae) with potential application in mass-rearing of egg parasitoids.</a> Biological Control. 47 (3), 268-272 (2008).</li><li>Nation, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Insect Physiology and Biochemistry, Second Edition. , (2008).</li><li>House, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nutritional+studies+with+Blattella+germanica+(L.)+reared+under+aseptic+conditions+I.+Equipment+and+technique.">Nutritional studies with Blattella germanica (L.) reared under aseptic conditions I. Equipment and technique.</a> The Canadian Entomologist. 81 (5), 94-100 (1949).</li><li>Stinson, L. F., Keelan, J. A., Payne, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+removal+of+contaminating+microbial+DNA+from+PCR+reagents:+impact+on+low-biomass+microbiome+analyses.">Identification and removal of contaminating microbial DNA from PCR reagents: impact on low-biomass microbiome analyses.</a> Letters in Applied Microbiology. 68 (1), 2-8 (2018).</li><li>Kircher, M., Sawyer, S., Meyer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double+indexing+overcomes+inaccuracies+in+multiplex+sequencing+on+the+Illumina+platform.">Double indexing overcomes inaccuracies in multiplex sequencing on the Illumina platform.</a> Nucleic Acids Research. 40, 3 (2011).</li><li>Sabree, Z. L., Kambhampati, S., Moran, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitrogen+recycling+and+nutritional+provisioning+by+Blattabacterium,+the+cockroach+endosymbiont.">Nitrogen recycling and nutritional provisioning by Blattabacterium, the cockroach endosymbiont.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of the America. 106 (46), 19521-19526 (2009).</li><li>Ayayee, P. A., Ondrejech, A., Keeney, G., Mu&#241;oz-Garcia, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+gut+microbiota+in+the+regulation+of+standard+metabolic+rate+in+female+Periplaneta+americana.">The role of gut microbiota in the regulation of standard metabolic rate in female Periplaneta americana.</a> PeerJ. 6, 4717 (2018).</li><li>Krajmalnik-Brown, R., Ilhan, Z. E., Kang, D. W., DiBaise, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+gut+microbes+on+nutrient+absorption+and+energy+regulation.">Effects of gut microbes on nutrient absorption and energy regulation.</a> Nutrition in clinical practice : official publication of the American Society for Parenteral and Enteral Nutrition. 27 (2), 201-214 (2012).</li><li>Rowland, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gut+microbiota+functions:+metabolism+of+nutrients+and+other+food+components.">Gut microbiota functions: metabolism of nutrients and other food components.</a> European Journal of Nutrition. 57 (1), 1-24 (2018).</li><li>Gier, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+rate+in+the+cockroach+Periplaneta+americana+(Linn).">Growth rate in the cockroach Periplaneta americana (Linn).</a> Annals of the Entomological Society of America. 40, 303-317 (1947).</li></ol>

У авторов нет конфликта интересов для раскрытия.

Другие методы, описывающие генерацию гнотобиотических тараканов, либо не описывали коллекцию оотеков, либо использовали критерии, специфичные для других видов тараканов, чтобы указать, когда оотеки могут быть удалены из матери23,25,26. Первоначально оотеки собирались из подстилки из древесной щепа в резервуарах для запасов, что приводило к очень низкой скорости вылупления (~ 10%) по сравнению с нестерилизованными оотеками (47%)29. Вероятно, это связано с тем, что невыхлопнутые оотеки накапливаются с течением времени в клетке для стая, и нет никакого способа проверить возраст или жизнеспособность оотеки. Реализация подхода «родильного отделения» позволяет осуществлять сбор свежедепонированных яйцеклеток известного возраста. Это еще больше облегчает экспериментальное планирование, поскольку исследователь может предвидеть вероятное время вылупления для отдельных оотеков. Другая модификация из первоначальных и опубликованных протоколов включает инкубацию оотеков и нимф в полузапечатанные камеры, также содержащие перенасыщенный раствор хлорида натрия. Наличие раствора поддерживает относительную влажность воздуха примерно 75%30. Oothecae обычно инкубируют при 30 °C, что, как было показано, сводит к минимуму количество дней, необходимых для инкубации, а также максимизирует жизнеспособность эмбрионов и количество нимф, полученных на ootheca31. После вылупления гнотобиотические нимфы обычно культивируются на столешнице при температуре в лаборатории и условиях окружающей среды, хотя камеры с контролируемой влажностью снова используются для критических экспериментов. После установления этих изменений в сборе и инкубации оотеки частота вылупления увеличилась примерно до 41% (n = 51), не включая оотеки, удаленные из-за загрязнения. Потенциальный путь к дальнейшей оптимизации скорости вывода может включать в себя продление времени между сбором оотеки и стерилизацией. Кутикула яйцеклетки не может быть полностью загорелой при первоначальном высвобождении32и, следовательно, может быть проницаемой для растворов, используемых во время стерилизации, в течение 24 ч после сброса.
Протокол стерилизации с использованием 0,1% перуксусной кислоты был адаптирован из Doll et al.25. В других исследованиях были задокументированы альтернативные методы стерилизации oothecae23,26. Степень загрязнения основана на неразрушаемом методе инкубации оотека на уклоне BHI. Такой подход очень выгоден, так как позволяет быстро выявлять и удалять загрязненные оотеки. Большинство предыдущих протоколов проверяют культивируемые организмы путем покрытия фекалий или гомогенатов нимф на бактериологических средах и проверки роста22,23,25,27,28,33. По крайней мере, в одном случае метод тестирования гнотобиотического статуса не был полностью описан26. За исключением Клейтона, который добавил небольшую плиту теста стерильности среды к выращиванию бутылок24,предыдущие методы22,23 размещали гнотобиотических насекомых на бактериологических средах только в течение коротких периодов времени для первоначальной оценки протокола стерилизации.
Продолжение размещения полученных нимф на среде BHI в качестве встроенной меры контроля качества позволяет контролировать их гнотобиотический статус в полуреайт-тайме — метод, не замеченный в большинстве предыдущих методов22,23. Это особенно полезно для долгосрочных экспериментов, которые требуют доступа к гнотобиотическим нимфам. Если пол BHI под нимфами кажется загрязненным бактериальным или грибковым ростом, колбу следует выбросить. Этот тип загрязнения обычно возникает при раскрытии колб водным нимфам, но он также может возникнуть из фекалий в случае недостаточно стерилизованных оотеков или пищи. Использование ламинарной проточной вытяжки при поливе улучшает скорость загрязнения, вызванного вскрытием колбы.
Поскольку не все загрязняющие организмы могут аэробно расти на среде BHI, требуется дополнительный независимый от культуры метод тестирования стерильности. Одним из потенциальных подходов является микроскопия27,но этот подход может быть трудоемким. Другие протоколы используют методы, основанные на последовательностях, для обнаружения организмов, которые могут покинуть культуру14,23,27,28. Однако такие подходы часто являются дорогостоящими и трудными для интерпретации, поскольку на результаты высокопроизводительных подходов к секвенированию может легко повлиять низкоуровневое загрязнение реагентов34 и штрих-кодов35. Вместо этого был разработан новый подход, который использует ПЦР-амплификацию гена 16S рРНК в сочетании с полиморфизмом длины рестрикционного фрагмента для визуализации как эндосимбионта, так и любых загрязняющих симбионтов кишечника. Этот метод включает в себя внутренний контроль ПЦР, поскольку ген Blattabacterium16S был секвенирован, и его полосатый паттерн должен присутствовать как у гнотобиотических, так и у нестерильных насекомых. Поскольку паттерн рестрикции эндозимбионта может быть предсказан по последовательности36его генома, нет необходимости секвенировать ампликоны или фрагменты рестрикции, если только не требуется идентификация какого-либо загрязняющего вещества. Текущая версия этого протокола призывает к принесению нимфы в жертву для ПЦР / RFLP, но этот метод также может быть использован на фекалиях в качестве неразрушающей меры. Однако он не будет включать в себя встроенный контроль, так как кал не должен содержать много Blattabacterium.
Дополнительным легко модифицируемым, но критическим компонентом выращивания гнотобиотических животных является диета. Хотя агар BHI может служить временным источником пищи для насекомых, было обнаружено, что он приводит к значительному дефициту роста среди нимф при использовании в качестве единственного источника пищи в течение длительных периодов времени. В то время как различные диеты были опробованы, автоклавируемый крысиный чау рекомендуется в качестве обычной диеты для поддержания гнотобиотических насекомых. Диеты, специально не разработанные для стерилизации, часто было трудно сделать полностью стерильными, и было обнаружено, что многие стерильные или автоклавируемые диеты лабораторных животных демонстрируют быстрый рост грибков в нестерильных условиях. Эта тенденция к деградации в нестерильных условиях сделала их непригодными для использования в экспериментах, непосредственно сравнивающих гнотобиотических и нонгнотобиотических насекомых. Рекомендуемая диета позволяет использовать последовательную диету между гнотобиотическими и стандартными нимфами, облегчая сравнение характеристик, таких как темпы роста, между двумя группами.
Как другие наблюдали27,гнотобиотические нимфы растут медленнее, чем их нестерильные собратья. Сравнение длины тела гнотобиотических (n = 105) и нестерильных нимф (n = 50), которых кормили одной и той же автоклавной диетой грызунов и держали при комнатной температуре, показывает, что нестерильные нимфы вырастают в среднем 0,059 мм / день, в то время как гнотобиотические нимфы растут 0,028 мм / день (p < 0,0001)(рисунок 5). Было показано, что присутствие кишечной микробиоты у P. americana изменяет скорость метаболизма насекомых37,и считается, что кишечные сообщества в целом влияют на поглощение питательных веществ38,39. Эти причины подтверждают наблюдаемые различия в скорости роста гнотобиотических и нестерильных нимф.
Возможным ограничением этого метода является то, что гнотобиотические нимфы могут не достигать половой зрелости, так как самые старые стерильные когорты старше 10 месяцев и достигли только седьмой звезды (из 10; 11 - взрослая жизнь), как приближено к длине тела40. Эти самые старые когорты не находятся на диете автоклавных крыс, а вместо этого едят облученный крысиный чау, диету, которая содержит слишком много влаги, чтобы кормить нестерильные когорты без чрезмерного роста плесени. Было обнаружено, что нестерильные нимфы на нестерилизованного кормовом рационе для собак достигают совершеннолетия через 9−10 месяцев в лабораторных условиях (комнатная температура и влажность). Когортам гнотобиотических и нестерильных нимф на общих автоклавных крысиных чау в настоящее время менее 7 месяцев, нестерильные насекомые оцениваются как седьмые в звезде (в среднем: 16,7 мм), в то время как стерильные насекомые оцениваются как пятые в звезде (в среднем: 11,2 мм). В результате мы пока не можем проверить, могут ли наши гнотобиотические тараканы успешно размножаться. Однако, учитывая легкость, с которой новые гнотобиотические когорты могут быть созданы с использованием этого подхода, этот метод показывает большие перспективы даже при отсутствии доказанного размножения гнотобиотических насекомых.
В заключение, этот протокол предоставляет универсальный инструмент, который позволяет исследователям микробиома управлять своим собственным, недорогим гнотобиотическим «объектом», используя общие лабораторные материалы. Этот подход может быть использован для генерации гнотобиотических тараканов для экспериментов, изучающих роль микробиоты в формировании поведения хозяина, иммунитета, развития и стрессовыхреакций 21,26,27. Эти гнотобиотические насекомые также могут быть инокулированы синтетическими или ксенобиотическими сообществами и впоследствии использованы в качестве субъектов для исследований кишечного микробиома23,28. Кроме того, элементы этого подхода, включая использование бактериологических инкубационных камер с подкладкой из сред в качестве встроенной проверки стерильности, могут быть обобщены на другие модельные системы и могут облегчить рутинное содержание гнотобиотических животных в учреждениях меньшего масштаба.

Гнотобиотические животные оказались бесценными инструментами для исследований микробиома1,2,3. Животные без микробов и с определенной флорой позволили прояснить взаимодействия хозяина и микроба, включая иммунологические реакции хозяина, созревание эпителия кишечника и метаболизм хозяина1,4,5,6,7. Гнотобиотические животные, привитые упрощенным сообществом, также помогли в более полном понимании взаимодействий микроб-микроб в кишечном сообществе, в частности, в разгадке перекрестных кормлений и антагонистических отношений8,9,10,11. В настоящее время предпочтительной модельной системой для исследований в микробиоме кишечника млекопитающих является мышиная модель. Хотя эта система была жизненно важна для открытий, описанных выше, ключевым недостатком является связанная с этим стоимость. Для создания и обслуживания гнотобиотического объекта необходимо специализированное оборудование и высококвалифицированные технические специалисты. Это, в сочетании с дополнительной осторожностью, которая должна быть уделена каждому аспекту содержания гнотобиотических животных, приводит к тому, что гнотобиотическое животное стоит в десять-двадцать раз дороже, чем стандартное животное модели12. Из-за высоких затрат многие исследователи могут быть не в состоянии позволить себе гнотобиотическую модель мыши. Кроме того, в то время как мышиные модели могут быть наиболее широко принятым выбором для исследований, направленных на перевод на здоровье человека, все еще существует много физиологических и морфологических различий между кишечником человека и мыши13. Очевидно, что ни одна единичная модель не является достаточной, чтобы ответить на постоянно растущее число вопросов, касающихся многих аспектов кишечного микробиома.
Модели насекомых являются более дешевой альтернативой из-за их более низкой стоимости обслуживания по сравнению с видами млекопитающих. Обширные исследования без микробов и гнотобиотиков на различных видах насекомых привели к разработке нескольких широко используемых моделей. Комары и дрозофилы являются общими моделями работы без микробов из-за их актуальности для глобальных заболеваний и генетической трактовки14,15. Другой новой модельной системой является система медоноснойпчелы (Apis mellifera),учитывая ее важность в исследованиях опыления и социальности16. Однако многим из этих широко используемых насекомых не хватает таксономической сложности, наблюдаемой в сообществах кишечника млекопитающих17,что ограничивает их способность моделировать взаимодействия более высокого порядка. Мало того, что общее разнообразие микробов, обнаруженных в кишечнике американских тараканов, больше похоже на млекопитающих, но многие из микробов, присутствующих в кишечнике таракана, принадлежат к семействам и типам, которые обычно встречаются в кишечной микробиоте млекопитающих и людей18. Задворка таракана также функционально аналогична толстой кишке млекопитающих, так как представляет собой ферментационную камеру, плотно заполненную бактериями для помощи в извлечении питательных веществ19,20. Наконец, всеядный характер тараканов допускает разнообразие режимов питания, которые были бы невозможны с диетологами.
Американские тараканы могут быть полезной модельной системой для понимания микробных сообществ кишечника в высших организмах, но статус таракана как вредителя также делает эту систему актуальной для борьбы с вредителями21. Использование фундаментальных знаний о влиянии кишечного сообщества на здоровье и физиологию тараканов помогает в разработке новых методов борьбы с вредителями.
Целью этого метода является подробное описание становления и содержания гнотобиотических американских тараканов(Periplaneta americana),но этот протокол может быть использован для генерации нимф любого яйцекладущего таракана. Он включает в себя метод эффективного, неинвазивного сбора зрелых оотеков и неразрушающий метод мониторинга гнотобиотического статуса насекомых22,23,24. В то время как предыдущие методы достижения и поддержания гнотобиотических тараканов описывают коллекцию ootheca23,24,25,26,27,зрелость оотеки либо интерпретируется в терминах видоспецифических сигналов (в Blattella germanica22,24,25),либо явно не описана27,28,что затрудняет реализацию для тех, кто не знаком с системой. Поскольку описанный здесь способ использует естественно упавшие оотеки, погрешность преждевременного удаления яйцеклеток отсутствует. Этот протокол содержит как зависящие от культуры, так и зависящие от культуры методы контроля качества, а зависящий от культуры метод не требует жертвоприношения насекомых. Наконец, этот метод объединяет информацию из нескольких исследований гнотобиотических тараканов для создания единого всеобъемлющего протокола со всей необходимой информацией для достижения и поддержания гнотобиотических тараканов.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2X master mix</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>M0482</td>
			<td>OneTaq MasterMix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclavable rat chow</td>
			<td>Zeigler</td>
			<td>NIH-31 Modified Auto</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacterial DNA extraction kit</td>
			<td>Omega Bio-Tek</td>
			<td>D-3350</td>
			<td>E.Z.N.A. Bacterial DNA kit; includes lysozyme, glass beads, proteinase K, buffers (proteinase K, binding, wash, elution), DNA columns, 2-mL collection tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>binding buffer</td>
			<td>Omega Bio-Tek</td>
			<td>PD099</td>
			<td>included in Omega Biotek&#39;s bacterial DNA extraction kit (&#34;HBC&#34; buffer)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>brain-heart infusion (BHI) broth</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>B11000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Delicate task wipes</td>
			<td>KimWipe</td>
			<td>JS-KCC-34155-PK</td>
			<td>KimWipes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA purification kit</td>
			<td>Omega Bio-Tek</td>
			<td>D6492</td>
			<td>E.Z.N.A. Cycle Pure kit; D6493 may also be used; includes buffers (purifying ,wash, elution)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>elution buffer</td>
			<td>Omega Bio-Tek</td>
			<td>PDR048</td>
			<td>included in Omega Biotek&#39;s bacterial DNA extraction kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass beads</td>
			<td>Omega Bio-Tek</td>
			<td>n/a</td>
			<td>included in Omega Biotek&#39;s bacterial DNA extraction kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybridization oven</td>
			<td>UVP</td>
			<td>95-0330-01</td>
			<td>we use a hybridization oven for preheating elution buffer, but a water bath could probably also be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar flow biological safety cabinet</td>
			<td>NuAire, Inc.</td>
			<td>NU-425-400</td>
			<td>Protocol refers to this as &#34;laminar flow hood&#34; for brevity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lysozyme</td>
			<td>Omega Bio-Tek</td>
			<td>n/a</td>
			<td>included in Omega Biotek&#39;s bacterial DNA extraction kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>peracetic acid stock solution (32%)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>269336</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petroleum jelly</td>
			<td>Vaseline</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>proteinase K buffer</td>
			<td>Omega Bio-Tek</td>
			<td>PD061</td>
			<td>included in Omega Biotek&#39;s bacterial DNA extraction kit (&#34;TL buffer&#34;)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>purifying buffer</td>
			<td>Omega Bio-Tek</td>
			<td>PDR042</td>
			<td>included in Omega Biotek&#39;s CyclePure kit (&#34;CP&#34; buffer)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RsaI</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R0167</td>
			<td>Includes CutSmart (digestion) buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary container</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td>a plastic container with a lid (such as a Kritter Keeper) works well for this (25cm long x 15cm wide x 22cm high); it should be large enough to fit BHI slants and test tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>spectrophotometer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>ND-2000</td>
			<td>Catalog info is for NanoDrop2000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>thermal shaker</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>EP5386000028</td>
			<td>Thermomixer R</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-EDTA</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1338-1</td>
			<td>10 nm Tris, 1 mM EDTA, pH 8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>wash buffer</td>
			<td>Omega Bio-Tek</td>
			<td>PDR044</td>
			<td>included in Omega Biotek&#39;s bacterial DNA extraction kit (&#34;DNA wash&#34; buffer)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Woodchip bedding</td>
			<td>P.J. Murphy Forest Products</td>
			<td>Sani-Chips</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

establishment and maintenance of gnotobiotic american cockroaches (periplaneta americana)

Гнотобиотические животные являются мощным инструментом для изучения контроля над структурой и функцией микробиома. Здесь представлен протокол по установлению и содержанию гнотобиотических американских тараканов(Periplaneta americana). Этот подход включает в себя встроенные проверки стерильности для постоянного контроля качества. Гнотобиотические насекомые определяются здесь как тараканы, которые все еще содержат вертикально передаваемый эндосимбионт(Blattabacterium),но не имеют других микробов, которые обычно находятся на их поверхности и в их пищеварительном тракте. Для этого протокола яйцеклетки (oothecae) удаляются из (нестерильной) колонии и стерилизуются на поверхности. После сбора и стерилизации оотеки инкубируют при 30 °C в течение примерно 4-6 недель на агаре инфузии мозга и сердца (BHI) до тех пор, пока они не вылупятся или не будут удалены из-за загрязнения. Вылупившиеся нимфы переносятся в колбу Эрленмейера, содержащую пол BHI, стерильную воду и стерильную крысиную пищу. Чтобы гарантировать, что нимфы не являются обустройством микробов, которые не могут расти на BHI в данных условиях, дополнительная мера контроля качества использует полиморфизм ограничения длины фрагмента (RFLP) для тестирования на неэндосимбиотические микробы. Гнотобиотические нимфы, полученные с использованием этого подхода, могут быть инокулированы простыми или сложными микробными сообществами и использованы в качестве инструмента в исследованиях кишечного микробиома.

Резервуары для запасов настроены так, как показано на рисунке 1. «Беременные» самки идентифицируются по оотеке, прикрепленной к заднему брюшку, как показано на рисунке 2. Инкубация оотека на агаре BHI позволяет контролировать качество гнотобиотиков неразрушающим образом. В некоторых случаях стерилизация оказывается неудачной, и рост появляется вокруг оотеков, как показано на рисунке 3B. Эти оотеки должны быть удалены и выброшены. В наших руках наблюдался 10% средний процент отказов для стерилизации (n = 51). Оотеки вылупляются в среднем через 34 дня после стерилизации без роста на среде, как показано на рисунке 3А. Мы наблюдали типичную скорость вылупления 41% (n = 46) для стерилизованных, незагрязненных оотеков, в среднем 11 нимф на оотеку. Более крупные нимфы переносятся в колбы BHI, покрытые фольгой, как показано на рисунке 4. Фольга предотвращает загрязнение, и нимфам есть место для роста. RFLP 16S рДНК от гомогенизированной нимфы используется для подтверждения гнотобиотического статуса. Было замечено, что гнотобиотические нимфы растут более медленными темпами, чем их нестерильные коллеги, как показано на рисунке 5. На рисунке 6 показаны результаты успешно гнотобиотических насекомых, а также стандартных (нестерильных) нимф.
Хотя этот тест еще не выявил загрязнения в отсутствие положительного результата культивирования, этот шаг регулярно проводился во время критических экспериментов, чтобы исключить присутствие загрязняющих кислород чувствительных или привередливых микробов. Более медленный рост наблюдался у гнотобиотических тараканов по сравнению со стандартными / нестерильными насекомыми.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61316/61316fig01.jpg"> Рисунок 1: Настройка культуры стай тараканов. Картонные трубки можно увидеть сложенными в дальнем конце резервуара. Еда и вода находятся рядом с передней частью резервуара. Крышка из хлопчатобумажной ткани и резинка были сняты для видимости. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61316/61316fig01large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61316/61316fig02.jpg"> Рисунок 2: «Беременный» американский таракан. Стрелка указывает на оотеку. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61316/61316fig02large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61316/61316fig3v2.jpg"> Рисунок 3: Изображения успешно гнотобиотических нимф, вылупившихся и неудачно стерилизовавших оотеки на наклонах BHI. Oothecae стерилизовали и инкубировали, как описано в этом протоколе. (A)Отсутствие микробного роста на наклоне BHI указывает на то, что насекомые свободны от культивируемых организмов. (B) Oothecae на наклонах, которые приводят к образованию колоний, должны быть выброшены как загрязненные. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61316/61316fig03large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61316/61316fig04.jpg"> Рисунок 4: Гнотобиотический аппарат для выращивания. Насекомых держат в стерильных колбах, покрытых фольгированной крышкой для предотвращения загрязнения. Вторичный контейнер (зеленая крышка) стерилизуется 2% отбеливателем, а затем 70% этанолом. Поток воздуха во вторичном контейнере не ограничен. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61316/61316fig04large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61316/61316fig5v2.jpg"> Рисунок 5: Репрезентативные данные о темпах роста, сравнивающие длину тела гнотобиотических и нестерильных нимф. Обе группы насекомых питались диетой автоклавных грызунов. Гнотобиотические насекомые (здесь: n = 105) содержатся на BHI, как описано. Нестерильные насекомые (здесь: n = 50) живут в колбах с автоклавной подстилкой из щепы с небольшими посудами для воды. Нестерильные нимфы растут со средней скоростью 0,059 мм / день, в то время как гнотобиотические нимфы растут со скоростью 0,028 мм / день (p < 0,0001). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61316/61316fig5v2large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61316/61316fig05.jpg"> Рисунок 6: Репрезентативное гелевое изображение результатов RFLP для контроля качества. Ампликоны гена Whole-16S переваривались с помощью RsaI. ДНК для ПЦР была извлечена из нимф, гомогенизированных в 1x PBS. Полосы «G nymph» соответствуют гнотобиотическим нимфам, в то время как полосы «conv nymph» соответствуют обычным, нестерильным аналогам. Основываясь на виртуальном рестриктующем дайджесте, эндозимбионт(Blattabacterium),как ожидается, будет иметь полосы размерами 402 bp, 206 bp и 163 bp, с мазком полос между 163 bp и 148 bp. Гнотобиотическое насекомое должно показывать только полосчатый рисунок Blattabacterium. Ожидается, что смешанное бактериальное сообщество будет иметь мазок из полос с различными размерами, помеченных здесь как «другие бактериальные фрагменты 16S». <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61316/61316fig05large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Establishment and Maintenance of Gnotobiotic American Cockroaches Periplaneta americana at JoVE.com

Establishment and Maintenance of Gnotobiotic American Cockroaches Periplaneta americana

Этот протокол используется при установлении и поддержании гнотобиотических американских тараканов(Periplaneta americana)путем поверхностной стерилизации яиц (oothecae) до вылупления. Эти гнотобиотические насекомые содержат вертикально передаваемые Blattabacterium endosymbionts, но имеют аксеновые кишки.

Создание и содержание гнотобиотических американских тараканов (Periplaneta americana)

Gnotobiotic animals are a powerful tool for the study of controls on microbiome structure and function. Presented here is a protocol for the establishment ...

Протокол генерации гнотобиотических тараканов облегчает тестирование влияния удаления и замены нативного кишечного микробного сообщества на здоровье хозяина и сборку микробиома. Этот метод использует методы из нескольких источников для формирования сплоченного, оптимизированного рабочего процесса для генерации гнотобиотических тараканов без использования дорогостоящего специализированного лабораторного оборудования. Учитывая множество различных движущихся частей этого гнотобиотического протокола, визуализация помогает исследователям легче создавать свои собственные небольшие, недорогие, настольные гнотобиотические установки.Чтобы облегчить сбор соответствующего количества самок, несущих оотеки для запланированных экспериментов, используйте щипцы для перемещения картонных трубок, содержащих гравидных самок, в резервуаре для запасов. Если картонная трубка содержит несколько насекомых в дополнение к самке гравида, встряхните содержимое трубки в дополнительный пластиковый контейнер, окольцованный вазелином, и предложите целевому насекомому забраться обратно в картонную трубку в одиночку. После сбора перенесите каждую гравидную самку в родильное отделение.Как только самки сбросят свои оотеки, верните самок в резервуар для запаса и используйте щипцы, чтобы извлечь оотеки из помета. Чтобы очистить оотеки, поместите до пяти ящиков для яиц в пятимиллилитровую центрифужную трубку, содержащую три миллилитра додецилсульфата натрия, и вихрь оотеки в течение 10 секунд. После второй стирки, как только что было продемонстрировано, используйте деликатную салфетку, чтобы аккуратно очистить поверхность каждой оотеки, чтобы удалить любой мусор и поместить очищенную оотеку в весовую лодку.Перед стерилизацией заполните две 1,5-миллилитровые центрифужные трубки на оотеку одним миллилитром стерильной воды на трубку. Также добавьте 10 микролитров 32%-го раствора перуксусной кислоты к 3,2 миллилитрам двойной дистиллированной воды в пятимиллилитровой центрифужной трубке в вытяжном вытяжке. Колпачок и инвертирование несколько раз перемешать и поместить до пяти очищенных оотек в свежеприготовленный 0,1% раствор перуксусной кислоты в течение пяти минут, переворачивая трубку несколько раз каждые 60 секунд.Перуксусная кислота является сильным окислителем для глаз, кожи и дыхательных путей, а также легковоспламеняющимся и коррозионным. Всегда носите надлежащие СИЗ во время обработки и утилизируйте ваши отходы соответствующим образом. В конце инкубации используйте стерильные щипцы и ламинарной проточной вытяжке, чтобы перенести каждую оотеку в собственную центрифужную трубку со стерильной промывной водой.Перевернуть несколько раз, чтобы перемешать перед переносом оотеков во второй набор трубок промывной воды. После второго полоскать используйте стерильные щипцы для переноса оотеков на отдельные наклоны BHI. Поместите сланцевые носы в стерилизованный вторичный контейнер и переместите контейнер в увлажненный инкубатор с 30 градусами Цельсия в течение четырех-пяти недель, пока он не вылупится.Регулярно проверяйте сланцы один-два раза в неделю на грибковый или бактериальный рост до четвертой недели, после чего сланцы должны проверяться ежедневно. Когда нимфы начнут вылупляться, используйте стерильные щипцы и ламинарной проточной капюшон, чтобы асептически перенести гранулу стерилизированного крысиного чау в подготовленную колбу BHI. В качестве проверки стерильности поместите колбу во вторичный контейнер в инкубатор с 30 градусами Цельсия на 24 часа, чтобы подтвердить отсутствие загрязняющего роста.Если колба осталась стерильной, вытряхните нимф из наклона, позволив им упасть в колбу в ламинарной вытяжке. Затем поливайте нимф 300 микролитрами стерильной воды один раз в неделю в ламинарной вытяжке. Когда фекалии нимф начнут покрывать средний пол, перенесите нимф в новую колбу BHI, содержащую стерилизованный крысиный чау, добавленный за 24 часа, как показано.Беременные самки могут быть идентифицированы по оотеке, прикрепленной к их задним брюшкам. Оотеки вылупляются в среднем через 34 дня после стерилизации. В случаях неудачной стерилизации рост может появиться вокруг оотеков во время инкубации, что ставит под угрозу гнотобиотический статус детенышей.Затем скорость роста нимфы можно отследить, измерив длину тела насекомого. Полиморфизм длины рестрикации фрагмента рибосомной ДНК 16S гомогенизированной нимфы может быть использован для подтверждения гнотобиотического статуса. Гнотобиотические тараканы могут быть привиты синтетическими или ксенобиотическими микробными сообществами.Хотя этот конкретный рабочий процесс является новым, предыдущие исследования с использованием гнотобиотических тараканов дали представление о сборке кишечного микробиома и микробной роли в формировании социального поведения, здоровья кишечника и иммунитета их насекомых-хозяев.

Research

JoVE Journal

Biology

Establishment and Maintenance of Gnotobiotic American Cockroaches (Periplaneta americana)

Blood Collection from the American Horseshoe Crab, Limulus Polyphemus

Забор крови из американского Подкова Краб, Limulus Полифема

The horseshoe crab has the best-characterized immune system of any long-lived invertebrate.  The study of immunity in horseshoe crabs has been facilitated ...

Culture and Maintenance of Human Embryonic Stem Cells  

Культура и поддержание человеческих эмбриональных стволовых клеток

Human embryonic stem (hES) cells must be monitored and cared for in order to maintain healthy, undifferentiated cultures. At minimum, the cultures must be ...

Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells

Выделение и первичной культуре клеток крысы Печеночная

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology ...

Maintenance of a Drosophila melanogaster Population Cage

Maintenance of a Drosophila melanogaster Population Cage

Поддержание<em&gt; Дрозофилы</em&gt; Население Кейдж

Large quantities of DNA, RNA, proteins and other cellular components are often required for biochemistry and molecular biology experiments. The short life ...

Establishment of an Extracellular Acidic pH Culture System

Создание внеклеточного кислой рН культуры системы

Conditions of the tumor microenvironment, such as hypoxia or nutrient starvation, play critical roles in cancer progression and malignancy. However, the ...

Practical Use of RNA Interference: Oral Delivery of Double-stranded RNA in Liposome Carriers for Cockroaches

Практического использования РНК-интерференции: устные доставка двуцепочечной РНК в липосомы перевозчиков для тараканов

RNA interference (RNAi) has been widely applied for uncovering the biological functions of numerous genes, and has been envisaged as a pest control tool ...

Establishment of a Clonal Culture of Unicellular Conjugating Algae

Создание клоновых культуры одноклеточные водоросли спрягать

It is essential to establish clonal cultures of microalgae for use in studies of various topics, such as physiology, genetics, taxonomy, and microbiology. ...

Anaerobic Growth and Maintenance of Mammalian Cell Lines

Анаэробные роста и поддержания линий клеток млекопитающих

Most mucosal surfaces along with the midpoints in tumors and stem cell niches are geographic areas of the body that are anoxic. Previous studies show that ...

Isolation and Characterization of Adult Cardiac Fibroblasts and Myofibroblasts

Изоляция и характеристика взрослых сердечных фибробластов и миофибробластов

Cardiac fibrosis in response to injury is a physiological response to wound healing. Efforts have been made to study and target fibroblast subtypes that ...